Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Характеризуя Многомасштабное механических свойств ткани головного мозга Использование атомно-силовой микроскопии, наезд отступы и Реологии

doi: 10.3791/54201 Published: September 6, 2016

Abstract

Для разработки и инженер материалов, вдохновленные свойствами мозга, будь то для механических имитаторов или для исследований регенерации ткани, сама ткань мозга должны быть хорошо охарактеризованы на различных масштабов длины и времени. Как и многие другие биологические ткани, ткани головного мозга обнаруживает сложную, иерархическую структуру. Тем не менее, в отличие от большинства других тканей, мозг очень низкой механической жесткости, с упругих модулей Юнга Е порядка 100е Па. Такая низкая жесткость может создавать проблемы для экспериментальной характеристике основных механических свойств. Здесь мы покажем несколько механических методов определения характеристик, которые были приспособлены для измерения упругих и вязкоупругих свойств гидратированных, совместимых биологических материалов, таких как ткани мозга, в различных масштабах длины и скоростей нагружения. На микроуровне, мы проводим ползучести соблюдения и релаксации силы эксперименты с использованием атомно-силового микроскопа с поддержкой отступа. На MesosКейл, мы проводим эксперименты с использованием отступов воздействия маятник на основе Instrumented индентора. На макроуровне, мы проводим параллельные пластины Реологии для количественной оценки частоты зависит от модуля упругости при сдвиге. Мы также обсуждаем проблемы и ограничения, связанные с каждым методом. Вместе эти методы позволяют углубленное механическую характеристику ткани головного мозга, которые можно использовать, чтобы лучше понять структуру мозга и инженеру био вдохновленный материалов.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Большинство мягких тканей-содержащие биологические органы механически и структурно сложный, низкой жесткости по сравнению с минерализованной костью или спроектированных материалов, а также обладают нелинейную и зависящих от времени деформации. По сравнению с другими тканями в организме, ткани мозга удивительно соответствует, с модулей упругости Е порядка 100е Па 1. Мозговая ткань проявляет структурную гетерогенность с отчетливым и гребенчатой ​​серого и белого вещества областей, которые также отличаются функционально. Понимание механики ткани мозга поможет в разработке материалов и расчетных моделей для имитации реакции головного мозга при травме, облегчить прогнозирование механических повреждений, а также включить инженерных защитных стратегий. Кроме того, такая информация может быть использована, чтобы рассмотреть проектные цели для регенерации ткани, и, чтобы лучше понять структурные изменения в ткани головного мозга, которые связаны с такими заболеваниями, как рассеянный склероз и аутизм. ЧАСERE, мы описываем и продемонстрировать несколько экспериментальных подходов, которые доступны для характеристики вязкоупругих свойств механически совместимых тканей, включая ткани головного мозга, на микро-, мезо- и макро-масштабах.

На микроуровне, мы провели ползучести соблюдения и заставить экспериментов релаксации с помощью атомно-силового микроскопа (АСМ) -Enabled отступа. Как правило, АФМ с поддержкой отступы используются для оценки модуля упругости (или мгновенной жесткости) образца 2-4. Тем не менее, тот же самый инструмент также может быть использован для измерения Microscale вискоэластик ( по времени или скорости-зависимых) свойств 5-10. Принцип этих экспериментов, показанных на рисунке 1, является отступа асМ консольно зонд в ткани головного мозга, поддерживать заданную величину силы или глубины вдавливания, и измерить соответствующие изменения в глубину вдавливания и силы, соответственно, в течение долгого времени. Используя эти данные, мы можем вычислить ползучести компliance J C и модуль релаксации G R соответственно.

В мезомасштабе, мы провели эксперименты отступов воздействия в жидкости, погруженные в условиях, которые поддерживают структуру тканей и уровня гидратации, используя маятник на основе Instrumented наноиндентора. Экспериментальная установка показана на рисунке 2. По мере того как маятник качается в контакт с тканью, зонд смещения записывается как функция времени , пока качающийся маятник не приходит в состояние покоя в ткани. Из полученной затухающей гармоники колебательного движения зонда, можно рассчитать максимальную глубину проникновения х Макс, рассеивание энергии мощности К, а добротность Q (рассеивание , которая относится к скорости диссипации энергии) ткани 11,12.

На макроуровне, мы использовали параллельную пластину реометра для количественной оценки частоты зависит от модуля упругости при сдвиге,называется модуль накопления G 'и модуль потерь G ", ткани. В этом типе реометрии, применим гармоническую угловую деформацию (и соответствующие деформации сдвига) при известных амплитуд и частот и измеряют Реагирующей крутящего момента (и соответствующее напряжение сдвига) , как показано на рисунке 3. из полученной амплитуды и фазы запаздывания измеренного крутящего момента и геометрических переменных системы, мы можем вычислить G 'и G "на прикладной интерес частотах 13,14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Заявление по этике: Все экспериментальные протоколы были одобрены Научно-исследовательского комитета Животный Бостонской детской больницы и выполнять Национальных институтов здравоохранения Руководство по уходу и использованию лабораторных животных.

1. мозга мыши Процедуры ткани Приобретение (для АФМ с поддержкой отступов и ударного вдавливания)

  1. Подготовить кетамин / ксилазин смесь обезболить мышей. Смешайте 5 мл кетамина (500 мг / мл), 1 мл ксилазина (20 мг / мл) и 7 мл 0,9% физиологического раствора.
  2. Вводят мыши (Порода: TSC1 син-Cre; PLP-EGFP; Возраст: p21; Пол: мужчина или женщина) с 7 мкл на грамм веса тела раствора кетамина / ксилазина.
  3. После того, как мышь полностью под наркозом, о чем свидетельствует отсутствие реакции на носок и хвост пинчах, эвтаназии мышь обезглавливание с помощью больших рассечение ножницами.
  4. Снимите череп вырубку середины используя меньшие рассечение ножницами. Начиная с мозжечком, бэрOve куски черепа с использованием изогнутых щипцов. После удаления черепа, извлечь мозг с помощью плоского шпателя, чтобы поднять мозг, начиная с мозжечком, и поместить мозг на чашку Петри. Удалите мозжечок из головного мозга с помощью лезвия бритвы.
  5. При использовании весь мозг для воздействия отступа испытаний на свежей ткани, передача мозга в круглым дном трубки с CO 2 -независимый питательной средой для взрослых нервной ткани на льду и перейдите к разделу 4. В противном случае перейдите к шагу 1.6 для нарезки процедур.
  6. Настройка параметров vibratome до скорости 0,7 мм / с, с частотой колебаний 70 Гц, а толщина среза 350 мкм. Окружите vibratome блюдо со льдом. Поместите каплю суперклея на vibratome пластине и смонтировать мозг таким образом, что корональные срезы могут быть сокращены, с мозгом ориентированы на прорезать спинной стороне в первую очередь.
  7. Заполните vibratome блюдо с фосфатным буферным солевым раствором Дульбекко достаточное количество (DPBS), чтобы просто погрузить мозг. подниматьблюдо на vibratome так, чтобы лезвие просто погружена в ДЗФР.
  8. Нажмите кнопку Старт, чтобы начать нарезка корональные срезы головного мозга толщиной 350 мкм.
  9. С помощью кисточки , чтобы избежать повреждения ткани, передать срезах мозга из vibratome DPBS ванны и в круглым дном трубки с CO 2 -независимый питательной средой для взрослых нервной ткани на льду и выполнять измерения на свежей ткани в течение 48 часов. Для начала AFM-эксперименты позволили отступов, перейдите к разделу 3.

2. Процедуры мозга свиньи ткани Приобретение (для реологии)

  1. Получить сагиттальной нарезанную половину мозга свиньи в течение ~ 1 ч жертвы от местного мясника. Поместите половину мозга в CO 2 -независимый питательной среды для взрослой нервной ткани, и хранить на льду.
  2. Используйте лезвие или скальпель , чтобы сделать толстый корональной срез мозга ~ 5 мм и хранить в СО 2 -независимый питательной среды для взрослой нервной ткани. Убедитесь в том, что срез Surfacе как можно более плоским. Используйте тщательные боковые движения с бритвой / скальпелем во время секционирования.
  3. Магазин тканей головного мозга свиньи в CO 2 -независимый питательной среды для взрослых нервной ткани на льду и выполнять измерения Реологии (раздел 5) на свежей ткани в течение 48 часов.

3. Атомно-силовой микроскоп с поддержкой Отступ

  1. Приготовьте 60 мм диаметра Петри (P60) блюда с мидиями происхождения биоадгезива в соответствии с инструкциями изготовителя.
    1. Готовят нейтрального буферного раствора, состоящего из 0,1 М раствором бикарбоната натрия в стерильной воде с оптимальным рН 8,0. Фильтр-стерилизовать (0,2 мкм), буфер бикарбоната натрия и хранят при температуре 4 ° С.
    2. В ламинарном потоке, перемешать раствор 6,25% мидий происхождения био-клей и 3,125% -ного раствора NaOH в буфере бикарбоната натрия.
    3. Пипетка 100 мкл био-клеевой раствор из 3.1.2 на 60 мм диаметра Петри (P60) блюдо и использование пипетки для распространения зольв круг социологическое загрязнение диаметром 3-5 см.
    4. Оставьте посуду P60 обнажение в капот ламинарного потока, и пусть решение сухой (~ 30 мин). Мыть посуду 1x с PBS и 2 раза стерильной водой. Пусть блюда сухой воздух в ламинарный и хранить в герметичном полиэтиленовом пакете при температуре 4 ° С в течение 1 месяца.
  2. Откалибруйте AFM и настройка образца мозга в атомно-силовой микроскопии.
    Примечание: Следуйте инструкциям калибровки AFM в соответствии с производителем.
    1. Осторожно загрузить зонд АСМ с номинальной жесткости пружины 0,03 Н / м, а мкм диаметром боросиликатного шарик в держатель зонда 20.
    2. Откалибруйте жесткость пружины и обратной оптической чувствительности рычага (InvOLS) кантилевера АСМ с использованием метода термического мелодия 15,16.
      Примечание: После того, как постоянная пружины для зонда АСМ вычисляется, он должен оставаться постоянным при повторном использовании. Тем не менее, консольные InvOLS должны быть откалиброван каждый раз, когда лазер перестроены с кантилевера. Кроме того, калибровкадолжны быть выполнены в отношении подложки несколько порядков жестче, чем консольных, таких как полистирол.
    3. Включите стадии монтажа нагревателя и заданной температуры до 37 ° С.
    4. Установите срез мозга на P60 блюд, приготовленных в разделе 3.1.
      1. Аккуратно влить толстый ломтик 350 мкм мозга, а также СО 2 -независимый среды из круглодонную колбу в P60 блюдо с покрытием мидий происхождения биоадгезива.
      2. По мягко наклоняя P60 блюдо, поместите кусочек мозга в центре тарелки. При необходимости, медленно пипеткой среду из ручного пипеткой, чтобы развернуть срез мозга, который сложенную поверх на себе или лучшем положении срез мозга в центр чашки.
      3. Осторожно удалите излишки средств массовой информации с использованием P1000 пипеттором (не используйте вакуум).
      4. Поместите крышку на P60 блюдо и пусть срез мозга придерживаться в течение 20 мин.
    5. Снимите головку AFM, поместите кусочек мозга, установленный в P60блюдо на сцене AFM, и добавить ~ 2 мл подогретого CO 2 -независимый среды.
    6. Осторожно добавить каплю СМИ на AFM зонд, чтобы защитить его от разрушения из-за поверхностного натяжения, когда он опускается в средствах массовой информации, окружающих срез мозга.
    7. Переставьте голову AFM на сцену, и начать опускание головы, пока он не погружен в среду.
    8. Использование ПЗС-камеры вид сверху, переставить лазер на кантилевер.
      Примечание: Выравнивание лазера на кантилевер будет слегка изменились из-за разницы показателей преломления воздуха и среды.
    9. Подождите 5 минут для кантилевер, чтобы приспособиться к погружении в теплую жидкость, а затем сбросить выравнивание зеркало для свободного отклонения 0 В.
    10. Выполнить тепловой спектр на зонде AFM в соответствии с инструкциями изготовителя 16. Используйте посадку первого термического пика повторно вычислить InvOLS АФМ зонда в средствах массовой информации.
    11. С помощью оптического микроскопа,перейти в стадию образца таким образом, что область мозга интерес ниже зонда AFM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: мозолистое появится темно, как более непрозрачной, чем окружающие серого вещества. Кора превосходит мозолистого тела.
    12. Сбросить выравнивание зеркало для свободного отклонения 0 В.
    13. О сумме и отклоняющую метр в программном обеспечении AFM, нажмите кнопку "Участвовать", чтобы задействовать голову AFM.
    14. Используя положения диска на головке AFM, опустите голову, пока контакт между кантилевера и образца не производится.
  3. (Необязательно) При необходимости измерения модуля упругости образца, как описано ранее 4,17,18.
  4. Провести эксперименты соответствия ползучести.
    1. Построить прикладную функцию силы в редакторе функции программного обеспечения. Силовая функция состоит из 0,1 сек рампе до заданного значения 5 нн и удерживайте ее в течение 20 секунд, после чего 1 сек сползать вниз к приложенной силе 0 нн.
      1. На Отступы Master PАнель, в соответствии с методом вдавливания, выберите "Load" для режима Indenter; "N" для блоков; и "Редактор Функция" для Indenter функции.
      2. В редакторе функции на отрезке Parms панели, создать прикладную сегмент силовой функции, которая начинается при 0 нн, заканчивается в 5 нн, со временем 0,1 сек. Нажмите кнопку "Вставить ->".
      3. Для следующего сегмента, установить время начала до 5 нн, конец 5 нн и время до 20 сек. Нажмите кнопку "Вставить ->".
      4. Для последнего сегмента, установить время начала до 5 нн, конец 0 нн и время до 1 сек. Нажмите кнопку "Draw" и закройте окно редактора функций.
    2. На вкладке сила мастера панели, установите флажок "индентора рампу после запуска" и установите прикладную функцию силы, чтобы вызвать после достижения точки запуска 0,1 В.
    3. Нажмите кнопку "Single Force" в нижней части вкладки сила мастера панели, которая будет инициировать сконструированную-прикладному силовую функцию на предмет соответствия ползучести.
    4. Послеединая сила вдавливания закончена, поднимите головку AFM так, что он находится вне контакта с образцом, а затем снова включите голову и повторно нулевым свободным прогибом.
    5. Переставьте этап выборки, чтобы найти новую область интереса, и опустить голову AFM, чтобы вступить в контакт. Примечание: Головка AFM должна быть втянута от поверхности образца, когда стадия образца перемещается. Несоблюдение этого правила может привести к повреждению деликатной AFM кантилевера.
    6. Повторите шаги 3.4.3-3.4.5, пока желаемое количество данных не были собраны.
  5. Провести эксперименты релаксации силы.
    1. Построить прикладную функцию отступа в редакторе функции программного обеспечения. Функция отступа состоит из 0,1 сек пандуса до заданной точки 3 мкм и удерживать ее в течение 20 секунд, после чего 1 сек сползать вниз на глубину вдавливания от 0 мкм.
      1. На Отступы Master Panel, в соответствии с методом вдавливания, выберите "Отступ" для режима Indenter; "М" для блоков; а также "; Функция Редактор "для Indenter функции.
      2. В редакторе функции на отрезке Parms панели, создать прикладную сегмент силовой функции, которая начинается при 0 мкм, заканчивается в 3 мкм, со временем 0,1 сек. Нажмите кнопку "Вставить ->".
      3. Для следующего сегмента, установить время начала до 3 мкм, конец до 3 мкм, а время до 20 сек. Нажмите кнопку "Вставить ->".
      4. Для последнего сегмента, установить время начала до 3 мкм, конец до 0 мкм, и время до 1 сек. Нажмите кнопку "Draw" и закройте окно редактора функций.
    2. На вкладке сила мастера панели, установите флажок "индентора рампу после запуска" и установите прикладную функцию силы, чтобы вызвать после достижения точки запуска 0,1 В.
    3. Нажмите кнопку "Single Force" в нижней части вкладки сила мастера панели, которая будет инициировать построенную-прикладной функции отступа для релаксации силы.
    4. После того, как единая сила вдавливания закончена, поднимите головку AFM так, чтобы онавне контакта с образцом, а затем повторно включите головку и повторно нулевом отклонении.
    5. Переставьте сцену, чтобы найти новую область интереса, и опустить голову, чтобы вступить в контакт.
    6. Повторите шаги 5.3-5.5, пока желаемое количество данных не было собрано.
  6. Заключить эксперименты и очистка.
    1. После завершения экспериментов, поднимите голову AFM и удалить его из образца.
    2. Используйте лабораторную ткань тщательно удалить лишнюю жидкость, не касаясь кантилевера.
    3. Тщательно очистить держатель кантилевера АСМ с использованием небольшого количества этанола. Не подвергать деликатные электронику на держателе кантилевера в этанол. Удалите кантилевера AFM и место в контейнере для хранения.
    4. Утилизацию образца ткани мозга, следуя соответствующим протоколам биологической безопасности.
  7. Использование MATLAB, вычислить соответствие ползучести и релаксации сила модулей с использованием геометрии индентора, в соответствии с решением, полученного Ли и Радока 1960 19.
    1. Расчет силы F и глубину вдавливания Уравнение 1 из данных о консольном положении г, д, отклонения и постоянной весной, К С

      Уравнение 1 а также Уравнение 1 ,
    2. Найдите точку контакта вдоль кривой вдавливания с использованием алгоритма , описанного в Lin и др. 20.
    3. Определить окно интерес для анализа данных. Окно интерес представляет область , где либо сила (для ползучести соответствия) или глубины вдавливания (для релаксации силы) поддерживается на уровне заданного значения (то есть, область 3 , как показано на рисунке 1C, D).
    4. Для экспериментов соответствия ползучести, рассчитать экспериментальное ползучести модуль соответствия, J С (Т), в ответ на шаг нагрузкип 1 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 54201 / 54201eq4.jpg "/>:
      Уравнение 1 ,
      где Н (т) является ступенчатой ​​функцией Хевисайда и R является радиус сферического зонда.
    5. Для экспериментов релаксации силы, вычислить экспериментальный модуль релаксации силы, G R (T), в ответ на глубину вдавливания шаг Уравнение 1 :
      Уравнение 1 ,

4. Воздействие Отступ

  1. Откалибруйте инструментированный наноиндентора и настроить параметры по умолчанию, чтобы включить динамические эксперименты Воздействие на гидратированных тканях мозга в соответствии с инструкциями изготовителя.
    1. Установите сферический зонд, надев его на маятник с помощью пинцета.
    2. Клей конденсированного образца кварца на образец поста, который ввинчивается в поступательнойсцена.
    3. Перейдите в меню калибровки и выберите пункт "Liquid Cell". Следуйте инструкциям программного обеспечения, чтобы установить контакт с расплавленным образца кварца.
    4. Выберите "Normal" для индентора типа и использовать значение по умолчанию 0,05 мН для нагрузки Indenter. Нажмите кнопку "Продолжить", чтобы выполнить калибровку для нормальной конфигурации индентора.
    5. Переместить сцену образца назад, по меньшей мере, 5 мм. Установить рычаг, который позволяет зонду быть понижены в жидкую ячейку, и повторите калибровку жидкостной ячейки в новой конфигурации, выбрав "Liquid Cell" для типа Indenter. Нажмите кнопку "Продолжить", чтобы получить Liquid Cell Factor калибровки.
    6. Активируйте опцию Liquid Cell программного обеспечения, перейдя в меню эксперимента и выбрав пункт "Специальные опции." Используйте последнее значение калибровки.
    7. Увеличьте расстояние между пластиной конденсатора, так как это приведет к большей максимальной измеримой глубины, которая необходима при тестировании HIGHLY совместимые материалы.
      1. В меню System выберите "Non Защищенные Settings" и "Параметры машины" для изменения скорости тестового маятника нагрузки, нулевой скорости нагрузки и в режиме ожидания пандус смещение до 0,5 мН / сек, 0,1 мН / сек и 3 В, соответственно.
      2. С помощью гаечного ключа поверните три гайки, которые управляют обкладки Разнос по часовой стрелке с небольшим шагом.
      3. После каждого полного оборота по часовой стрелке, выберите "Мост окна настройки" в меню Maintenance и получить хороший тест маятник, который потребует перемещения веса противовеса от маятника.
      4. Повторите шаги 4.1.7.2-4.1.7.3, пока приблизительная калибровки глубины не считывает значение 70000 нм / В или выше.
    8. Установить новый ограничитель в нижней части маятника, который может быть включен и выключен с помощью источника питания. Отвод первоначальный ограничитель, сидя за маятник, чтобы удалить потенциальное препятствие движения маятника и позволяют болеескоростей удара, а также более высокие глубины проникновения в совместимых образцов.
    9. Разрешить шкаф для достижения теплового равновесия (занимает примерно 1 час).
    10. В то время как кабинет уравновешивает, вернитесь в системное меню и выберите "Non Защищенные Settings" и "Параметры машины". Установите ограничитель глубины скорость калибровки (DCAL) контакта до 1 мкм / сек, первичная скорость вдавливания контакта до 3 мкм / с, а скорость контактной нагрузки со сверхнизким до 1 мкм / сек.
    11. В меню калибровки, выполнить стандартную калибровку глубины в этой новой конфигурации.
    12. Включите источник питания для соленоида и установить его на 10 В. Перейдите в меню и выберите Эксперимент "воздействие" и "Adjust Impulse Смещения." Следуйте инструкциям программного обеспечения (автоматические подсказки) для калибровки качания расстояние маятника.
  2. Установите ткани мозга мыши в жидкой ячейке.
    1. После уборки весь мозг от СТЭр 1.5, хранить его сразу в CO 2 -независимый питательной средой для взрослых сред нервной ткани на льду.
    2. Когда установка влияние отступы полностью завершена, тщательно перенести мозг в чашку Петри вместе с СО 2 -независимый среды. Нарезать мозг в 6 мм толщиной секции с плоскими поверхностями с обеих сторон.
    3. Придерживайтесь нарезанную ткань к образцу поста алюминия с тонким слоем клея цианакриловым.
    4. Вставьте жидкую ячейку над вторым уплотнительным кольцом на образце пост, и заполнить жидкую клетку с 5 мл СО 2 -независимый среды , чтобы полностью погрузить ткань. Этот образец пост затем тщательно смонтированный на трансляционной стадии внутри инструментированного наноиндентора.
  3. Измерьте ответ воздействие мозговой ткани.
    1. При необходимости удалите сферический зонд и заменить его с зондом интереса, не снимая рычаг.
    2. В меню System выберите "Non ProtectedНастройки "и" Параметры машины. "Изменение основного контакта скорости удара до 5 мкм / сек.
    3. С помощью образца ванны низкой (-z направление) и далеко от маятника (+ х), двигаться в направлении -х, пока кончик на плечо рычага не будет правильно расположена над ванной. Перемещение в направлении + Z, пока наконечник полностью погружен в ванну и в передней части образца.
    4. Использование окна управления этапом пробы, контакт тщательно и затем обратно на сцену от поверхности образца приблизительно 30 мкм.
    5. В меню, нажмите на ссылку "Воздействие", чтобы настроить эксперимент воздействия. Выберите определенный импульс нагрузки, которая будет непосредственно относиться к полученной скорости удара на основе калибровки свинг расстояния. Запуск запланирован эксперимент.
    6. Когда маятник качается назад и поверхность образца продолжает двигаться к плоскости измерения, поверните нижний выключатель ограничения заезжать.
    7. Обратите внимание, как маятник качается ForwARD, чтобы воздействовать на образец. Смещение зонда в зависимости от времени, будет записан с помощью программного обеспечения.
    8. При появлении окна этап хуг, поверните выключатель стоп-лимит обратно.
    9. Повторите шаги 3.4-3.8, чтобы проверить, как много различных нагрузок и места в случае необходимости.
  4. Анализировать полученные смещения в зависимости от времени отклика маятника используя пользовательские сценарии MATLAB , чтобы определить максимальную глубину проникновения х макс, мощности диссипации энергии К, а рассеивание добротности. 11
    1. Перейдите в меню Analysis и экспортировать данные в текстовом файле.
    2. Возьмем производную по времени от профиля смещения, чтобы получить скорость, как функция времени. Установка смещения нуля в качестве точки контакта х o1.
      Примечание: Влияние скорости V в это максимальная скорость непосредственно перед контактом х макс соответствует деформации , при которой зонд.скорость сначала уменьшается до нуля. х о2, что эквивалентно х г, является положение необходимо возобновить контакт с деформированного образца в следующем цикле. Скорость отскока v вне есть скорость смещения х г.
    3. Определить K (безразмерный) , как энергия , выделяемая при образце , нормированную сумму выздоровевших и растрачивается энергий выборок в течение первого цикла воздействия. Вычислить K на основе собственных свойств маятника 21 (например, жесткость вращения и коэффициента затухания), х o1, х макс, х г, v в и v вне.
      Примечание: Для получения дополнительной информации можно обратиться к работе Kalcioglu и др., 2011.
    4. Так как смещение может быть описана как затухающего гармонического колебательного движения, подходят экспоненциальную функцию затухания для максимумов дисРазмещение по сравнению с кривой времени.
    5. Рассчитать Q (безразмерный) , как π , умноженное на количество циклов , требуемых для амплитуды колебаний для уменьшения с коэффициентом е. Более высокое значение Q означает более низкую скорость диссипации энергии.

5. Реология

  1. Установка и калибровки вискозиметра в соответствии с инструкциями изготовителя.
    1. Инициализировать реометра, открыв панель устройства / управления. На вкладке панели управления, нажмите кнопку "инициализировать".
    2. Установить измерительную пластину 25 мм диаметра (PP25) и тепловую систему.
    3. (Необязательно) Чтобы уменьшить проскальзывание между реометра пластинами и ткани, вырезать клейкие наждачная бумага кусочки, которые соответствуют форме верхней пластины реометра и приклеить наждачной бумаги верхней и нижней пластины.
    4. Сделать контакт между верхней и нижней пластиной, нажав кнопку "Установить нулевую пробел" на панели управления.
    5. Нулевой нормальный датчик силы со стороны клиCKING "сбросить нормальную силу."
    6. Провести тест инерции, открыв вкладку обслуживания на панели управления, нажав на кнопку "измерительной системы", а затем нажав кнопку "тест" инерционный. Запишите старый и новый инерцию. Убедитесь, что инерционность находится в пределах допустимого предела для зонда, как указано производителем.
  2. Образец нагрузки в реометра.
    1. После сбора ткани и разделки корональной сегмент мозга свиньи толщиной ~ 5 мм, хранить его на льду в CO 2 -независимый среды.
    2. Поместите мозг между двумя пластинами. Удалите большие капли воды из верхней и нижней поверхности образца, чтобы предотвратить проскальзывание, но не высыхают образца.
    3. Медленно опустить измерительную пластину до тех пор, пока пластина находится в полном контакте с верхней поверхностью ткани и измеренной нормальной силы соответствует 0,01 мН после периода релаксации 5-10 мин.
      1. В панели управления, введите последовательно более низкие высоты яп положение окно измерения и нажмите на кнопку "позицию измерения" медленно опустить измерительную пластину.
      2. Когда в пределах миллиметра контакта с тканью, опустить измерительную пластину с шагом 0,1 мм до тех пор, пока пластина полностью в контакте с верхней поверхностью ткани. Убедитесь в том, что измеряемая-нормальная сила последовательно на 0,01 мН после периода релаксации 5-10 мин.
      3. Запишите начальное измеренное нормальное усилие. Повторные измерения должны быть проведены при одинаковых сжимающих напряжений / деформаций.
    4. Обрежьте образец с пластмассовым лезвием, если образец превышает диаметр пластины. Пипетировать небольшой объем (~ 1-2 мл) носителя по краям образца для увлажнения ткани.
    5. (Необязательно) Опустите тепловой кожух. На панели управления, установите температуру до 37 ° C и нажмите кнопку "установить".
  3. Выполните амплитуду развертки , чтобы установить линейный диапазон вязкоупругого материала (т.е. сдвигштаммы , в которых G 'и G' 'являются постоянными) на частотах , представляющих интерес (например, 1 рад / сек).
    1. Выберите "Файл / Новый". На вкладке гель выберите "Amplitude развертки: LVE-диапазон." Выберите окно и нажмите кнопку "Измерение 1: Amplitude зачистку". Двойной щелчок на поле колебаний. Введите начальное и конечное напряжение (например, от 0,01 до 105), частота (например, 1 рад / с) , и число точек на декаду (например, 6 баллов / разл). Выберите "OK" и нажмите кнопку Пуск ".
    2. Повторите эту процедуру для нескольких срезов при повторных испытаниях, чтобы обеспечить согласованность линейного упругого диапазона. Осевое сжатие образца должно оставаться постоянным между образцами.
  4. Проведение частотной развертки ткани при деформации в линейном диапазоне вязкоупругих ткани (например, 1% деформации) 22, а также в частотном диапазоне интерес (например, 0,1-100 радиан / сек).
    1. Нажмите "Файл / Новый" и на вкладке гель выберите пункт "Частота развертки." Нажмите окно / Измерение 1: Частота развертки. Двойной щелчок на поле колебаний. Введите диапазон частот (например, от 0,1 до 100 рад / сек), напряжение (например, 1% деформации) и количество баллов за десятилетие (например, 6 очков / DEC). Выберите "OK" и нажмите кнопку "Пуск", чтобы начать зачистку частоты.
  5. Повторите частоты развертки (шаг 5.4) в двух экземплярах или трех экземплярах.
  6. Просмотрите данные, которые автоматически подсчитываются и экспортированных реометра: G 'и G "в зависимости от частоты (частота развертки) или деформации сдвига (амплитуда развертки) . Примечание: G' и G '' вычисляются из образца (максимум ) амплитуда Реагирующая крутящий момент Т '0, а угол поворота смещения (или угол отклонения) Уравнение 1 И фазовая задержкаУравнение 1 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 54201 / 54201eq9.jpg "/>, реакции образца приложенному колебательный деформации (рисунок 3):
    Уравнение 1
    Уравнение 1
    где R и H радиус и высота образца.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

На рисунке 4 показана репрезентативную отступы и силу в зависимости от времени реакций (рис 4B, E) на предмет соответствия ползучести и силы экспериментов релаксации, учитывая приложенная сила или глубина вдавливания (рис 4A, D), соответственно. Используя эти данные и геометрию системы, соответствие ползучести J с (т) и силы релаксации модулей G R (T) может быть рассчитана для различных областей мозга (рис 4C, F). В то время как предыдущие исследования показали разницу между модулями упругости различных областей мозга 23, вязкоупругие свойства , измеренная таким образом , для срезов ткани мозга мыши не показывают межрегиональную изменчивость внутри среза данной ткани.

Влияние отступов измеряет механические свойства ткани при высоких скоростях в пространстве и времени ConcentraTed загрузки. Результаты этих экспериментов дают информацию о том, как ткань рассеивает энергию в ответ на травматическое повреждение или преднамеренного деформации, связанной с хирургическим вмешательством. Задемпфированная колебательное движение ударного вдавливания зонда (рис 2B) предоставляет информацию для расчета максимальной глубины проникновения х макс (рис 5A), рассеивание энергии мощности K (рис 5б) и скорость диссипации энергии Q (рис 5в) ткани. Глубина проникновения измеряет сопротивление деформации, которая сильно коррелирует с модулем упругости виде ткани: более жесткие ткани демонстрируют меньшие глубины проникновения для данной скорости удара и энергии удара. способность к рассеянию энергии является безразмерный показатель степени, в которой ткань рассеивает энергию удара во время первого цикла воздействия. меры добротность Диссипации сколько циклов происходит до колебаний от IMPACT значительно затухают - это относится непосредственно к скорости диссипации энергии, хотя это не выражается в единицах времени. Эти параметры ответа три удара могут быть определены количественно при различных скоростях удара, что обеспечивает средства для изучения скорости зависящих от свойств ткани.

На рисунке 6 показан макромасштабное G 'и G "для частот в диапазоне от 0,1 рад / с до 50 рад / с. Модуль накопления почти на порядок величины больше , чем модуля потерь на низких частотах. Тем не менее, соотношение между хранением и потеря модулей уменьшается с увеличением частоты. Это указывает на то, что упругие свойства доминируют поведение ткани головного мозга, так как модуль упругости описывает упругие свойства и модуль потерь описывает вязкие потери материала. При достаточно высокой частоте нагрузки, хранение и потеря модулей будет приравнивать, указывает точку, в которойматериал начинает течь (т.е. вязкие свойства доминируют поведение образца). Для случая мозговой ткани, измеренной, как показано в настоящем документе, физические ограничения аппаратуры не позволяют измерять свойства материала на более высоких частотах.

Рисунок 1
Рисунок 1. Иллюстрация АФМ с поддержкой соответствия ползучести и релаксации заставляют эксперименты. (A) АФМ с поддержкой вдавливания осуществляется с помощью гибкой кантилевер со сферическим шариком нано- до микромасштабной радиуса , прикрепленной к свободным концом. (B) Во время отступа, кантилевера измеряется с помощью лазера , отраженного от конца кантилевера и на фотодиод. (C) эксперименты релаксации силы проводят отступов кантилевера к постоянной прикладной глубины, в то время как сила распада с РезPECT времени измеряется. Меры (D) Creep соответствия изменение глубины вдавливания кантилевера с постоянной приложенной силы. (C) и (D) были разделены на пять регионов (зеленый текст): (1) подход АФМ зонда к поверхности образца, (2) Контакт с образцом и рамп до заданного значения отступа / силы, (3) поддержание заданного значения отступа / силы, (4) и замедления (5) втягивание АСМ зонда от поверхности образца. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Иллюстрация экспериментов отступов воздействия. (A) Схема воздействия отступа, иллюстрирующий возможность проведения экспериментов в полностью гидратированных условиях. (B) Repres entative профиль смещения датчика в зависимости от времени, собранной из среза мозга мыши и соответствующего профиля скорости. Ключ измеренное смещение и расчетные параметры скорости , используемые для количественной оценки рассеяния энергии указаны. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Иллюстрация параллельных экспериментов пластины реометра. (А) Схема параллельной пластины реометра эксперимента и определений , связанных с прикладной колебательный деформации сдвига. (B) , представитель применяется напряжение и в результате стресса , как функция времени. Хранение модуль сдвига G 'и модуль потерь при сдвиге G "вычисляются с помощью амплитуды деформации54201 / 54201eq12.jpg "/>, крутящий момент амплитуда Т '0, фазовая задержка Уравнение 1 , Зонд и радиус образца R, а высота образца ч. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Представитель данных с соблюдением ползучести и форсирование экспериментов релаксации. (А, В) Из исходных данных на рисунке 1, область интереса определяется для ползучести соответствия , как время , когда приложенная сила остается постоянной (А) , а глубина вдавливания измеряется (B). Врезке в (А) показывает данные из неудачного эксперимента , когда AFM пьезо не смогдля поддержания приложенной силы и вставка на (B) показывает соответствующий ответ отступа, который качественно подобен данным успешного эксперимента , показанного на (B). (C) При наличии данных от приложенной силы, измеренной отступов и знание геометрии зонда, соответствие ползучести J с (т) вычисляется. (D, E) В релаксации силы, глубина вдавливания проводится постоянная (D), в то время как сила , в зависимости от времени измеряется (Е). (F) Используя эти данные, модуль релаксации силы G R (T) может быть вычислена. Creep соблюдение и заставляют эксперименты релаксации могут проводиться на анатомически различных областях мозга, таких как мозолистого тела (красный) и коры головного мозга (синий). Данные в (C, F) среднее число измерений от N = 5 мышей. Пожалуйста , CLICK здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5. Представитель данные воздействия отступов экспериментов. Максимальная глубина проникновения х макс, мощность диссипации энергии K, и качество диссипации добротность ткани мозга мыши рассчитываются из профилей сырых смещений , полученных при различных скоростях удара. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение (n = 18 повторных измерений на каждую точку). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6. Типичные данные вискозиметре экспериментов. Хранение G 'иПотеря G '' модули из корональных ломтики свиных мозгов. Величина tanδ рассчитывается как отношение потерь к модулю накопления. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение (n = 4 повторных измерений на каждую точку). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Каждый метод в данной работе измеряет различные аспекты механических свойств ткани мозга в. Creep соблюдение и модулей релаксации напряжений являются мерой зависящих от времени механических свойств. Хранение и потери представляют собой модули скорости зависящие от механических свойств. Воздействие отступа также измеряет скорость высвобождения зависит механическими свойствами, но в контексте диссипации энергии. При характеристике ткани механические свойства, как AFM с поддержкой отступы и реологические свойства обычно используются методы. АФМ с поддержкой отступы особенно полезно , потому что в дополнение к обеспечению временных свойств зависит материальных, различные экспериментальные параметры могут быть использованы для измерения зависимых тканей и клеток модуля упругости 4 и даже частотные свойства 24, как было описано выше. Тем не менее, точной интерпретации данных и планирования экспериментов может быть сложной задачей для совместимых, гидратированных тканей. Хотя меры Реологии набухают надлежащегоУзы ткани, AFM с поддержкой отступы зондов Microscale объемы, имеющие отношение к микроокружения клеток. Воздействие отступы обеспечивает средство для количественной оценки конкретно, как материал деформируется в контексте концентрированной, динамической ударной нагрузки, которая полезна в приложениях, как изучение черепно-мозговой травмы, вызванные очаговой воздействием. В то время как результаты от каждого метода прямо не сопоставимы, диссипации энергии характеристики, измеренные с помощью ударного вдавливания следуют те же тенденции, что и потери модуля сдвига, измеренной с помощью реологических свойств, как описано ниже.

В АФМ с поддержкой вдавливания ткани мозга, показанного в настоящем документе, мы измерили вязкоупругих свойства, используя ползучести соответствия и силе релаксации. Из-за небольшого масштаба АСМ зонда, этот метод может измерять механические свойства анатомически различных областей головного мозга, таких как белые и серого вещества областях мозолистого тела и коры, соответственно (рис. 4

Мы обнаружили , что вязкоупругие свойства ткани мозга , измеренного таким образом качественно аналогична ранее сообщали результаты от Элькин & Morrison 26. В то время как величина измеренных значений для модуля релаксации не согласен, это, вероятно, из-за разницы в условиях эксперимента. Элькин & Morrison используют диаметр 250 мкм плоский удар, по сравнению с нашим диаметром 20 мкм сферы. Кроме того, Елкин & Morrison выполнять измерения на ткани головного мозга у крыс, в то время как мы проводили измерения на ткани головного мозга, полученные от мышей. Несмотря на эти различия, обе методики MEAsUred неоднородные механические свойства, указанные в ткани головного мозга, или, более конкретно, что белое вещество мозолистого обладает более низким модулем релаксации, чем серое вещество коры головного мозга в корональной плоскости.

Важно отметить, что в то время как мы рассчитали соответствие ползучести и силы релаксации модулей в ответ на запрошенный этапе нагрузки или шага отступа, соответственно, экспериментально приложенная нагрузка и отступы не являются идеальными (мгновенные) ступенчатые функции. Грузы и вмятины применяются более короткие временные рамки (<1 сек), и эти истории загрузки могут влиять на измеряемую ползучести и реакция релаксации 7,25. В частности, при условии, приложенном результаты отступов шаг в небольшое недооценки модуля релаксации, предполагая приложенном результаты шага нагрузки в небольшом завышенной оценке соответствия модуля ползучести. Расхождения между фактическими и расчетными модулями упругости будет уменьшаться по мере темпов разгона и торможенияприменяемых нагрузок и увеличения отступа.

Ключевым шагом в проведении релаксации нагрузки выбирает правильную величину поддерживаемой силы (т.е., заданное значение , соответствующее напряжению фотодиод , который относится непосредственно к приложенной силе). Заданное значение силы на предмет соответствия ползучести должны быть выбраны таким образом, чтобы: (1) реакция является достаточно большим, чтобы произвести легко измеримые изменения в глубину вдавливания; и (2) достаточно мал, что глубина вдавливания требуется для поддержания заданного значения силы не становится настолько большим, чтобы дрейфовать за пределы диапазона от пьезоэлектрического привода AFM, который модулирует вертикальное положение кантилевера основания AFM. В представленном протоколе, мы предложили уставки силу 5 нн, которая работала хорошо для нашей экспериментальной установки. Тем не менее, если АФМ пьезо не в состоянии поддерживать ту силу , из - за ограниченного диапазона движения (см. 4А, врезка), что значение может быть снижена. Этот экспериментальный вопрос не encountERed с экспериментами релаксации силы, которые поддерживают постоянную, рассчитанную глубину вдавливания через петлю обратной связи.

В отличие от квазистатического АФМ с поддержкой отступа в nanoNewton (нн) шкала силы и мкм масштаба глубины, влияние отступа применяется концентрированный динамическую нагрузку мН масштабных сил и мер реагирования деформации особи на глубинах, приближающихся к миллиметрового масштаба. Ранее мы использовали ударную отступа для количественного определения поведения сердца и печени , 9,11,12, и наблюдали аналогичную зависимость отклика энергии диссипации на скорости нагружения для тканей из этих органов.

Влияние отступов может вместить зонда радиусов в диапазоне от мкм до мм. Кроме того, эксперименты отступа воздействия могут быть проведены в полностью погруженных средах, что позволяет для механической характеристики гидратированных тканей 21. При тестировании высоко совместимые образцы, такие как ткани мозга, импortant соображения должны быть приняты во внимание. Во-первых, максимальная глубина измеримы в материал составляет примерно 1 мм, ограничение устанавливается длина шкалы самого инструмента; любое дальнейшее перемещение маятника будет физически прерывалась при столкновении между электромагнитной катушкой, расположенной в верхней части маятника и неподвижной магнитной пластины. Для мозговой ткани, это ограничивает самую высокую скорость в момент удара, который может быть успешно применен приблизительно 5 мм / сек. Следует отметить , что в то время как скорости ударной вязкости являются на заказ мм / с, соответствующие плотности энергии деформации являются порядка кДж / м 3, что приближается баллистические условия, из - за малых размеров радиуса зонда 11. Во-вторых, он может потенциально стать трудным для прибора для обнаружения контакта между зондом и поверхностью ткани. По мере того как стадия образца движется по направлению к зонду, контакт обнаруживается, когда маятник отодвигается образцом движущейся. Тем не менее, для сильно complianОбразцы T, маятник не может быть отклонен обнаруживаемой в то время как зонд проникает в образец.

Для решения этой проблемы, мы можем увеличить скорость, при которой стадия образца движется таким образом, что будет больший импульс во время контакта для привода маятник обратно. Выборка также должна быть как можно более плоскими, для дальнейшей минимизации ошибок при обнаружении надлежащей точки контакта. И, наконец, обратите внимание, что ударная нагрузка не является истинным импульсом нагрузки, в том, что электромагнитный ток в верхней части маятника продолжает поставлять движущую силу для проникновения после первого ударного события. В результате ползучести может происходить, особенно при более высоких условиях нагружения, что усложняет анализ характеристик диссипации энергии. Дальнейшая работа по этой методике может включать в себя развязку ответ ползучести от ответа воздействия, вводя контроль температуры для того, чтобы исследования при температуре тела, в том числе и визуализацию поверхности образца ткани через микроскопе совместим с жидкой клетки.

Реологии измеряет частоту зависимых механических свойств вязкоупругих тел на макромасштабном уровне. Компоненты модулей сдвига, хранения G 'и потерь G ", может быть измерена в частотных диапазонах , как правило , охватывает 0,001-0,1 рад / с до 10-100 рад / с, в зависимости от инструмента, геометрии зонда и образца 13. Для точного измерения , амплитуда развертки должна быть выполнена до частотной развертки для определения линейного упругого диапазона материала, это диапазон напряжения , для которых GG' 'остаются постоянными 14,27 деформации сдвига , выбранный для частоты. развертка должна быть как можно выше в пределах линейного предела вязкоупругого (обычно 1-2% деформации сдвига) таким образом, что достаточный крутящий момент достигается во время измерения. крутящий момент во время измерения всегда должны находиться в допустимых пределах, предоставленного производителем, чтобы обеспечить в качествеufficient соотношение сигнал-шум.

Кроме того, зонд , используемый реометрия должен быть настолько большим , насколько это возможно , чтобы максимизировать крутящий момент, но должен перекрывать с образцом полностью 13. При подготовке пробы, ткань должна быть нарезана как можно более плоской, чтобы свести к минимуму стресс градиенты, когда контакт между пластинами. Когда контакт сделан с образцом, ткань не должна иметь никаких капель воды на нем, чтобы минимизировать проскальзывание на этом интерфейсе. Тем не менее, ткань также не должны быть высушены до или во время измерения , так как это может привести к разрушению структуры ткани 13. Ткань должна быть полностью гидратированных со средствами массовой информации после контакта между двумя пластинами. Клей, водонепроницаемая наждачная бумага может быть также прикреплен к пластинам , чтобы свести к минимуму скольжение 28. Кроме того, осевое сжатие было показано , чтобы изменить величину G 'мозговой ткани 29. Поскольку образцы реологии, как правило, тонкие (~ 5 мм), небольшие изменения высоты (~ 500мкм) может производить большие сжимающие напряжения (например, ~ 10%), и , следовательно , значительные изменения в модуль сдвига. Кроме того, как образец вязкоупругого, материал будет подвергаться релаксации напряжений из - за осевого сжатия 28, которые могут повлиять на точность замеров. Таким образом, повторные измерения следует проводить при подобных операционных осевых деформаций и образец должны иметь возможность отдохнуть (например, 5-10 минут) перед измерением. Ошибка, связанная с этими явлениями является ограничением техники. Другие ограничения включают реометрии предположение о том, что материал является однородным и изотропным, которая часто не соответствует действительности в образцах ткани 13. Кроме того, температура должна поддерживаться при физиологических условиях , как это повлияет на GG "22. В мозговой ткани в частности, повышение температуры было показано, уменьшают как G' и G '' скромно без изменения степенного закона BEHAВИОР с частотой, таким образом , следуя при температурно-принципала 22,30. Наши данные находятся в хорошем согласии с предыдущими исследованиями 22,27 в мозга свиньи, которые наблюдаются аналогичные величины GG' ', а также слабую частотную зависимость степенной как в G' и G ".

Рассчитанное соотношение tanδ = G "/ G '(рис. 6) обеспечивает одну основу сравнения между реометрии и ударного вдавливания. В среду отступа, мы обнаружили , что рассеивание энергии емкость ткани мозга увеличилась с повышенными уровнями загрузки. Использование Реологии, мы обнаружили , что поскольку увеличение частоты, tanδ также увеличилось. другими словами, материал был более диссипативной на более высоких частотах. Кроме того, в то время как измерения воздействия отступа не количественно модуль упругости непосредственно, глубины проникновения х макс уменьшение непосредственно с increasinг модуль упругости.

Вместе, методы, описанные в данной работе, позволяют механическую характеристику мозговой ткани на микро-, мезо- и макро- масштабах длины, а также при различных скоростях нагружения. Методы, представленные здесь, могут быть использованы в ряде совместимых материалов, включая как биологические ткани и спроектированный гидрогелей. С глубоким пониманием из разномасштабных вязкоупругих свойств ткани головного мозга, мы можем лучше дизайн материалы инженерии, чтобы имитировать механическую реакцию мозга. Эти ткани имитирующей материалы могут облегчить прогнозирование механических повреждений и инженерных защитных стратегий. Кроме того, свойства материала головного мозга могут быть использованы для создания биоинспирированных материалов в лабораторных условиях и в естественных условиях исследования , чтобы лучше понять рост и взаимодействие клеток в центральной нервной системе, в частности , в контексте неврологических заболеваний , таких как аутизм и рассеянный склероз.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylazine Lloyd Laboratoried perscription drug
Ketamine AnaSed Injections perscription drug
Vibratome (Vibrating blade microtome) Leica VT1200
Hibernate-A Medium Gibco A1247501 CO2-independent neural medium for adult tissue
Atomic Force Microscope, MFP-3D-BIO Asylum Research -
Petri Dish Heater Asylum Research -
AFM Probe, 0.03 N/m, 10 µm radius borosilicate sphere Novascan PT.GS
Cell-Tak Corning 354240 mussel-derived bioadhesive
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 alternate suppliers can be used
Sodium Hydroxide, 1 N Sigma-Aldrich 59223C alternate suppliers can be used
Instrumented Indenter, NanoTest Vantage Micro Materials Ltd. - probe tip needs to be machined (steel flat punch, 1 mm diameter, 4-5 mm length)
NanoTest Liquid Cell Micro Materials Ltd. -
Parallel Plate Rheometer MCR501 Anton-Parr -
PP25  Anton-Parr - 25 mm diameter flat measurement plate
Adhesive Sandpaper McMaster-Carr 4184A48 alternate suppliers can be used
Loctite 4013 Instant Adhesive Henkel 20268 alternate suppliers can be used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Dommelen, J. A. W., Hrapko, M., Peters, G. W. M. Mechanical Properties of Brain Tissue: Characterisation and Constitutive Modelling. Mechanosensitivity of the Nervous System. 249-281 (2009).
  2. Liu, F., Tschumperlin, D. J. Micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (54), e2911 (2011).
  3. Peaucelle, A. AFM-based mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments. (89), e51317 (2014).
  4. Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497 (2013).
  5. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. dM., Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components. Nanotechnology. 21, 445101 (2010).
  6. Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. Creep function of a single living cell. Biophysical Journal. 88, (3), 2224-2233 (2005).
  7. Lu, H., Wang, B., Ma, J., Huang, G., Viswanathan, H. Measurement of creep compliance of solid polymers by nanoindentation. Mechanics Time-Dependent Materials. 7, (3/4), 189-207 (2003).
  8. Cheng, L., Xia, X., Scriven, L. E., Gerberich, W. W. Spherical-tip indentation of viscoelastic material. Mechanics of Materials. 37, 213-226 (2005).
  9. Kalcioglu, Z., Qu, M., Van Vliet, Multiscale characterization of relaxation times of tissue surrogate gels and soft tissues. 7th Army Science Conference Proceedings. (2010).
  10. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. D., Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation microscopy: Imaging local stress in cells. Journal of Biomechanics. 43, (2), 349-354 (2010).
  11. Kalcioglu, Z. I., Qu, M., et al. Dynamic impact indentation of hydrated biological tissues and tissue surrogate gels. Philosophical Magazine. 91, (7-9), 1339-1355 (2011).
  12. Kalcioglu, Z. I., Ra Mrozek, R. a, Mahmoodian, R., VanLandingham, M. R., Lenhart, J. L., Van Vliet, K. J. Tunable mechanical behavior of synthetic organogels as biofidelic tissue simulants. Journal of Biomechanics. 46, (9), 1583-1591 (2013).
  13. Janmey, P. A., Georges, P. C., Hvidt, S. Basic rheology for biologists. Methods in Cell Biology. 83, 3-27 (2007).
  14. Miller, K., Kurtcuoglu, V. Biomechanics of the Brain. Springer Science & Business Media. (2011).
  15. Lévy, R., Maaloum, M. Measuring the spring constant of atomic force microscope cantilevers: thermal fluctuations and other methods. Nanotechnology. 13, (1), 33-37 (2002).
  16. Fuierer, R. Basic Operation Procedures for the Asylum Research MFP-3D Atomic Force Microscope. MFP-3D Procedureal Operation "Manualette". Asylum Research. (2006).
  17. Elkin, B. S., Ilankovan, A., Morrison, B. Age-dependent regional mechanical properties of the rat hippocampus and cortex. Journal of Biomechanical Engineering. 132, 011010 (2010).
  18. Elkin, B. S., Azeloglu, E. U., Costa, K. D., Morrison, B. Mechanical heterogeneity of the rat hippocampus measured by atomic force microscope indentation. Journal of Neurotrauma. 24, (5), 812-822 (2007).
  19. Lee, E. H., Radok, J. R. M. The Contact Problem for Visooelastic Bodies. Journal of Applied Mechanics. 27, (3), 438-444 (1960).
  20. Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129, (3), 430-440 (2007).
  21. Constantinides, G., Kalcioglu, Z. I., McFarland, M., Smith, J. F., Van Vliet, K. J. Probing mechanical properties of fully hydrated gels and biological tissues. Journal of Biomechanics. 41, (15), 3285-3289 (2008).
  22. Shen, F., Tay, T. E., et al. Modified Bilston Nonlinear Viscoelastic Model for Finite Element Head Injury Studies. Journal of Biomechanical Engineering -- Transactions of the ASME. 128, (5), 797-801 (2006).
  23. van Dommelen, J. aW., vander Sande, T. P. J., Hrapko, M., Peters, G. W. M. Mechanical properties of brain tissue by indentation: Interregional variation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 3, (2), 158-166 (2010).
  24. Rother, J., Nöding, H., Mey, I., Janshoff, A. Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines. Open biology. 4, (5), 140046 (2014).
  25. Du, P., Lu, H., Zhang, X. Measuring the Young's Relaxation Modulus of PDMS Using Stress Relaxation Nanoindentation. Symposium DD - Microelectromechanical Systems - Materials and Devices III. 1222, (c), (2009).
  26. Elkin, B. S., Morrison, B. Viscoelastic properties of the P17 and adult rat brain from indentation in the coronal plane. Journal of Biomechanical Engineering. 135, 114507 (2013).
  27. Brands, D. W., Bovendeerd, P. H., Peters, G. W., Wismans, J. S., Paas, M. H., van Bree, J. L. Comparison of the dynamic behavior of brain tissue and two model materials. 43rd Stapp Car Crash Conference Proceedings. 313-320 (1999).
  28. Hrapko, M., van Dommelen, J. A. W., Peters, G. W. M., Wismans, J. S. H. M. Characterisation of the mechanical behaviour of brain tissue in compression and shear. Biorheology. 45, (6), 663-676 (2008).
  29. Pogoda, K., Chin, L., et al. Compression stiffening of brain and its effect on mechanosensing by glioma cells. New Journal of Physics. 16, (7), 075002 (2014).
  30. Peters, G. W. M., Meulman, J. H., Sauren, A. A. H. J. The applicability of the time/temperature superposition principle to brain tissue. Biorheology. 34, (2), 127-138 (1997).
Характеризуя Многомасштабное механических свойств ткани головного мозга Использование атомно-силовой микроскопии, наезд отступы и Реологии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Canovic, E. P., Qing, B., Mijailovic, A. S., Jagielska, A., Whitfield, M. J., Kelly, E., Turner, D., Sahin, M., Van Vliet, K. J. Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry. J. Vis. Exp. (115), e54201, doi:10.3791/54201 (2016).More

Canovic, E. P., Qing, B., Mijailovic, A. S., Jagielska, A., Whitfield, M. J., Kelly, E., Turner, D., Sahin, M., Van Vliet, K. J. Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry. J. Vis. Exp. (115), e54201, doi:10.3791/54201 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter