Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Characterizing Multiscale Mekaniska egenskaper hos hjärnvävnad Använda atomkraftsmikroskopi, Impact indrag, och Rheometry

doi: 10.3791/54201 Published: September 6, 2016

Abstract

Att utforma och ingenjör material inspirerade av egenskaperna hos hjärnan, oavsett om mekaniska simulatorer eller vävnadsregenereringsstudier måste hjärnvävnaden i sig vara väl karakteriseras vid olika längd och tidsskalor. Liksom många biologiska vävnader, uppvisar hjärnvävnad en komplex, hierarkisk struktur. Men i motsats till de flesta andra vävnader, är hjärnan mycket låg mekanisk styvhet, med Youngs elasticitetsmodul E i storleksordningen 100-tals Pa. Den låga styvhet kan innebära utmaningar för experimentell karakterisering av viktiga mekaniska egenskaper. Här visar vi flera mekaniska karakteriseringstekniker som har anpassats för att mäta de elastiska och viskoelastiska egenskaperna hos hydratiserade, kompatibla biologiska material såsom hjärnvävnad, vid olika längdskalor och lastpriser. På mikro genomför vi krypvillkoren och kraft avkoppling experiment med användning av atomkraftsmikroskop-aktiverade indrag. Vid de mesoscale utför vi slag indrag experiment med hjälp av en pendel baserad instrumente indenter. På makroskala, vi genomför parallella platt rheometry att kvantifiera frekvensberoende skjuvning elasticitetsmoduler. Vi diskuterar också de utmaningar och begränsningar som är förknippade med varje metod. Tillsammans utgör dessa tekniker möjliggör en fördjupad mekanisk karakterisering av hjärnvävnad som kan användas för att bättre förstå strukturen av hjärnan och att konstruera bioinspirerade material.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De flesta mjuka vävnader, innefattande biologiska organ är mekaniskt och strukturellt komplex, som saknar styvhet jämfört med mineraliserat ben eller framtagna material, och uppvisar icke-linjär och tidsberoende deformation. Jämfört med andra vävnader i kroppen, är hjärnvävnad anmärkningsvärt kompatibel med elastisk moduler E i storleksordningen 100-tals Pa 1. Hjärnvävnad uppvisar strukturell heterogenitet med tydlig och sammanflätade grå och vita substansen regioner som också skiljer sig funktionellt. Förståelse hjärnvävnadsmekaniken kommer att hjälpa i utformningen av material och beräkningsmodeller för att efterlikna responsen hos hjärnan under skada, underlätta förutsägelse av mekaniska skador, och möjliggör ingenjörs av skyddande strategier. Dessutom kan sådan information användas för att överväga mål konstruktion för vävnadsregenerering, och för att bättre förstå strukturella förändringar i hjärnvävnaden som är förknippade med sjukdomar som multipel skleros och autism. Here vi beskriver och demonstrerar flera experimentella metoder som finns tillgängliga för att karakterisera de viskoelastiska egenskaperna hos mekaniskt kompatibla vävnader inklusive hjärnvävnad, på mikro-, meso- och makroskalor.

På mikrogenomförde vi kryp följs och tvinga avkoppling experiment med hjälp av atomkraftsmikroskop (AFM) -aktiverade indrag. Typiskt är att AFM-aktiverade indrag används för att uppskatta elasticitetsmodul (eller momentana styvhet) hos ett prov 2-4. Däremot kan samma instrument även användas för att mäta mikro viskoelastiska (tids- eller hastighetsberoende) egenskaper 5-10. Principen för dessa experiment, som visas i figur 1, är att dra in en AFM fribärande sond i hjärnvävnaden, upprätthålla en viss storlek av våld eller indrag djup, och mäta motsvarande förändringar i indrag djup och kraft, respektive, över tiden. Med hjälp av dessa data kan vi beräkna kryp compliance J C och avkoppling modul G R, respektive.

Vid mesoskaliga genomförde vi slag indrag experiment vätske nedsänkta betingelser som upprätthåller vävnadsstruktur och vätskenivåer, med hjälp av en pendel baserad instrumente nanoindenter. Den experimentuppställning visas i fig 2. Som pendeln svänger i kontakt med vävnaden, sond förskjutning registreras som en funktion av tiden tills den oscillerande pendeln kommer till vila i vävnaden. Från den resulterande dämpade harmoniska oscillationsrörelse av sonden, kan vi beräkna den maximala penetrationsdjupet x max, energiupptagning kapacitet K, och förlustkvalitetsfaktorn Q (som hänför sig till hastigheten för energiavledning) av vävnaden 11,12.

Vid makroskala, använde vi en parallell platt reometer för att kvantifiera den frekvensberoende skjuvning elasticitetsmoduler,benämnd lagringsmodulen G 'och förlustmodul G ", av vävnaden. I denna typ av reometri tillämpar vi en övertonsvinkel stam (och motsvarande skjuvspänning) vid kända amplituder och frekvenser och mäta reactional vridmoment (och motsvarande skjuvspänning) , såsom visas i figur 3. från den resulterande amplituden och fasförskjutningen hos det uppmätta vridmomentet och geometriska variabler hos systemet, kan vi beräkna G 'och G "vid pålagda frekvenser av intresse 13,14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Etik uttalande: Alla experimentella protokoll godkändes av kommittén Animal Research of Boston Barnsjukhus och överensstämmer med National Institutes of Health Guide för skötsel och användning av försöksdjur.

1. mushjärna Tissue Förvärvsförfaranden (för AFM-aktiverade indrag och inverkan indrag)

  1. Förbered en ketamin / xylazin blandning att söva möss. Kombinera 5 ml ketamin (500 mg / ml), 1 ml xylazin (20 mg / ml) och 7 ml 0,9% saltlösning.
  2. Injicera musen (Ras: TSC1; Syn-Cre, PLP-EGFP, Ålder: p21, Kön: Man eller Kvinna) med 7 pl per gram kroppsvikt av ketamin / xylazin lösning.
  3. När musen är helt bedövad, vilket framgår av en bristande respons på tå och svans klämmer, avliva musen genom halshuggning använda stora dissektion sax.
  4. Ta skallen genom att skära ner i mitten med hjälp av mindre dissektion sax. Börjar på lillhjärnan, remove bitar av skallen med böjda pincett. Efter avlägsnande av skalle, extrahera hjärnan genom användning av en platt spatel för att lyfta hjärnan, med början vid cerebellum, och placera hjärnan i en petriskål. Ta bort lillhjärnan från hjärnan med användning av ett rakblad.
  5. Om du använder en hel hjärna för inverkan indrag tester på färsk vävnad, överföring hjärna i en rundbottnad rör med CO 2-oberoende näringsmedium för vuxna nervvävnad på is och gå vidare till avsnitt 4. I annat fall vidare till steg 1,6 för skivning förfaranden.
  6. Justera vibratome inställningarna till en hastighet av 0,7 mm / sek, en vibrationsfrekvens på 70 Hz och en skivtjocklek av 350 pm. Omger vibratome skålen med is. Placera en klick superlim på vibratome plattan och montera hjärnan så att koronalt skivor kan skäras med hjärnan orienterad att skära igenom ryggsidan först.
  7. Fyll vibratome skålen med tillräckligt Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) att bara dränka hjärnan. Höjaskålen på vibratome så att bladet är bara nedsänkt i DPBS.
  8. Tryck på start för att börja skära koronalt hjärnan sektioner 350 pm tjockt.
  9. Använda penslar för att undvika skador på vävnaden, överföra hjärnan skivor från vibratome DPBS badet och in i en rundbottnad rör med CO 2-oberoende näringsmedium för vuxna nervvävnad på is och utföra mätningar på färsk vävnad inom 48 h. Till att börja AFM-aktiverade indrag experiment, gå vidare till avsnitt 3.

2. Pig Hjärnvävnad Förvärvsförfaranden (för reologi)

  1. Skaffa en sagittally skivad svin halv hjärna inom ~ 1 tim offer från en lokal slaktare. Placera halv hjärna i CO 2-oberoende näringsmedium för vuxna nervvävnad, och förvara på is.
  2. Använd ett rakblad eller skalpell för att göra en ~ 5 mm tjock koronalt hjärnan skiva och lagra i CO2-oberoende näringsmedium för vuxna nervvävnad. Se till att skivan surface är så platt som möjligt. Använd noggranna sidorörelser med rakkniv / skalpell under snittning.
  3. Store grishjärnvävnad i CO 2-oberoende näringsmedium för vuxna nervvävnad på is och utföra rheometry mätningar (avsnitt 5) på färsk vävnad inom 48 h.

3. atomkraftsmikroskop-aktiverade indrag

  1. Förbered 60 mm diameter Petri (P60) rätter med en mussla som härrör biohäftande enligt tillverkarens anvisningar.
    1. Förbereda ett lager av neutral buffertlösning bestående av 0,1 M natriumbikarbonat i sterilt vatten med en optimal pH-värde av 8,0. Filter-sterilisera (0,2 mikron) natriumvätekarbonatbuffert och förvara vid 4 ° C.
    2. I ett laminärt flöde huva, blanda en lösning av 6,25% mussla härrörande bio-lim och 3,125% NaOH i natriumbikarbonatbuffert.
    3. Pipett 100 pl av bio-klisterlösning från 3.1.2 till en 60 mm diameter Petri (P60) skålen och använda pipettspetsen för att sprida solution in i en cirkeldiameter 3-5 cm.
    4. Lämna P60 rätter utan lock i laminärt flöde huva och låt lösningen torka (~ 30 min). Diska 1x med PBS och 2x med sterilt vatten. Låt rätter lufttorka i laminärt flöde huva och förvara i en förseglad plastpåse vid 4 ° C i upp till en månad.
  2. Kalibrera AFM och set-up prov hjärna i AFM.
    OBS: Följ AFM kalibreringsanvisningar enligt tillverkaren.
    1. Lasta en AFM sond med en nominell fjäderkonstant av 0,03 N / m och en 20 um diameter borosilikat pärla i sondhållaren.
    2. Kalibrera fjäderkonstanten och inversa optisk hävstång känslighet (InvOLS) av AFM fribärande genom den termiska melodi metoden 15,16.
      NOTERA: När fjäderkonstanten för en AFM sonden beräknas, bör det vara konstant med upprepad användning. Dock kommer de fribärande InvOLS behöver omkalibreras varje gång lasern falla med fribärande. Dessutom kalibreringbör utföras mot ett underlag flera storleksordning styvare än den fribärande, såsom polystyren.
    3. Slå på scenen monterade värmaren och sätt temperaturen till 37 ° C.
    4. Montera hjärnan skiva på P60 rätter tillagade i avsnitt 3.1.
      1. Häll försiktigt en 350 | j, m tjock hjärna skiva, samt CO 2-oberoende medium från den rundbottnade kolven i en P60 skål belagd med musslan härledda bioadhesiv.
      2. Genom att sakta vända P60 skålen, placera hjärnan skiva i mitten av skålen. Om det är nödvändigt, långsamt pipettera medium från en manuell pipett att vika en hjärna skiva som har vikts över sig själv eller bättre position hjärnan skiva i mitten av skålen.
      3. Försiktigt bort överskott media med en P1000 pipett (använd inte vakuum).
      4. Placera locket på P60 skålen och låta hjärnan skiva vidhäfta under 20 min.
    5. Avlägsna AFM huvudet, placera hjärnan skiva monterad i P60maträtt på AFM scenen och lägga ~ 2 ml förvärmda CO 2-oberoende medium.
    6. Sätt försiktigt en droppe mediet på AFM sonden för att skydda den från att bryta grund av ytspänningen när den sänks ner i mediet som omger hjärnan skiva.
    7. Placera om AFM framme på scenen, och börja sänka huvudet tills den är nedsänkt i mediet.
    8. Använda top-view CCD-kamera, flytta lasern på fribärande.
      OBS: inriktning av lasern på den fribärande kommer att ha förändrats något på grund av skillnaden i brytningsindex för luft och medium.
    9. Vänta fem minuter för konsolen att anpassa sig till att vara nedsänkt i en varm vätska, sedan återställa spegeln anpassning till en fri böjning av 0 V.
    10. Kör en termisk spektrum på AFM sond enligt tillverkarens anvisningar 16. Använd passning första termiska toppen att åter beräkna AFM sondens InvOLS i media.
    11. Med hjälp av optiskt mikroskop,flytta provstadiet så att hjärnan regionen av intresse under AFM sonden.
      OBS! Corpus callosum visas mörkt eftersom det är mer ogenomskinligt än den omgivande grå. Cortex är överlägsen corpus callosum.
    12. Återställ spegeln anpassning till en fri böjning av 0 V.
    13. På Sum och Nedböjning Meter i AFM programvara, klicka på "Engage" att engagera AFM huvudet.
    14. Använda positionsratten på AFM huvudet, sänka huvudet tills kontakt mellan konsolen och provet görs.
  3. (Tillval) Om så önskas, mäta elasticitetsmodulen av provet, som beskrivits tidigare 4,17,18.
  4. Genomföra krypkomplians experiment.
    1. Konstruera en pålagd kraft funktion i programvarans funktion redaktör. Kraften Funktionen består av en 0,1 sek ramp till ett börvärde av 5 NN och håller den i 20 sekunder, följt av en 1 sekund ramp ner till en tillämpad kraft 0 NN.
      1. På Indrag ledar- Panel under indrag metod, välj "Load" för Indenter läge; "N" för enheter; och "Funktions editor" för Indenter funktion.
      2. I funktionen redaktör på Segment Parms panelen, skapa en anbringad kraft funktion segmentet som startar vid 0 NN, slutar vid 5 NN, med en tid på 0,1 sekunder. Klicka på "Infoga ->".
      3. För nästa segment, ange start till 5 NN, slut på fem NN, och tid till 20 sekunder. Klicka på "Infoga ->."
      4. För den slutliga segmentet, ställ börjar 5 NN, slut på 0 NN, och tid till 1 sek. Klicka på "Rita" och stäng Function redigeringsfönstret.
    2. På Force Tab av Master panelen, kontrollera "indenter ramp efter trigger" och ställ den anbringade kraften funktionen att utlösa efter att ha nått en brytpunkt på 0,1 V.
    3. Klicka på "Single Force" på undersidan av Force Tab av Master Panel, som kommer att utlösa det konstruerade applicerade kraft funktion för kryp efterlevnad.
    4. Efterenda kraft indrag är klar, höja AFM huvudet så att det är i kontakt med provet och sedan återuppta huvudet och åter noll fri böjning.
    5. Flytta provet scenen för att hitta ett nytt område av intresse och sänka AFM huvudet för att få kontakt. OBS: AFM huvudet måste dras tillbaka från provytan när provstadiet flyttas. Underlåtenhet att göra detta kan leda till skador på den känsliga AFM fribärande.
    6. Upprepa steg 3.4.3-3.4.5 tills önskad mängd data har samlats in.
  5. Genomföra kraftavkopplingsexperiment.
    1. Konstruera en tillämpad indrag funktion i programvarans funktion redaktör. Inbuktningen funktion består av en 0,1 sek ramp till ett börvärde på 3 | j, m och håll den under 20 s, följt av en 1 sek ramp ner till en inbuktning djup av 0 ^ m.
      1. På Indrag huvudpanelen under indraget metod, välj "indrag" för Indenter läge; "M" för enheter; och "; Funktion editor "för Indenter funktion.
      2. I funktionen redaktör på Segment Parms panelen, skapa en anbringad kraft funktion segmentet som startar vid 0 um, slutar vid 3 pm, med en tid på 0,1 sekunder. Klicka på "Infoga ->".
      3. För nästa segment, ange start till 3 um, slut på 3 pm, och tid till 20 sekunder. Klicka på "Infoga ->."
      4. För den slutliga segmentet, ange start till 3 um, slut på 0 um, och tid till 1 sek. Klicka på "Rita" och stäng Function redigeringsfönstret.
    2. På Force Tab av Master panelen, kontrollera "indenter ramp efter trigger" och ställ den anbringade kraften funktionen att utlösa efter att ha nått en brytpunkt på 0,1 V.
    3. Klicka på "Single Force" på undersidan av Force Tab av Master Panel, som kommer att utlösa det konstruerade applicerade indrag funktion för kraft avkoppling.
    4. Efter den inre kraften inbuktning är klar, höja AFM huvudet så att det ärur kontakt med provet och därefter åter i ingrepp med huvudet och åter noll nedböjning.
    5. Flytta scenen för att hitta ett nytt område av intresse och sänka huvudet att ta kontakt.
    6. Upprepa steg 5,3-5,5 tills önskad mängd data har samlats in.
  6. Avsluta experiment och sanering.
    1. Efter avslutande experiment höja AFM huvudet och ta bort den från provet.
    2. Använd ett labb vävnad att försiktigt ta bort överflödig vätska utan att röra konsolen.
    3. Rengör försiktigt AFM fribärande hållaren med en liten mängd etanol. Utsätt inte den känsliga elektroniken på konsolhållaren till etanol. Ta bort AFM fribärande och plats i en lagringsbehållare.
    4. Avyttra vävnadsprov hjärnan genom att följa lämpliga biosäkerhet protokoll.
  7. Med hjälp av MATLAB, beräkna kryp efterlevnad och tvinga avkoppling moduler med hjälp av indenter geometri, enligt lösningen som härrör från Lee och Radok, 1960 19.
    1. Beräkna kraften F och indrag djup ekvation 1 från uppgifter om fribärande positionen Z, böjning d och fjäderkonstanten, k c

      ekvation 1 och ekvation 1 .
    2. Leta reda på kontaktpunkten längs fördjupningen kurvan med den algoritm som beskrivs i Lin et al. 20.
    3. Definiera ett fönster av intresse för dataanalys. Fönstret av intresse är den region där endera kraften (för krypkomplians) eller indrag djup (för kraftrelaxation) hålls vid ett börvärde (dvs., Region 3, såsom visas i Figur 1C, D).
    4. För krypkomplians experiment, beräkna den experimentella krypkomplians modul, J c (t), som svar på en stegbelastningsn en "src =" / filer / ftp_upload / 54201 / 54201eq4.jpg "/>:
      ekvation 1 ,
      där H (t) är Heavyside stegfunktionen och R är radien av den sfäriska sonden.
    5. För kraftavkopplingsexperiment, beräkna den experimentella kraft relaxamodul, G R (t), som svar på ett steg indrag djup ekvation 1 :
      ekvation 1 .

4. Impact indrag

  1. Kalibrera instrument nanoindenter och justera standardinställningarna för att aktivera dynamiska slag experiment på hydratiserade hjärnvävnader enligt tillverkarens anvisningar.
    1. Montera en sfärisk sond genom att skjuta den på pendeln med pincett.
    2. Limma en smält kvarts provet på prov inlägg, som är inskruvad i den translationellaskede.
    3. Gå till kalibreringsmenyn och välj "Liquid Cell." Följ programvarans instruktioner för att få kontakt med smält kvarts provet.
    4. Välj "Normal" för Indenter typ och använda standardvärde på 0,05 mN för Indenter Load. Klicka på "Fortsätt" för att utföra kalibreringen för den normala indenter konfiguration.
    5. Flytta provstadiet tillbaka med minst 5 mm. Montera hävstångsarmen, som tillåter sonden att sänkas ned i flytande cellen, och upprepa kalibreringen flytande cellen i den nya konfigurationen genom att välja "Liquid Cell" för Indenter Type. Klicka på "Fortsätt" för att få Liquid Cell kalibreringsfaktor.
    6. Aktivera Liquid Cell programvara alternativ genom att gå till menyn Experiment och välja "speciella alternativ." Använd den senaste kalibreringsvärdet.
    7. Öka kondensatorplattans distans eftersom detta kommer att leda till en större maximal mätbar djup, vilket är nödvändigt när man testar highly kompatibla material.
      1. Under systemmenyn, välj "Non Skyddade Inställningar" och "maskinparametrar" för att ändra pendelprovbelastningen hastighet, nollbelastningsgrad, och standby ramp offset till 0,5 mN / sek, 0,1 mN / sek, och 3 V resp.
      2. Med en skiftnyckel, vrid de tre muttrarna som styr kondensatorplattan avståndet medurs i små steg.
      3. Efter varje fullständigt medsols varv, välj "Bridge Box justering" under menyn Underhåll och få en bra pendeltest som kommer att kräva att flytta motvikt vikten från pendeln.
      4. Upprepa steg 4.1.7.2-4.1.7.3 tills ungefärligt djup kalibrering läser ett värde av 70.000 nm / V eller högre.
    8. Placera en ny gräns stopp vid botten av pendeln som kan slås på och av via ett nätaggregat. Dra tillbaka det ursprungliga anslaget sitter bakom pendeln att ta bort en potentiell obstruktion av pendelrörelse och möjliggöra högreanslagshastigheter samt högre penetrationsdjup i överensstämmande prov.
    9. Låt skåpet för att nå termisk jämvikt (tar ungefär en timme).
    10. Medan skåpet jämvikt, gå tillbaka till systemmenyn och välj "Non Skyddade Inställningar" och "maskinparametrar." Ställa in djupkalibrering (dcal) kontakt hastighet till en im / s, den primära indrag kontakthastigheten till 3 pm / sek, och ultra låg belastning kontakt hastighet till en im / sek.
    11. Under kalibreringsmenyn, utföra en standarddjup kalibrering i denna nya konstellation.
    12. Slå på strömmen till solenoiden och ställ in den till 10 V. Gå till Experiment menyn och välj "Impact" och "Justera Impulse Displacement." Följ mjukvaruinstruktioner (automatiska anvisningarna) att kalibrera svängavstånd pendeln.
  2. Montera musen hjärnvävnad i den flytande cellen.
    1. Efter skörd av hela hjärnan från step 1,5, förvara den omedelbart i CO2-oberoende näringsmedium för vuxna nervvävnad media på is.
    2. När effekten indrag installationen är helt klar, försiktigt överföra hjärnan i en petriskål tillsammans med CO 2-oberoende medium. Skiva hjärnan i 6 mm tjocka sektioner med plana ytor på vardera sidan.
    3. Vidhäfta den skivade vävnaden till aluminiumprov inlägg med ett tunt skikt av cyanoakrylatlim.
    4. Skjut den flytande cell över den andra O-ringen på prov stolpen och fylla den flytande cell med 5 ml CO 2-oberoende medium för att helt fördjupa vävnaden. Detta prov inlägg är sedan försiktigt monteras på translationell scenen inuti instrumente nanoindenter.
  3. Mät effekten svaret från hjärnvävnad.
    1. Om det behövs, ta bort den sfäriska sonden och ersätta det med sonden av intresse utan att ta bort hävarmen.
    2. Under systemmenyn, välj "Non SkyddadInställningar "och" maskinparametrar. "Ändra den primära kontakt islagshastigheten till 5 pm / sek.
    3. Med provet badet låg (-z riktningen) och långt borta från pendelns (+ x-riktningen), röra sig i -x riktning tills spetsen på hävstångsarmen är korrekt placerad ovanför badet. Röra sig i + z-riktningen tills spetsen är helt nedsänkt i badet och framför provet.
    4. Använda provstadiet kontrollfönstret, ta kontakt försiktigt och sedan tillbaka på scenen bort från provytan med cirka 30 pm.
    5. Enligt experiment menyn, klicka på "Impact" för att ställa upp en effekt experiment. Välj en specifik impuls last som kommer att relatera direkt till den resulterande islagshastigheten baserad på sväng avstånd kalibrering. Kör den planerade experiment.
    6. När pendeln svänger tillbaka och provytan fortsätter att röra sig till mätplanet, vrid nedre gränsstopp avstängning.
    7. Observera som pendeln svänger forward att påverka provet. Förskjutningen av sonden som en funktion av tiden kommer att spelas in av programvaran.
    8. När xyz scenen visas, vrid gränsstoppknappen igen.
    9. Upprepa steg 3,4-3,8 för att testa så många olika laster och platser som behövs.
  4. Analysera förvärvade förskjutning mot tid svar av pendeln med hjälp av skräddarsydda MATLAB skript för att bestämma den maximala penetrationsdjupet x max, energiavledningsförmåga K, och försvinnande kvalitetsfaktorn Q. 11
    1. Gå till analysmenyn och exportera data i en textfil.
    2. Ta tidsderivatan av förskjutningen profil för att erhålla hastigheten som en funktion av tiden. Ange noll förskjutning som kontaktpunkten x o1.
      OBS: Impact hastigheten v i är den maximala hastighet omedelbart före kontakt x max motsvarar deformation vid vilken sonden.hastigheten först minskar till noll. x O2, vilket motsvarar x r, är det läge som krävs för att blåsa liv i kontakt med den deformerade provet i nästa cykel. Rebound hastighet v ut är hastigheten vid förskjutning x r.
    3. Definiera K (kartografisk) som den energi som förbrukas av provet normaliseras genom summan av de tillvaratagna och skingrat prov energier under de första effekterna cykeln. Beräkna K baserat på de inneboende egenskaperna hos pendeln 21 (såsom rotations styvhet och dämpningskoefficient), x o1, x max, x r, v i, och v ut.
      OBS: För mer information, kan man konsultera arbete Kalcioglu et al, 2011..
    4. Eftersom förskjutning kan beskrivas som en dämpad harmonisk oscillerande rörelse, montera en exponentiell sönderfallsfunktion till maxima av displacering tidkurvan.
    5. Beräkna Q (enhetslös) som π multiplicerat med antalet cykler som krävs för svängningsamplituden att minska med en faktor e. Ett högre Q-värde innebär en lägre energieffektförlust.

5. Reologi

  1. Set-up och kalibrera reometern enligt tillverkarens instruktioner.
    1. Initiera reometern genom att öppna enheten / kontrollpanelen. På fliken kontrollpanelen, klicka på "initiera".
    2. Montera mätningsplattan (PP25) och den termiska systemet 25 mm-diameter.
    3. (Valfritt) För att minska glidning mellan Rheometer plattor och vävnaden, klippa ut självhäftande sandpapper skivor som matchar formen på den övre reometern plattan och följa den sandpapper till toppen och bottenplattan.
    4. Ta kontakt mellan den övre och bottenplattan genom att klicka på "set noll gap" på kontrollpanelen.
    5. Noll normalkraften Givare clicking "reset normalkraft."
    6. Genomför en tröghets testet genom att öppna fliken tjänsten på kontrollpanelen, klicka på "mätsystem" och sedan klicka på "tröghet test". Anteckna gamla och nya tröghet. Verifiera att trögheten ligger inom den tillåtna gränsen för sonden, enligt förteckningen av tillverkaren.
  2. Belastning provet i reometern.
    1. Efter skörd av vävnad och skära en koronal segment av gris hjärnan till ~ 5 mm tjocklek, lagra den på is i CO2-oberoende medium.
    2. Placera hjärnan mellan de två plattorna. Ta bort stora vattendroppar från den övre och nedre ytan av provet för att förhindra glidning, men inte torka ut provet.
    3. Sakta sänka mätningen plattan tills plattan är i full kontakt med den övre ytan av vävnaden och den uppmätta normalkraften är förenligt på 0.01 mN efter en 5-10 min relaxationsperiod.
      1. I kontrollpanelen anger successivt lägre höjder in mätpositionen rutan och klicka på "mätpositionen" långsamt sänka mätningsplattan.
      2. När inom en millimeter av kontakt med vävnaden, sänka mätningen plattan i steg om 0,1 mm tills plattan är helt i kontakt med den övre ytan av vävnaden. Se till att den uppmätta-normalkraften är genomgående på 0.01 mN efter en 5-10 min relaxationsperiod.
      3. Anteckna inledande uppmätta normalkraften. Upprepade mätningar bör tas vid samma tryckspänningar / stammar.
    4. Trimma provet med en plastblad om provet överskrider diametern på plattan. Pipett en liten volym (~ 1-2 ml) av media på kanterna av provet för att återfukta vävnaden.
    5. (Tillval) Sänk värme huven. På kontrollpanelen, ställa in temperaturen till 37 ° C och klicka på "set".
  3. Utföra en amplitud svep för att etablera det linjära viskoelastiska intervallet av materialet (dvs skjuvningstammar vid vilken G 'och G' 'är konstanta) vid frekvenser av intresse (t.ex., 1 rad / sek).
    1. Välj "Arkiv / Nytt". Under fliken gel välj "Amplitude svep: LVE-range." Välj fönstret och klicka på "Mätning 1:. Amplitude sweep" Dubbelklicka på svängningen rutan. Ange inledande och avslutande stam (t.ex. 0,01 till 105), frekvens (t.ex. en rad / sek) och antalet poäng per årtionde (t.ex. 6 poäng / Dec). Välj "OK" och klicka på Start. "
    2. Upprepa denna procedur för flera skivor med upprepade försök att säkerställa överensstämmelse av det linjära elastiska området. Den axiella kompressionen av provet bör vara konstant mellan proven.
  4. Genomföra ett frekvenssvep av vävnaden vid en stam i det linjära viskoelastiska intervallet av vävnaden (t ex, 1% töjning) 22, och vid ett frekvensområde av intresse (t.ex., från 0,1 till 100 rad / sek).
    1. Klick "File / nya" och under fliken gel välj "frekvenssvep." Klicka på fönster / Mätning 1: frekvenssvep. Dubbelklicka på svängningen rutan. Ange frekvensområdet (t.ex. 0,1 till 100 rad / sek), stammen (t.ex., 1% spänning) och antalet punkter per dekad (t.ex., 6 poäng / Dec). Välj "OK" och klicka på "start" för att initiera frekvenssvepet.
  5. Upprepa frekvenssvep (steg 5,4) i dubbletter eller tripletter.
  6. Gå igenom de data som automatiskt beräknas och exporteras av reometern: G 'och G "som en funktion av frekvens (frekvenssvep) eller skjuvspänningen (amplitud svep). OBS: G' och G '' beräknas från provets (max ) reactional vridmoment amplitud T '0, och rotationsförskjutningsvinkeln (eller avböjningsvinkel) ekvation 1 , Och fasfördröjningenEkvation 1 "src =" / filer / ftp_upload / 54201 / 54201eq9.jpg "/> av provets svar på den pålagda oscillerande stam (Figur 3):
    ekvation 1
    ekvation 1
    där R och h är radien och höjden av provet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figur 4 visar representativa indrag och kraft mot tid svar (figur 4B, E) för krypkomplians och tvinga avkopplingsexperiment, med tanke på en applicerad kraft eller indrag djup (Figur 4A, D), respektive. Med användning av dessa data och geometrin hos systemet, kan krypkomplians J c (t) och tvinga relaxa moduli G R (t) beräknas för olika regioner av hjärnan (figur 4C, F). Medan tidigare studier har visat en skillnad mellan det elastiska modulerna för olika områden i hjärnan 23, de viskoelastiska egenskaperna mätt på detta sätt för mus hjärnvävnadsskivor visar inte inter variation inom en given vävnad slice.

Inverkan indrag mäter de mekaniska egenskaperna hos vävnaden vid höga hastigheter av spatialt och temporalt koncented lastning. Resultaten av dessa experiment ger information om hur vävnaden avleder energi som svar på traumatisk skada eller avsiktlig deformation associerad med kirurgi. Den dämpade oscillerande rörelse av effekterna indrag sonden (Figur 2B) ger information för att beräkna den maximala penetrationsdjupet x max (figur 5A), energiförbrukningskapacitet K (figur 5B) och energieffektförlust Q (figur 5C) av vävnaden. Penetrationsdjupet mäter deformationsmotståndet, som starkt korrelerar med vävnaden elastiska modul: styvare vävnader uppvisar mindre penetrationsdjup för en given anslagshastighet och slagenergi. Energiavledningsförmåga är en enhetslös mått på i vilken utsträckning vävnaden avleder slagenergin under den första påverkan cykeln. faktoråtgärder avledning kvalitet hur många cykler inträffa innan svängningarna från iÖLJDER dämpas betydligt - detta direkt samband med graden av energiupptagning, även om detta inte uttrycks i tidsenheter. Dessa tre konsekvenssvarsparametrar kan kvantifieras på olika anslagshastigheter, vilket ger ett medel för att studera de hastighetsberoende egenskaperna hos vävnaden.

Figur 6 visar makroskala G 'och G "för frekvenser som sträcker sig från 0,1 rad / sek till 50 rad / s. Lagringsmodulen är nästan en storleksordning större än förlustmodulen vid låga frekvenser. Emellertid förhållandet mellan lagrings- och förlustmoduler minskar när frekvensen ökar. Detta tyder på att elastiska egenskaper dominerar beteendet hos hjärnvävnad, eftersom lagringsmodulen beskriver elastiska egenskaper och förlustmodulen beskriver viskösa förluster av materialet. Vid en tillräckligt hög belastning frekvens, kommer lagring och förlust moduler likställa, vilket indikerar den punkt vid vilkenmaterialet börjar flyta (dvs viskösa egenskaper dominerar beteendet hos provet). I fallet med hjärnvävnad mätt som illustreras här, gör fysiska begränsningar i instrumenteringen inte tillåter oss att mäta materialegenskaper vid högre frekvenser.

Figur 1
Figur 1. Illustration av AFM-aktiverade kryp efterlevnad och tvinga avkoppling experiment. (A) AFM-aktiverade indrag genomförs med hjälp av en flexibel fribärande med en sfärisk pärla av nano- till mikro radie kopplad till den fria änden. (B) Under indrag, är fribärande deformation uppmätt med användning av en laser som reflekteras från änden av konsolen och på en fotodiod. (C) Force avkoppling experiment utförs av indrag konsolen till en konstant tillämpad djup, medan kraften förfall med resbrös att tiden mäts. (D) Kryp efterlevnaden förändrade indrag djup av konsolen med en konstant applicerad kraft. (C) och (D) har delats in i fem regioner (grön text): (1) metoden av AFM sonden till provets yta, (2) Kontakt med prov och ramp upp till ett börvärde indrag / kraft, (3) underhåll av börvärde indrag / kraft (4) ramp ner och (5) tillbakadragning av AFM sonden från provets yta. klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Illustration av slag indrag experiment. (A) Schematisk bild av slag indrag, visar förmågan att genomföra experiment i fullt hydratiserade förhållanden. (B) Repres dare sökarförflyttning profil som en funktion av tiden som samlats in från en mus hjärna skiva och motsvarande hastighetsprofil. Key uppmätta förskjutningen och beräknade hastighets parametrar som används för att kvantifiera energiupptagning anges. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Illustration av parallella platt Rheometer experiment. (A) Schematisk bild av parallella platt reometer experiment och definitioner relaterade till tillämpad oscillerande skjuvspänning. (B) Representativa anbringade töjningen och resulterande påkänning som en funktion av tiden. Shear lagringsmodul G 'och skjuvning förlustmodul G "beräknas via stammen amplitud54201 / 54201eq12.jpg "/>, vridmoment amplitud T '0, fasförskjutning ekvation 1 , Sond och prov radie R, och provhöjd h. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. Representativa data från kryp efterlevnad och tvingar avkoppling experiment. (A, B) från rådata i figur 1, är en region av intresse som för kryp överensstämmelse som den tidpunkt då anbringade kraften förblir konstant (A) medan indrag djup mäts (B). Den infällda bilden i (A) visar data från ett misslyckat experiment där AFM piezo var oförmögenatt bibehålla den anbringade kraften och den infällda i (B) visar motsvarande indrag svar, som är kvalitativt liknande data från ett lyckat experiment visas i (B). (C) Med data från den anbringade kraften, mätt indrag och kunskap om geometri sonden är kryp överensstämmelse J c (t) beräknas. (D, E) i kraft avkoppling, är indrag djup konstant (D), medan kraft mot tid mäts (E). (F) Med hjälp av dessa data, kan kraft relaxamodul G R (t) beräknas. Kryp efterlevnad och tvinga avkoppling experiment kan utföras på anatomiskt distinkta regioner av hjärnan, såsom corpus callosum (röd) och cortex (blå). Data i (C, F) är ett genomsnitt av mätningar från n = 5 möss. Vänligen click här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5. Representativa data från inverkan indrag experiment. Maximal penetrationsdjup x max, energiavledningsförmåga K, och försvinnande kvalitetsfaktor Q av mus hjärnvävnad är beräknat utifrån råförskjutningsprofiler som erhållits vid olika anslagshastigheter. Data representeras som medelvärde ± standardavvikelse (n = 18 upprepade mätningar per punkt). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6. Representativa data från rheometry experiment. Lagring G "ochförlust G '' moduler från koronalt skivor gris hjärnor. Mängden tanö beräknas som förhållandet mellan förlust lagringsmodul. Data representeras som medelvärde ± standardavvikelse (n = 4 upprepade mätningar per punkt). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Varje teknik som presenteras i detta dokument mäter olika aspekter av hjärnvävnad mekaniska egenskaper. Kryp efterlevnad och spänningsrelaxationsmoduler är ett mått på tidsberoende mekaniska egenskaper. Lagrings- och förlustmoduler representerar hastighetsberoende mekaniska egenskaper. Slag inbuktning mäter också hastighetsberoende mekaniska egenskaper, men inom ramen för energiavledning. När karakterisera vävnads mekaniska egenskaper, både AFM-aktiverade indrag och reologi vanligaste metoderna. AFM-aktiverade inbuktning är särskilt användbara eftersom förutom att ge tidsberoende materialegenskaper kan olika experimentella parametrar användas för att mäta cell och vävnadselasticitetsmodul 4 och till och med frekvensberoende egenskaper 24, såsom beskrivits tidigare. Emellertid kan noggrann tolkning av data och utformning av experiment vara utmanande för kompatibla, hydratiserade vävnader. Medan reometri åtgärder bulk korrektband av vävnad, sonder AFM-aktiverade indrag mikroskala volymer som är relevanta för cellernas mikromiljö. Impact indrag ger en möjlighet att kvantifiera exakt hur ett material deformeras i samband med en koncentrerad, dynamisk stötbelastning, som är användbar i tillämpningar som studerar traumatisk hjärnskada orsakad av fokal effekt. Även om resultaten från varje teknik är inte direkt jämförbara, avledning energiegenskaper som mäts via inverkan indrag följer samma trender som förlust skjuvmodulen mätt via reologi, såsom diskuteras nedan.

I AFM-aktiverade indrag av hjärnvävnad som illustreras häri, mätte vi viskoelastiska egenskaper med hjälp av kryp efterlevnad och tvinga avkoppling. På grund av den lilla omfattningen av AFM sonden, kan denna teknik mäta mekaniska egenskaper hos anatomiskt olika områden av hjärnan, såsom de vita och grå materia regioner i hjärnbalken och cortex, respektive (Fig. 4

Vi fann att det viskoelastiska beteendet hos hjärnvävnad mätt på detta sätt är kvalitativt jämförbar med tidigare rapporterade resultat från Elkin & Morrison 26. Medan storleken på de uppmätta värdena för avkoppling modul inte håller, är detta sannolikt på grund av skillnaden i experimentella betingelser. Elkin & Morrison använder en 250 um diameter platt stans, jämfört med våra 20 pm diameter sfär. Dessutom Elkin & Morrison utföra mätningar på hjärnvävnad från råttor, medan vi genomfört mätningar på hjärnvävnad som erhållits från möss. Trots dessa skillnader, båda teknikerna MEAURED heterogena mekaniska egenskaper inom hjärnvävnad, eller mer specifikt, att den vita substansen av corpus callosum uppvisar en lägre relaxamodul än den grå massan av hjärnbarken i frontalplanet.

Det är viktigt att notera att medan vi beräknat kryp efterlevnad och tvinga avkoppling moduler som svar på en begärd steg last eller steg indrag, respektive, den experimentellt pålagd last och indrag är inte perfekt (momentana) steg funktioner. Laster och fördjupningar appliceras över korta tidsskalor (<1 sek), och dessa belastningshistorik kan påverka den uppmätta krypning och avkoppling svar 7,25. Speciellt om man antar en tillämpas steg indrag resulterar i liten underskattning av avkoppling modul, medan man antar en tillämpade steg belastning resulterar i lätt överskattning av kryp efterlevnad modul. Skillnaderna mellan de faktiska och beräknade elastiska moduler kommer att minska när ramphastigheterav de påförda lasterna och indrag ökar.

Ett viktigt steg i att utföra last avkoppling är att välja den rätta storleken på underhålls kraft (dvs börvärdet som motsvarar fotodiod spänning som hänför sig direkt till den anbringade kraften). Börvärdet kraft för kryp överensstämmelse måste väljas så att: (1) svaret är tillräckligt stor för att producera lätt mätbara förändringar i indrag djup; och (2) tillräckligt liten för att den indrag djup krävs för att bibehålla börvärdet kraft inte blir så stor att glida utanför området av AFM piezoelektriska manövreringsorgan som modulerar den vertikala positionen för AFM fribärande basen. I den presenterade protokollet, har vi föreslagit en inställningskraft 5 NN, som fungerade bra för vår experimentuppställning. Men om AFM piezo är oförmögen att upprätthålla denna kraft på grund av dess begränsade rörelseomfång (se fig. 4A, infälld), detta värde kan sänkas. Denna experimentella fråga är inte encountställda med kraft avkoppling experiment som upprätthåller en konstant, beräknad indrag djup genom en återkopplingsslinga.

I motsats till den kvasistatiska AFM-aktiverade indrag på nanoNewton (NN) skala krafter och um-skala djup inverkan indrag tillämpar en koncentrerad dynamiska belastning mN skala krafter och mäter provet deformation svar på djup närmar sig millimeterskala. Vi har tidigare använt inverkan indrag att kvantifiera beteende hjärta och lever 9,11,12, och observerade en liknande beroende av energiförlust svar på laddningshastighet för vävnader från dessa organ.

Inverkan indrag rymmer sond radier som sträcker sig från pm till mm. Dessutom kan slag indrag experiment att genomföras i fullt nedsänkta miljöer, som möjliggör för den mekaniska karakteriseringen av hydratiserade vävnader 21. Vid testning av mycket överensstämmande prov såsom hjärnvävnad, important överväganden måste tas i beaktande. För det första är den maximala mätbara djup i materialet ungefär 1 mm, en begränsning som fastställts av längdskalor i själva instrumentet; någon ytterligare pendel förskjutning kommer att fysiskt stoppas vid kollisionen mellan den elektromagnetiska spolen belägen vid toppen av pendeln och den stationära magnetplatta. För hjärnvävnad, begränsar detta den högsta effekt hastighet som med framgång kan appliceras på cirka 5 mm / sek. Notera att medan de anslagshastigheter är i storleksordningen mm / s, de motsvarande stam energidensiteter är av storleksordningen kJ / m 3, som närmar ballistiska villkor, på grund av de små dimensionerna hos sondradie 11. För det andra, kan den potentiellt blivit svårt för instrumentet för att detektera kontakt mellan proben och vävnadsytan. Som provstadiet färdas mot sonden, är kontakten upptäcks när pendeln skjuts tillbaka genom prov rörliga. Men för mycket compliant prover, pendeln får inte böjas detekterbart medan sonden tränger in i provet.

För att lösa detta problem, kan vi öka den hastighet med vilken provstadiet flyttas så att det blir en större drivkraft under kontakt för att driva pendeln tillbaka. Provet bör också vara så platt som möjligt, för att ytterligare minimera eventuella fel vid detektering av korrekt kontaktpunkten. Slutligen notera att slagbelastningen är inte en sann impuls last, i att den elektromagnetiska ström vid pendeln toppen fortsätter att leverera en drivkraft för penetration efter den första stöten händelsen. Som ett resultat kan krypning förekomma, särskilt vid de högre belastningsförhållanden, vilket komplicerar analysen av energiavledning egenskaper. Det fortsatta arbetet med denna teknik kan innebära att frikoppla kryp svar från effekterna svar införa temperaturkontroll för att möjliggöra studier vid kroppstemperatur, och med visualisering av vävnadsprov ytan via en mikroskope kompatibel med den flytande cellen.

Rheometry mäter frekvensberoende mekaniska egenskaperna hos viskoelastiska fasta ämnen på makroskala nivå. De skjuvmodulerna komponenter, lagring G 'och förlust G ", kan mätas i frekvensområden typiskt spänner 0,001-,1 rad / s till 10-100 rad / s, beroende på instrumentet, sond geometri och prov 13. För exakt mätning , bör en amplitud svep utföras före ett frekvenssvep för att bestämma den linjära elastiska området av materialet, vilket är det område av stammen för vilken G 'och G' 'förblir konstanta 14,27 den skjuvspänningen väljs för frekvensen. svep bör vara så hög som möjligt inom det linjära viskoelastiska gränsen (typiskt 1-2% skjuvspänningen) så att tillräckligt vridmoment uppnås under mätningen. Vridmomentet momentet~~POS=HEADCOMP under mätningarna bör alltid vara i det tillåtna området som tillhandahålls av tillverkaren för att säkerställa en såufficient signalbrusförhållande.

Dessutom rheometry proben som används bör vara så stor som möjligt för att maximera vridmomentet, men måste överlagra med provet helt 13. Vid framställning av provet, bör vävnaden skivas så platt som möjligt för att minimera stress gradienter vid kontakt sker mellan plattorna. När kontakt görs med provet, bör vävnaden inte har några vattendroppar på det att minimera glida på det gränssnittet. Emellertid måste vävnaden också inte torkas ut före eller under mätning eftersom detta kommer att försämra vävnadsstrukturen 13. Vävnaden bör vara helt hydrerad med media efter kontakt mellan de båda plattorna. Lim, vattentät sandpapper kan också fästas till plattorna för att minimera glid 28. Dessutom har axiell kompression visats påverka storleken på G 'av hjärnvävnad 29. Eftersom reologi prover är typiskt tunna (~ 5 mm), små förändringar i höjd (~ 500pm) kan producera stora tryck stammar (t.ex. ~ 10%), och därför betydande förändringar i skjuvmodul. Eftersom provet är viskoelastiska, kommer materialet att genomgå spänningsrelaxation på grund av axiell kompression 28, som kan påverka mätningarna. Därför bör upprepade mätningar utföras vid liknande drifts axiella stammar, och provet bör tillåtas att slappna av (t.ex. 5-10 min) före mätningen. Felet i samband med dessa fenomen är en begränsning av tekniken. Andra begränsningar av reometri inkluderar antagandet att materialet är homogent och isotropiskt, vilket ofta inte är sant i vävnadsprov 13. Dessutom bör temperaturen hållas vid fysiologiska betingelser, eftersom det kommer att påverka G 'och G "22. I hjärnvävnad specifikt har ökad temperatur visats minska både G' och G '' blygsamt utan att ändra energilags behavior med frekvens och följde därmed tidstemperatursuperhuvud 22,30. Våra data är i god överensstämmelse med tidigare studier 22,27 i porcin hjärna, som observerade liknande storlekarna på G 'och G' ', samt en svag energilagsfrekvens beroende i både G' och G ".

Det beräknade förhållandet tanö = G "/ G '(Fig. 6) ger en grund för jämförelse mellan rheometry och inverkan indrag. I inverkan indrag, fann vi att hjärnvävnaden är energiförbrukningskapaciteten ökade med ökad belastning priser. Använda rheometry, fann vi att som frekvensen ökar, tanö ökade. med andra ord, att materialet var mer avledande vid högre frekvenser. dessutom, medan inverkan indrag mätningar inte kvantifiera en elasticitetsmodul direkt, det penetrationsdjup x max minskning direkt med increasing elasticitetsmodul.

Tillsammans, de metoder som beskrivs i detta dokument gör det möjligt för mekanisk karakterisering av hjärnvävnad på mikro-, meso- och makrolängdskalor, och vid olika belastningshastigheter. De metoder som presenteras häri kan användas på ett antal eftergivliga material, innefattande både biologiska vävnader och engineered hydrogeler. Med en fördjupad förståelse för de multiskal viskoelastiska egenskaperna hos hjärnvävnad, kan vi bättre design material konstruerade för att efterlikna den mekaniska svar i hjärnan. Dessa vävnads simulator material kan underlätta förutsägelse av mekaniska skador och konstruktion av skyddsstrategier. Dessutom kan materialegenskaperna hos hjärnan användas för att utforma Bioinspired material för in vitro- och in vivo-studier för att bättre förstå tillväxt och anslutning av celler i det centrala nervsystemet, i synnerhet i samband med neurologiska sjukdomar, såsom autism och multipel skleros.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylazine Lloyd Laboratoried perscription drug
Ketamine AnaSed Injections perscription drug
Vibratome (Vibrating blade microtome) Leica VT1200
Hibernate-A Medium Gibco A1247501 CO2-independent neural medium for adult tissue
Atomic Force Microscope, MFP-3D-BIO Asylum Research -
Petri Dish Heater Asylum Research -
AFM Probe, 0.03 N/m, 10 µm radius borosilicate sphere Novascan PT.GS
Cell-Tak Corning 354240 mussel-derived bioadhesive
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 alternate suppliers can be used
Sodium Hydroxide, 1 N Sigma-Aldrich 59223C alternate suppliers can be used
Instrumented Indenter, NanoTest Vantage Micro Materials Ltd. - probe tip needs to be machined (steel flat punch, 1 mm diameter, 4-5 mm length)
NanoTest Liquid Cell Micro Materials Ltd. -
Parallel Plate Rheometer MCR501 Anton-Parr -
PP25  Anton-Parr - 25 mm diameter flat measurement plate
Adhesive Sandpaper McMaster-Carr 4184A48 alternate suppliers can be used
Loctite 4013 Instant Adhesive Henkel 20268 alternate suppliers can be used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Dommelen, J. A. W., Hrapko, M., Peters, G. W. M. Mechanical Properties of Brain Tissue: Characterisation and Constitutive Modelling. Mechanosensitivity of the Nervous System. 249-281 (2009).
  2. Liu, F., Tschumperlin, D. J. Micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (54), e2911 (2011).
  3. Peaucelle, A. AFM-based mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments. (89), e51317 (2014).
  4. Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497 (2013).
  5. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. dM., Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components. Nanotechnology. 21, 445101 (2010).
  6. Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. Creep function of a single living cell. Biophysical Journal. 88, (3), 2224-2233 (2005).
  7. Lu, H., Wang, B., Ma, J., Huang, G., Viswanathan, H. Measurement of creep compliance of solid polymers by nanoindentation. Mechanics Time-Dependent Materials. 7, (3/4), 189-207 (2003).
  8. Cheng, L., Xia, X., Scriven, L. E., Gerberich, W. W. Spherical-tip indentation of viscoelastic material. Mechanics of Materials. 37, 213-226 (2005).
  9. Kalcioglu, Z., Qu, M., Van Vliet, Multiscale characterization of relaxation times of tissue surrogate gels and soft tissues. 7th Army Science Conference Proceedings. (2010).
  10. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. D., Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation microscopy: Imaging local stress in cells. Journal of Biomechanics. 43, (2), 349-354 (2010).
  11. Kalcioglu, Z. I., Qu, M., et al. Dynamic impact indentation of hydrated biological tissues and tissue surrogate gels. Philosophical Magazine. 91, (7-9), 1339-1355 (2011).
  12. Kalcioglu, Z. I., Ra Mrozek, R. a, Mahmoodian, R., VanLandingham, M. R., Lenhart, J. L., Van Vliet, K. J. Tunable mechanical behavior of synthetic organogels as biofidelic tissue simulants. Journal of Biomechanics. 46, (9), 1583-1591 (2013).
  13. Janmey, P. A., Georges, P. C., Hvidt, S. Basic rheology for biologists. Methods in Cell Biology. 83, 3-27 (2007).
  14. Miller, K., Kurtcuoglu, V. Biomechanics of the Brain. Springer Science & Business Media. (2011).
  15. Lévy, R., Maaloum, M. Measuring the spring constant of atomic force microscope cantilevers: thermal fluctuations and other methods. Nanotechnology. 13, (1), 33-37 (2002).
  16. Fuierer, R. Basic Operation Procedures for the Asylum Research MFP-3D Atomic Force Microscope. MFP-3D Procedureal Operation "Manualette". Asylum Research. (2006).
  17. Elkin, B. S., Ilankovan, A., Morrison, B. Age-dependent regional mechanical properties of the rat hippocampus and cortex. Journal of Biomechanical Engineering. 132, 011010 (2010).
  18. Elkin, B. S., Azeloglu, E. U., Costa, K. D., Morrison, B. Mechanical heterogeneity of the rat hippocampus measured by atomic force microscope indentation. Journal of Neurotrauma. 24, (5), 812-822 (2007).
  19. Lee, E. H., Radok, J. R. M. The Contact Problem for Visooelastic Bodies. Journal of Applied Mechanics. 27, (3), 438-444 (1960).
  20. Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129, (3), 430-440 (2007).
  21. Constantinides, G., Kalcioglu, Z. I., McFarland, M., Smith, J. F., Van Vliet, K. J. Probing mechanical properties of fully hydrated gels and biological tissues. Journal of Biomechanics. 41, (15), 3285-3289 (2008).
  22. Shen, F., Tay, T. E., et al. Modified Bilston Nonlinear Viscoelastic Model for Finite Element Head Injury Studies. Journal of Biomechanical Engineering -- Transactions of the ASME. 128, (5), 797-801 (2006).
  23. van Dommelen, J. aW., vander Sande, T. P. J., Hrapko, M., Peters, G. W. M. Mechanical properties of brain tissue by indentation: Interregional variation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 3, (2), 158-166 (2010).
  24. Rother, J., Nöding, H., Mey, I., Janshoff, A. Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines. Open biology. 4, (5), 140046 (2014).
  25. Du, P., Lu, H., Zhang, X. Measuring the Young's Relaxation Modulus of PDMS Using Stress Relaxation Nanoindentation. Symposium DD - Microelectromechanical Systems - Materials and Devices III. 1222, (c), (2009).
  26. Elkin, B. S., Morrison, B. Viscoelastic properties of the P17 and adult rat brain from indentation in the coronal plane. Journal of Biomechanical Engineering. 135, 114507 (2013).
  27. Brands, D. W., Bovendeerd, P. H., Peters, G. W., Wismans, J. S., Paas, M. H., van Bree, J. L. Comparison of the dynamic behavior of brain tissue and two model materials. 43rd Stapp Car Crash Conference Proceedings. 313-320 (1999).
  28. Hrapko, M., van Dommelen, J. A. W., Peters, G. W. M., Wismans, J. S. H. M. Characterisation of the mechanical behaviour of brain tissue in compression and shear. Biorheology. 45, (6), 663-676 (2008).
  29. Pogoda, K., Chin, L., et al. Compression stiffening of brain and its effect on mechanosensing by glioma cells. New Journal of Physics. 16, (7), 075002 (2014).
  30. Peters, G. W. M., Meulman, J. H., Sauren, A. A. H. J. The applicability of the time/temperature superposition principle to brain tissue. Biorheology. 34, (2), 127-138 (1997).
Characterizing Multiscale Mekaniska egenskaper hos hjärnvävnad Använda atomkraftsmikroskopi, Impact indrag, och Rheometry
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Canovic, E. P., Qing, B., Mijailovic, A. S., Jagielska, A., Whitfield, M. J., Kelly, E., Turner, D., Sahin, M., Van Vliet, K. J. Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry. J. Vis. Exp. (115), e54201, doi:10.3791/54201 (2016).More

Canovic, E. P., Qing, B., Mijailovic, A. S., Jagielska, A., Whitfield, M. J., Kelly, E., Turner, D., Sahin, M., Van Vliet, K. J. Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry. J. Vis. Exp. (115), e54201, doi:10.3791/54201 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter