Introduction
نخاع العظام هو الجهاز الهام تشارك في تكون الدم وتنظيم جهاز المناعة. وهو يتألف من عنصر المكونة للدم التي تحتوي على الجذعية والسلف الخلايا المكونة للدم (HSPCs)، وعنصر اللحمية التي تحتوي على الخلايا الاولية غير المكونة للدم التي تؤدي إلى خلايا اللحمة المتوسطة 1. ثلثي النشاط للدم مكرس لتوليد خلايا الدم النخاعي 2. على وجه الخصوص، ويتم إنتاج عدد كبير من العدلات في نخاع العظم، مع 1-2 × 10 11 الخلايا المتولدة يوميا في الكبار الإنسان العادي 2. العدلات هي خط الدفاع الأول ضد العدوى الميكروبية ومحفوظة في معظمها في نخاع العظم حتى يؤدي الإجهاد تعبئة لتكملة العدلات المحيطية 1،3. بالإضافة إلى آثارها المضادة للميكروبات، وتشير الدراسات الحديثة دورا هاما العدلات في بيولوجيا السرطان، وكان كل من المؤيدين والظواهر المعادية للمكون للأورام اعتمادا على تحويل النموعامل بيتا (TGF-β) يشير في 4،5 الورم المكروية. وعلاوة على ذلك، فإن الدراسات تبين أن العدلات التي تتراكم في الأورام الأولية تمارس الآثار المؤيدة للمكون للأورام والمتنقل من خلال قمع وظيفة السامة للخلايا من خلايا تي 6،7، في حين العدلات في الدورة الدموية تبسط السامة للخلايا، تأثير مضاد للالمنتشر 8. على هذا النحو، والتحقيق في الخلايا المكونة للدم في نخاع العظم، ولا سيما العدلات، أمر حاسم لتوضيح دورها في تنظيم المناعة، والورم.
تستخدم التشريح واستكمال الطرفية تعداد الدم بشكل روتيني لتقييم التغيرات الخلوية والهيكلية في نخاع العظم 9. ومع ذلك، توفر هذه الأساليب فقط معلومات ثابتة من السكان مختلفة من الخلايا أو الأنسجة المجهرية. طولية في مجال التصوير فيفو يمكن استخدامها في تركيبة مع طرق معيارية لتقييم ديناميات المكونات الخلوية، والأوعية الدموية وانسجة متعددة وكذلك الخلية الى جالتفاعلات الذراع بطريقة طولية. intravital المجهري (IVM)، الذي يعرف بأنه التصوير من الحيوانات التي تعيش في قرار المجهري 10، مفيد بشكل خاص لتقييم العمليات الخلوية الحيوية على مر الزمن في نفس العينة، مما يقلل من عدد من حيوانات التجارب المطلوبة. IVM غالبا ما يتم دمجها مع غرفة نافذة زرع مزمنة (مرحاض) للوصول إلى الجهاز من الفائدة للتصوير خلال مدة أسابيع أو شهور. نماذج مرحاض في الجمجمة وظهري طبقات الجلد لها أطول تاريخ من استخدام يعود تاريخها إلى منتصف 1990s. وفي الآونة الأخيرة، وقد وضعت نماذج أخرى-جهاز معين مرحاض مثل تلك لوحة الدهون الثديية ومختلف أعضاء البطن (11).
النهج التقليدي لتصوير النخاع العظمي في الجسم الحي قد تعرض أساسا تشارك في calvaria من الفئران، حيث تمكن العظام ضعيفة رؤية مباشرة من الخلايا وحيدة مع الحد الأدنى من التدخل الجراحي 12-14. ومع ذلك، فإن نخاع العظام قبة القحف قد بالبريد متميز من أن العظام الأخرى، مثل العظام الطويلة، كما يتبين من عدد أقل من HSPCs وخلايا ميتة في calvaria مما يؤدي الى خفض صيانة وتطوير HSPCs 15. لذلك، تم التحقيق فيها النهج البديلة لتقييم المكونات الخلوية في العظام الطويلة. وتشمل هذه التعرض المباشر للنخاع العظم الفخذي 16 وزرع خارج الرحم من عظم الفخذ تقسيم في طبقات الجلد الظهري WC 17. ومع ذلك، فإن الأول هو إجراء المحطة لا تسمح بتتبع التغيرات الخلوية والهيكلية والوظيفية على مدى فترات زمنية أطول، وعلى الأرجح الأخير يزعج وظيفة عادية نخاع العظام نتيجة لزرع عظم الفخذ إلى موقع خارج الرحم داخل مرحاض ظهري طبقات الجلد. طريقة أخرى تمكن التصوير المسلسل مثلي من نخاع عظم الفخذ مع مرور الوقت هو استخدام مرحاض في العظام الفخذ. أظهر تقرير واحد السابقة التصوير على المدى الطويل من دوران الأوعية الدقيقة في نخاع العظم الفخذ باستخدامالفخذ مرحاض في الفئران (18). بالإضافة إلى ذلك، أظهرت الكتاب التصور من الخلايا السرطانية في عظم الفخذ، مما يدل على فائدتها في رصد نخاع العظام ورم خبيث. ومع ذلك، كان هذا التصميم مرحاض محدودة بسبب حجمها الكبير (1.2 سم القطر) ومنطقة التصوير صغيرة نسبيا (4 مم)، والتي كانت مناسبة فقط للفئران كبيرة (26-34 ز 3-6 أشهر من العمر) مما يجعل نهج عملي للاستخدام الروتيني.
لذلك، تم تصميم مرحاض جديد مع الحجم الكلي أصغر وأكبر منطقة التصوير الداخلي لغرض هذه الدراسة. وكان الهدف من هذه الدراسة لتوفير طريقة لتصوير مختلف أنواع الخلايا في نخاع العظم الفخذي. تم تطوير نموذج WC عظم الفخذ في المنزل، وكان يستخدم لتصور وتتبع العدلات ضمن شبكة الأوعية الدموية 3D. استخدام هذا النموذج، IVM من نخاع العظام لا يمكن أن يؤديها بشكل متسلسل أكثر من 40 يوما. ويمكن تطبيق هذا النهج في مجموعة متنوعة من المجالات لتوضيح عمليات تكون الدم، وتنظيم المناعةالثانية نمو الورم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تم تنفيذ جميع الأعمال الحيوان تحت بروتوكول # 2615 التي وافقت عليها لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام شبكة الصحة جامعة.
1. إعداد الجراحي للماوس
- قبل الجراحة، وتعقيم جميع الأدوات الجراحية وغرفة نافذة (WC) من خلال التعقيم. تكملة مياه الشرب مع 50 ملغم / كغم من وزن الجسم من أموكسيسيلين قبل 2 أيام إلى عملية جراحية. حقن الفأر مع 0.1 ملغم / كغم من وزن الجسم من البوبرينورفين البريتونى 4 ساعات قبل الجراحة.
- تخدير الماوس عارية athymic عن طريق الحقن داخل الصفاق من 350-400 ميكرولتر محلول ملحي تحتوي على 80 ملغم / كغم من الكيتامين و 13 ملغم / كغم من زيلازين (ملاحظة: تمت الموافقة على ذلك لجنة رعاية الحيوان المؤسسي، ولم يكن لدينا أي خبرة مع الآثار السلبية ). تأكيد التخدير المناسبة عن طريق اختبار رد الفعل القدم. مواصلة مراقبة لنمط التنفس، المخاطية لون الغشاء ولا ارادي القدم أثناء العملية.
- أداء العلاقات العامة الجراحيةocedures في إطار مجلس الوزراء السلامة البيولوجية للحفاظ على ظروف معقمة أثناء الجراحة. ضع الماوس على وسادة التدفئة الكهربائية مغطاة ثنى الجراحية للحفاظ على درجة حرارة الجسم أثناء الجراحة. أداء جميع العمليات الجراحية تحت مجهر تشريحي.
- تطبيق مرهم العين للحفاظ على العينين رطبة أثناء الجراحة. كرر إذا لزم الأمر أثناء إجراء العمليات الجراحية. تعقيم المنطقة تشغيل الماوس عن طريق المسح مع 7.5٪ بوفيدون اليود، و 70٪ ايزوبروبيل و 10٪ بوفيدون اليود على التوالي، وكرر هذا الإجراء مرتين.
- جعل 10 مم الطولي شق الجلد باستخدام مشرط بشفرة (رقم 15)، ويقترب من عظم الفخذ من الجانب الوحشي. كشف عظم الفخذ بين العضلة القابضة والباسطة العضلات عن طريق تشريح حادة باستخدام ملقط والمرقأة لضمان وظيفة العضلات.
- إدراج شريط على شكل حرف U تحت العظم، وتثبيت مرحاض (الشكل 1). تأمين شريط مع الإطار باستخدام اثنين من المكسرات، وتشديد المكسرات مع لالفطر الابيض. ملء الفراغ بين العظام ومرحاض مع الاسمنت الأسنان.
- طحن أسفل العظم القشري في منطقة مم 2 6 × 2 مع حفر الصغير للوصول البصرية إلى تجويف نخاع.
ملاحظة: بعناية تفتيش ترقق العظم القشري تحت المجهر حين تنفيذ هذا الإجراء. ترك، طبقة السمحاقية شفافة تقريبا سليمة من العظام. - ضع ساترة 8 ملم على النافذة، وتأمين ساترة مع عصابة المفاجئة لإبقائه في مكانه.
- إعادة ضبط الجهاز العضلي من العضلات القابضة والباسطة مرة أخرى إلى مواقعها الأصلية باستخدام ملقط للحفاظ على وظيفتها بعد الجراحة. خياطة الأدمة باستخدام 5-0 خياطة وحامل إبرة.
- مراقبة الماوس للانتعاش، حتى أنها واعية وقادرة على التحرك بحرية. وضع الحيوان في قفص جديد عندما تعافى.
- بعد الشفاء، نفذ الحصول على الصور على الحيوان في نفس اليوم أو في الأيام التالية (انظر القسم 2). مراقبة physiحالة كال من الفأرة يوميا.
ملاحظة: مراقبة الظروف المادية، مثل الوزن تؤثر على أطرافهم، hunching، وسرعة التنفس أو ضحل، هند أطرافهم تورم، وتشويه الذات، الخلوي والتهابات جلدية شديدة. - إعطاء الحقن داخل الصفاق من 0.1 ملغم / كغم من وزن الجسم من البوبرينورفين لمدة 3 أيام، و 1 ملغم / كغم من وزن الجسم من ميلوكسيكام لمدة 5 أيام بعد الجراحة لعلاج الألم بعد العمليات الجراحية والالتهابات. الاستمرار في توفير المياه تستكمل أموكسيسيلين لمدة 5 أيام.
- عند نقطة النهاية التجريبية، الموت ببطء الحيوانية CO 2 الخدر تليها طريقة الثانوي (على سبيل المثال، خلع عنق الرحم).
2. الحصول على الصور عن طريق الجمع بين متعدد الفوتون ومتحد البؤر المجهري
- قبل التصوير، تخدير الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق من محلول ملحي 350-400 ميكرولتر تحتوي على 80 ملغم / كغم من الكيتامين و 13 ملغ / كغ زيلازين. بدلا من ذلك، استخدم مخدر قابل للاستنشاق، عندما تكون متاحة.تطبيق مرهم العين.
- حقن مزيج من الأصباغ داخل الأوعية الدموية لوصفها الأوعية الدموية (0.65 ملغ من 2 نجمة داود الحمراء فلوريسئين (FITC) -dextran) والعدلات (4 ميكروغرام من Allophycocyanine (APC) مضادة للLy6G الأجسام المضادة).
- استخدام تستقيم جنبا إلى جنب متعددة الفوتون والمجهر متحد البؤر مجهزة ليزر متعددة الفوتون تتراوح 705-980 نانومتر لإثارة ثنائي الفوتون، وكذلك ليزر الفوتون واحد أن يوفر موجات الإثارة من الأزرق إلى الأحمر.
- تعيين مرحلة التصوير حسب الطلب على المجهر (الشكل 1B). تأمين الماوس على مرحلة من تحامل على طرفي مرحاض مع مقاطع التمساح.
ملاحظة: المكونات الحرجة من المرحلة هي: اثنين من لقطات التمساح لعقد دورة المياه، وعنصر التسخين لحفاظ على درجة حرارة الفسيولوجية (37 ° C) من الماوس أثناء التصوير. - بدوره على الليزر ثنائي الفوتون ونظام متحد البؤر، وإطلاق برنامج الحصول على الصور بالنقر على "بدء تشغيل النظام". نافذة مع 4 علامات التبويب (حدد موقع،الاستحواذ، تجهيز، والحفاظ على) وفتح.
- إعداد القنوات التصوير. انقر على "الإعداد الذكي" تحت علامة التبويب اقتناء واختيار الأصباغ التي سيتم استخدامها للتصوير: FITC (488 نانومتر الإثارة، 493-588 نانومتر الانبعاثات) وآسيا والمحيط الهادئ (633 نانومتر الإثارة و638-743 الانبعاثات نانومتر). اختيار "أفضل الإشارة" وانقر على "تطبيق".
- إضافة الجيل الثاني التوافقي (SHG) صورة قناة اكتساب يدويا. بدوره على الليزر ثنائي الفوتون تحت النافذة "ليزر" في علامة التبويب اكتساب. تحت نافذة القنوات، انقر على علامة "+" لإضافة مسار.
- إعداد مسار مجموعات المساعدة الذاتية. تغيير الطول الموجي إلى 840 نانومتر تحت القنوات نافذة باستخدام الأسهم صعودا وهبوطا، واختيار نطاق الكشف عن أن تكون 415-425 نانومتر تحت نافذة "مسار الضوء" باستخدام شريط التمرير.
- انقر على "Oculars أون لاين" تحت علامة التبويب تحديد موقع. انقر FITC تحت الإعداد تصفية FITC لمشاهدة المنطقة من اهتمام وضبط التركيز يدويا من خلال تحويل ركان التركيز مقبض الباب على الجانب المجهر. عندما يقع في المنطقة ذات الاهتمام، انقر فوق "Oculars غير متصل" تحت علامة التبويب تحديد موقع.
- انقر فوق علامة التبويب اكتساب. اختر FITC المسار تحت القنوات النافذة وانقر على "لايف" لمعاينة صورة FITC-ديكستران مع الهدف 5X. ضبط التركيز إذا لزم الأمر، وانقر على "وقف" ضمن علامة التبويب اقتناء لوقف المعاينة.
- تحويل يدويا إلى 20X الهدف المياه عن طريق تحريك عجلة فوق العدسات. عرض الصورة مرة أخرى لFITC-ديكستران باستخدام الهدف 20X، وضبط ماجستير في اكتساب والثقب تحت النافذة القنوات لتحقيق إشارة الأمثل والتباين. تكرار لقنوات أخرى عن طريق اختيار APC ومجموعات المساعدة الذاتية المسارات تحت النافذة القنوات.
- اختيار المعلمات التصوير. انقر على "الوضع اقتناء" لفتح نافذة لها. تعيين حجم الإطار إلى أن يكون 1024 س 1024 بكسل، والمتوسط من 4X للحصول على صور ذات جودة عالية.
- الحصول على لقطة 2D. تحديد كافة القنوات تحت الفوز القنواتداو وانقر على "عض" تحت علامة التبويب اكتساب. تحقق من جودة الصورة وتغيير معالم التصوير إذا لزم الأمر.
- الحصول 2D صورة مرور الزمن.
- تحقق من "السلاسل الزمنية" في علامة التبويب اقتناء لفتح نافذة السلاسل الزمنية. اكتب في 0 تحت فترات، و 40 لعدد من عمليات التفحص لاتخاذ 40 الصور بشكل مستمر دون فاصل زمني.
ملاحظة: 40 بالاشعة يولد ما يقرب من 5 دقائق طويلة السلاسل الزمنية مع سرعة المسح الضوئي من 7.5 ثانية / الإطار وحجم الصورة 600 ميكرون × 600 ميكرون. ضبط الفاصل الزمني وعدد من مسح اعتمادا على المجهر، وإعدادات الحصول على الصور ومعدل الإطار الكاميرا. والفاصل الزمني الثابت (> 0 ثانية) التي يمكن استخدامها لمقارنة الصور الوقت الفاصل بين المكتسبة في نقاط زمنية مختلفة. قد تكون هناك حاجة لمدة التصوير في الوقت الفاصل بين أطول اعتمادا على متوسط السرعة المتوقعة من العدلات (أو غيرها من خلايا الفائدة) في حالة تجريبية.
- تحقق من "السلاسل الزمنية" في علامة التبويب اقتناء لفتح نافذة السلاسل الزمنية. اكتب في 0 تحت فترات، و 40 لعدد من عمليات التفحص لاتخاذ 40 الصور بشكل مستمر دون فاصل زمني.
- الحصول على صورة 3D.
- التحقق من خارج "Z-ستاك" في علامة التبويب اقتناء لفتح نافذة Z-المكدس. بدء تشغيل "لايف" وضع المعاينة لFITC-ديكستران. التركيز على الجزء العلوي من العينة وانقر على "مجموعة العشرين"، والتركيز على الطرف الآخر من العينة وانقر على "تعيين آخر" في إطار Z-المكدس.
- تعيين الفاصل الزمني لتكون 10 ميكرومتر تحت النافذة Z-المكدس. اعتمادا على أول وشريحة البصرية مشاركة المحدد في الخطوة السابقة، وهذا سيولد 10-20 شرائح، مع سمك بصري العام لل90-180 ميكرون.
ملاحظة: الفاصل الزمني ض المكدس يعتمد على حجم الثقب، والذي يحدد سمك شريحة البصرية. تعيين الفاصل الزمني إلى أن يكون أقل من سمك شريحة البصرية. - انقر على "بدء التجربة" تحت علامة التبويب اكتساب للبدء في جمع الصور.
- الحصول 3D صورة مرور الزمن.
- تحقق من "السلاسل الزمنية" و "Z كومة" في علامة التبويب اقتناء لفتح السلاسل الزمنيةوالنوافذ Z-المكدس.
- إعداد السلاسل الزمنية والمعلمات اكتساب Z المكدس كما هو موضح في الخطوات 2.14 و 2.15. انقر على "بدء التجربة" تحت علامة التبويب اكتساب للبدء في جمع الصور.
- مراقبة الماوس أثناء التصوير للتأكد من أنها مستقرة وفاقدا للوعي. إذا كان الماوس غير مستقر و / أو واعية أثناء التصوير، وإزالة الماوس من مرحلة، وضخ إضافي 100-150 ميكرولتر من محلول مخدر داخل الصفاق، ومواصلة التصوير.
ملاحظة: علامات عدم الاستقرار وتشمل سرعة التنفس والحركة من الفأرة، والتي يمكن أن ينظر إليها على نقل القطع الأثرية في صور المكتسبة. - بعد الحصول على الصور، واتخاذ الماوس من على خشبة المسرح، وإعادته إلى القفص. استخدام مصباح التدفئة لإبقائه دافئا، ورصد الماوس حتى يصبح واعيا.
تحليل 3. صورة والكمي
- استخدام صورة برامج التحليل لتحليل البيانات 3D والسلاسل الزمنية. فتح البرنامج وإضافة الصور عن طريق سحبها إلى الشاشة مفتوحة، وهو ما يسمى "الساحة" وجهة نظر. انقر نقرا مزدوجا على ملف صورة لفتحه. سيتم فتح صورة تحت النظر "تفوق".
- خلق صورة 2D / 3D.
- من "المزيد" شريط وجدت في أعلى الزاوية اليمنى، انقر فوق "تحرير / مشاهدة تعديل العرض" لفتح "تعديل العرض" نافذة. تحسين عرض مضان عن طريق ضبط عتبات كل قناة، وأخذ لقطة لحفظ الصورة.
- توليد مسارات الكائن باستخدام الوقت الفاصل بين الصور.
- فتح الصورة المراد تحليلها تحت النظر "تفوق". انقر على أيقونة مع صورة من النقاط البرتقالية، وجدت تحت رمز "تفوق". هذا وسوف تفتح "النقاط" نافذة جديدة.
- تحقق من "النقاط المسار (أكثر من الوقت)" وانقر على السهم الأزرق للذهاب إلى الخطوة التالية. حدد القناة التي تحتوي على كائنات لتعقب تحت عنوان "قناة المصدر"، وتعيين diamet كائن يقدرإيه في "قطر XY المقدرة" عن طريق كتابة رقم في. انقر على السهم الأزرق للذهاب إلى الخطوة التالية.
ملاحظة: للحصول على تتبع العدلة، حدد القناة التي تحتوي على APC مضان لالعدلات وتعيين قطر كائن إلى 12 ميكرون على أساس حجم معروفة من العدلات. - في الإطار، والعثور على وحدد "الجودة" مرشح عن طريق النقر على السهم لأسفل. مراقبة المواقع المحددة من قبل البرنامج وضبط عتبة يدويا لتضمين أو استثناء البقع. مرة واحدة يتم تحديد العتبة، انقر على السهم الأزرق للذهاب إلى "تتبع" خطوة.
- تحت خوارزمية، والعثور على وحدد "نماذج الانحدار الحركة خوارزمية" من خلال النقر على السهم لأسفل. نوع في 10 ميكرون ل "المسافة القصوى" و 3 ل "ماكس الفجوة الحجم" وجدت تحت معلمات. التحقق من خارج "سد الفجوات مع جميع الأجسام المكتشفة" لبدء تتبع، وانقر على السهم الأزرق للذهاب إلى الخطوة التالية.
ملاحظة: "خوارزمية الحركة الانحدار" يستخدم وأو الكائنات التي وجهت الحركة، نظرا لأنه يولد المسارات بناءا على الموقع وتوقع من الحركة السابقة. "المسافة القصوى" و "ماكس الفجوة الحجم" يمكن تعديل اعتمادا على البعد المتوقع وسرعة الكائن يجري تعقب، وكذلك المدة الإجمالية للصورة مرور الزمن. - تحت نوع تصفية، حدد "المسار المدة" التصفية. انقر على السهم الأخضر لإنهاء التتبع، والتحقق من المسارات التي تم إنشاؤها. العودة إلى الخطوة السابقة إذا لزم الأمر لفرز المسارات يدويا.
- إذا كان الانجرافات صورة ولدت الوقت الفاصل بين وصحيحة عن الانجراف متعدية.
- انقر على أيقونة مع صورة لقلم رصاص. هذا هو علامة التبويب التحرير الذي يتم فتحه "مسارات تحرير" نافذة. دراسة صورة مرور الزمن والعثور على مكان والمرجعية التي لا ينبغي أن يتحرك لجميع الصور.
- في الزاوية العلوية اليسرى من الشاشة، والعثور على "مؤشر" نافذة والتحقق من خارج "تحديد" لتفعيل مكعبrsor لاختيار بقعة. انقر على الفور المرجعية.
- انقر على "الانجراف الصحيح" في إطار "تحرير المسارات". التحقق من خارج "بالحركة الانجراف". يقوم البرنامج تلقائيا توليد سلسلة تصحيح الصور.
- قياس حركة الخلوية التي تحددها المسارات الكائن في الوقت الفاصل بين الصور.
- تحت النافذة "تحرير المسارات"، تحقق من "المسارات" وحدد المسار الذي يمثل حركة الخلية. سيتم تسليط الضوء على المسار المحدد باللون الأصفر في الصورة السلاسل الزمنية.
- انقر على أيقونة مع صورة من الرسم البياني لفتح "الإحصاء" نافذة (علامة التبويب الإحصائيات).
- تحت عنوان "الاختيار"، حدد "المسار سرعة المتوسط" من خلال النقر على السهم لأسفل لتوليد سرعة المسار يعني بالنسبة للمسار المحدد. اختيار مسارات مختلفة وكرر الخطوات لقياس سرعة المسار تعني لجميع خلايا الفائدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الفئران نخاع العظم الفخذي يتم الوصول بنجاح باستخدام مرحاض لتمكين التصور العدلات الفردية وشبكات الأوعية الدموية. ويبين الشكل 1 الصك مرحاض ويصف العملية الجراحية، التي تنطوي على التعرض للعظم الفخذ وترقق العظام القشرية للوصول البصرية داخل عظم. وجيد التحمل عملية جراحية في الفئران. كانوا تقييمها لردود الفعل الجسدية السلبية، مثل هند أطرافهم تورم وعدم تحمل الوزن على أطرافهم، وتشويه الذات، الهلل والتهاب الجلد، فضلا عن الأضرار التي لحقت مرحاض لمدة 5 أيام بعد الجراحة، مع عدم وجود تقرير من الشدة. والجدير بالذكر أن يبقى نافذة واضحة بصريا لIVM لمدة تصل إلى 40 يوما، والتي قد تمكن تقييم طويل الأجل من التعديلات الخلوية والهيكلية بعد تدخل.
الأوعية الدموية داخل نخاع العظام التي يمكن تصور الأصباغ داخل الأوعية الدموية، مثل FITC-ديكستران(الشكل 2). منذ المقابل يعتمد على حقن الصبغة، تمثل صورة المكتسبة الأوعية الدموية وظيفية حيث يوجد تدفق كمية كافية من الدم. بالإضافة إلى الأوعية الدموية، العدلات يمكن أن تكون ملطخة في الجسم الحي استخدام الألغام المضادة للLy6G الأجسام المضادة. الشكل 3A و 3B تمثل نفس المنطقة من نخاع العظام لوحظ في نقاط زمنية مختلفة، حيث تعتبر العدلات سواء في داخل الأوعية والفضاء خارج الأوعية. وتميزت هذه المناطق المعالم الأوعية الدموية. رودامين 6G يمكن استخدامها كبديل لمكافحة Ly6G وصمة عار العدلات في الجسم الحي. ومع ذلك، فإنه ينشر من الأوعية الدموية والبقع وحيدات في الفضاء خارج الأوعية بطريقة غير محددة. لذلك، يفضل مكافحة Ly6G لأنه يتيح التصوير معين من العدلات. ويمثل الشكل 3C التصوير من العظام القشرية، التي تتألف أساسا من ألياف الكولاجين. عمق القصوى للتصوير تحقيقه في هذه التجربة هو 180 ميكرون (الشكل 3C).
الوقت الفاصل بين مضان التصوير يسهل تتبع والقياس الكمي للحركة الخلوية في الجسم الحي. ويبين الشكل 4A تتبع العدلات في نخاع العظام المتخصصة الأوعية الدموية. التصوير مع عدم وجود فترة زمنية إضافية بين كل فحص يسمح لتتبع دقيق للخلايا. ومع ذلك، هناك حاجة بعض إدخال المستخدم لزيادة تحسين دقة من المسارات التي تم إنشاؤها بواسطة البرنامج. تتبع بقع (أي خلايا الفائدة) تمكن الكمي لمعايير مختلفة، مثل متوسط سرعة المسار (الشكل 4B). غيرها من المعالم التي يمكن قياسها تشمل، ولكنها لا تقتصر على، طول المسار، وتغير في حجم البقعة وشكل وكثافة. يوفر هذا الاختبار الكمي لمختلف المعايير التي تعمل على تحسين خصائص الحركات الخلوية والتفاعلات.
= "1"> 
الشكل 1: عظم الفخذ غرفة نافذة (مرحاض)، مرحلة التصوير وإجراء العمليات الجراحية (A) من صنع مخصص التيتانيوم عظم الفخذ مرحاض مع شريط على شكل حرف U أن يعمل على إصلاح عظم الفخذ في المكان. مرحاض يحمل 8 مم غطاء قطر الزجاج والمضمونة من قبل عصابة مبكرة. (ب) من صنع مخصص مرحلة التصوير. يتم وضع عنصر التسخين في الجزء السفلي من المرحلة للحفاظ على درجة حرارة الفسيولوجية للفأرة أثناء التصوير. وتستخدم مقاطع التمساح اثنين لعقد دورة المياه. (C - H) الإجراء الجراحي لتثبيت مرحاض عظم الفخذ. يتعرض (C) وعظم الفخذ بين العضلة القابضة والباسطة العضلات. لم تتم إزالة العضلات أثناء العملية. (D) يتم وضع شريط على شكل حرف U تحت عظم الفخذ، ويتم تثبيت (E) على مرحاض وتأمينها باستخدام اثنين من المكسرات. يتم تطبيق الاسمنت (F) الأسنان بين العظام ومرحاض لملء الفراغ. (G) والأدمة وخياطة وثابتة (H) غطاء زجاجي في مكان مع حلقة التثبيت. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التصوير مضان 3D من شبكة الأوعية الدموية في النخاع العظمي في الجسم الحي صورة الممثل من الأوعية الدموية في نقي العظام، وتصويرها من خلال مرحاض عظم الفخذ. الأوعية الدموية (الخضراء) هو تصور من قبل ذيل حقن الوريد من 2 نجمة داود الحمراء FITC-ديكستران. مقياس شريط = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تتبع حركة العدلة داخل شبكة الأوعية الدموية من نخاع العظام في الجسم الحي مسارات (A) المسار العدلات ضمن شبكة الأوعية الدموية. يتم إنشاؤها المسارات تلقائيا باستخدام برنامج الذي بني في نماذج الانحدار خوارزمية الحركة. تمثل كل نقطة بيضاء نقطة المركز من الجسيمات التي تتبع (العدلات). شريط النطاق = 50 ميكرون. (ب) يعني سرعة المسار قياس للداخل الأوعية وخارج الأوعية العدلات، مشيرا إلى الاختلاف في حركة العدلات (شريط خطأ = يعني + SD، * ع = 0.0176، اختبار t ثنائي الطرف). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في الوقت الحقيقي، والتصوير التسلسلي للعمليات الخلوية الحيوية في نخاع العظام ويوفر المعلومات التي يتم تحدي خلاف ذلك للحصول على استخدام التقنيات التقليدية مثل الأنسجة وإجمالي تعداد الدم. نموذج WC عظم الفخذ هو موضح هنا يوفر فرصا فريدة لتحقيق التعديلات الخلوية والهيكلية في نخاع العظام مع مرور الوقت. على الرغم من أن نموذج عظم الفخذ مرحاض وقد ذكرت سابقا، لدينا تصميم جديد يوفر مجالا والتصوير أكبر من عرض وأصغر حجم مرحاض العام، والتي هي أكثر توافقا للاستخدام في فئران بالغة. نموذج WC عظم الفخذ يمكن استخدامها في مجموعة متنوعة من سلالات الفئران بما في ذلك مناعيا و / أو الفئران مراسل المعدلة وراثيا.
هناك خطوات حاسمة خلال الجراحة التي تحدد المدة الإجمالية وجودة التصوير. عندما كشف عظم الفخذ، يتم تنفيذ سوى تشريح حادة في العضلات بين العضلات القابضة والباسطة. إزالة هذه العضلات قد يؤدي إلى انخفاض حركة الماوس والمصحفر تجنبها. وعلاوة على ذلك، وطحن العظام القشرية يجب إجراء بعناية. طحن ما يقرب من 50 ميكرون غير كاف للتصوير الضوئي مع الحفاظ على السلامة الهيكلية للشبكة الأوعية الدموية الفخذ. تطبيق الاسمنت الأسنان حول العظام أمر بالغ الأهمية لاغلاق المنطقة تتعرض جراحيا، ومنع تراكم السوائل، والحفاظ على نافذة التصوير الضوئي واضحا لأكثر من شهر في حين أن الحد من مخاطر العدوى. يعمل أيضا الاسمنت الأسنان لإصلاح مرحاض في مكان، ومنع مرحاض من تدور حول عظم الفخذ. وأخيرا، فإن حلقة الخاطف تستخدم لعقد ساترة مناسبة للاستخدام مع عدسة الغمر بالمياه، وتوفير المياه الختم. ينصح حلقة الخاطف على المواد اللاصقة إرفاق ساترة للمرحاض لإضافة المواد اللاصقة قد تزيد من الفجوة بين العظام وساترة، أو وضع ساترة في زاوية طفيف بالنسبة للطائرة التصوير، مما يقلل من عمق الاختراق تحقيقه ل التصوير. علاوة على ذلكوحلقة الخاطف مفيدة عندما تحتاج ساترة لتنظيفها أو تغييرها.
بالإضافة إلى عملية جراحية، وهناك العديد من الخطوات الحاسمة لتحقيق التصوير الضوئي الناجح لنخاع العظام. إلى صورة داخل مرحاض عظم الفخذ، يتم وضع مرحاض أفقيا إلى مرحلة التصوير لغمر الصحيح للعدسة الهدف. مرحلة التصوير حسب الطلب هي مناسبة لهذا الغرض لأنها تتيح للتعديلات من زاوية مرحاض فيما يتعلق العدسة. وعلاوة على ذلك، فإن تصميم مرحاض، وخاصة حجم شريط على شكل حرف U، ويحافظ على العظام في وضع أفقي أقرب إلى ساترة ممكن لتحقيق أقصى قدر من عمق الاختراق. أثناء التصوير، ويمكن ملاحظة التحف التنفس مع خطوط أفقية في الصور مضان. بالإضافة إلى تأمين مرحاض إلى مرحلة التصوير، ودرجة الحرارة من عنصر التدفئة تحت مرحلة التصوير يمكن تعديلها لتدفئة كاف الحيوان للحد من التنفس المفرط. وهناك طبقة رقيقة من الشاشيمكن وضعها بين الماوس ومرحلة ساخنة للمساعدة في تقليل التحف التنفس أثناء التصوير. اعتمادا على الهدف التصوير البيولوجي، المعلمات اقتناء مثل معدل الإطار، حجم التصوير ومدة التصوير يمكن أيضا تعديلها لجمع الصور كافية لمعالجة المسائل التجريبية. على سبيل المثال، سرعة الهجرة العدلة والزحف قد تختلف تحت ظروف تجريبية مختلفة، من 2.8 ميكرون / دقيقة لالعدلات المقيمين في ظل الظروف القاعدية لتتراوح في أي مكان 5-10 ميكرون / دقيقة لالعدلات في ظل ظروف التهابات 19-21. وهكذا، وسرعة التصوير المناسبة ومدة تتبع العدلة في الجسم الحي من شأنه أيضا أن تختلف بناء على الظروف التجريبية. وبالإضافة إلى ذلك، كما يتضح من نتائج، وتتبع من الخلايا داخل الأوعية الدموية سوف تحتاج إلى كاميرا التصوير السريعة مع معدل الإطار عالية (30 لقطة / ثانية). ومع ذلك، إذا كانت الخلايا المستهدفة يقيمون في الفضاء خارج الأوعية، أو إذا كان interactio خلية إلى خليةومن المتوقع أن تحدث ببطء أكثر، ينبغي إعطاء الأولوية جودة الصورة على سرعة التصوير ن من الفائدة.
ويجب أيضا النظر تأثير الأجسام المضادة حقن في الجسم الحي الخلية تلطيخ على وظيفة الخلوية. في دراستنا، استخدمنا-Ly6G مكافحة الأجسام المضادة (1A8 استنساخ)، والتي عادة ما تستخدم في جرعات عالية (150-250 ميكروجرام) في استنزاف العدلات من التداول ودراسة دورها في نماذج الأمراض المختلفة. أظهرت Yipp وKubes التي وصفت تألقي مكافحة Ly6G الأجسام المضادة لا يعطل التوظيف الكريات البيض في الجرعات المنخفضة داخل الأوعية الدموية حقن (1-40 ميكروغرام) 22. ومع ذلك، تشير دراسة حديثة أن fluorochromes، وجود اختلافات كبيرة في الكتلة الجزيئية والتركيب الكيميائي، يمكن أن تؤثر بشكل مختلف وظيفة مضادة للLy6G 23. أوضحت الدراسة أن FITC المسمى مكافحة Ly6G، ولكن ليس PE- والأجسام المضادة APC المسمى، يستنزف بشكل فعال العدلات في الجسم الحي بتركيز منخفض (30 ميكروغرام).في دراستنا، ونحن لم نلاحظ العدلات العمل الإضافي استنزاف باستخدام 4 ميكروغرام من المسمى APC-مكافحة Ly6G. ومع ذلك، هناك حاجة إلى مزيد توصيف وظيفة المسمى تألقي مكافحة Ly6G الأجسام المضادة في الجسم الحي للتحقق من صحة استخدامه في التصوير حيوي داخلي. هذا ينطبق أيضا على الأجسام المضادة الأخرى التي لديها القدرة الوظيفية لتغيير التفاعلات الخلوية. كبديل لفي الجسم الحي الخلية تلطيخ مع الأجسام المضادة، المعدلة وراثيا مراسل الفئران 24 و / أو خلايا فلوري المسمى 25 يمكن استخدامها لتصور العدلات أو غيرهم من السكان خلية من الاهتمام في الجسم الحي.
نموذج عظم الفخذ مرحاض الموصوفة في هذا البروتوكول يتيح التصوير لمدة تصل إلى 40 أيام بعد الجراحة. بعض التحديات للتصوير المدى الطويل باستخدام هذا النموذج مرحاض تشمل عملية التئام العظام تأخر وصيانة نافذة زجاجية نظيفة. وتجدر الإشارة إلى أننا لم نلاحظ علامات التئام العظام واضحا بعد زرع مرحاض، التي من شأنها امبالبريد سماكة السمحاق. هذا لم يكن غير متوقع بالنظر إلى أن عملية التئام العظام يحدث عادة بعد 1 ½ 3 أشهر 26،27. صيانة نافذة نظيفة وبصريا واضحة لا يمكن أن يتحقق من تطبيق الاسمنت الأسنان، واستخدام حلقة الخاطف وساترة والتي توفر حازم المياه الختم مع النسيج. ساترة يمكن تنظيفها من حين لآخر مع نصائح القطن من الخارج لإزالة الغبار والحطام. مرحاض يحتوي على حقل التصوير واسعة، تغطي تقريبا طول المنطقة diaphysis (حوالي 8،4-8،6 مم 28)، مما يجعله يتفوق على نموذج نشرت سابقا 18. ومع ذلك، والوصول إلى المناطق البعيدة وتجويف نخاع أعمق محدودة. على وجه الخصوص، والكردوس-تربيقية الغنية، وتقع في نهايات البعيدة للdiaphysis، ومن المعروف أن تكون غنية في HPSCs 29. ويمكن الوصول إلى هذه المناطق تشريحيا، أو عن طريق IVM كإجراء نهائي. بدلا من ذلك، طرائق التصوير المختلفة مثل شركات الصغيرةuted التصوير المقطعي يمكن استخدامها لصورة المناطق البعيدة للنخاع العظام في الجسم الحي 30. هذه الأساليب هي مكملة لIVM، وتوفير نهج متكامل لتقييم التشريح ومختلف التعديلات الخلوية والهيكلية والتفاعلات داخل نخاع العظام.
بروتوكول الموصوفة هنا يقدم نهجا جديدا لتقييم المكانية والزمانية على المدى الطويل من نخاع عظم الفخذ لدى الفئران في قرار الخلوية. الأساليب المقدمة تمكن في التصوير التسلسلي الجسم الحي لتعقب تحركات خلية واحدة أو السكان الخلوي على جداول الزمنية ذات الصلة من الناحية البيولوجية، في حين أن الحصول على المعلومات في وقت واحد الهيكلية والوظيفية للنخاع العظام. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء تحليل الصور الكمي لمزيد من تميز التعديلات الخلوية والوظيفية، مثل تتبع الحركات الخلوية. تطبيق هذا النموذج مرحاض عظم الفخذ في سلالات مختلفة من الفئران، لا سيما في الفئران المعدلة وراثيا مراسل 31،قد تزيد من تمكين التحقيق في العديد من السكان الخلية المسمى بشكل فردي مثل المتورطين في تكون الدم. ولذلك، فإن بروتوكول وصف ينطبق على نطاق واسع لمجموعة واسعة من الدراسات قبل السريرية التي تنطوي على العمليات البيولوجية المختلفة داخل نخاع عظام الفئران الحية، بما في ذلك التحقيقات في تكون الدم، وسرطان الدم، وزرع HPSC، وتنظيم جهاز المناعة، المكروية نخاع العظام (على سبيل المثال، المتخصصة ميتة) و مساهمة من الخلايا المناعية لتطور الورم والانبثاث.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر مرفق المتقدم بصري المجهر (www.aomf.ca) في الشبكة الصحية الجامعية للمساعدة مع المجهر، والسيد جيسون ايليس من الأميرة مارغريت مركز سرطان محل آلة لتصنيع مرحاض ومرحلة التصوير. كما نود أن نشكر الدكتور ايريس Kulbatski لتحرير مخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NRCNU-F athymic nude mice | Taconic | Ncr nude | 8-10 weeks old, female |
| Saline | Baxter | JB1302P | |
| Ketamine hydrochloride | Bioniche Animal Health Canada, Inc. | DIN 01989529 | |
| Xylazine | Bayer HealthCare, Bayer Inc. | DIN 02169592 | |
| Surgical drape | Proxima | DYNJP2405 | |
| Electric heating pad | Life Brand | 57800827375 | |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M60 | |
| Eye ointment (tear gel) | Novartis | T296/2 | |
| 7.5% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-151-16 | |
| 70% isopropyl alcohol | GreenField | P010IP7P | |
| 10% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-150-05 | |
| Scalpel handle (#3) | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blade (#15) | VWR | 89176-368 | |
| Spring Scissors curved | Fine science Tools | 15023-10 | |
| Baby-Mixter Hemostat | Fine science Tools | 13013-14 | |
| Fine Scissors | Fine science Tools | 14094-11 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine science Tools | 11151-10 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats | Fine science Tools | 13008-12 | |
| Micro-drill | Harvard Apparaus | 72-6065 | |
| Micro-drill burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | |
| Femur window chamber | PMCC machine shop | custom design | 9.1 mm- 8.5 mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9 mm (distance between two holes), 0.7 mm (thickness) |
| U-shaped bar | PMCC machine shop | custom design | 13.8 mm (length), 1.6 mm (width), 3.7 mm (height) |
| Coverglass (8 mm) | Warner Instruments | HBIO 64-0701 CS-8R | |
| Retaining ring (8 mm) | ACKLANDS GRAINGER | UNSPSC # 31163202 | |
| Nuts (hexagon stainless steel) | Fastenal | 70701 | |
| Dental cement | 3M | RelyX U200 | |
| Suture (5-0 Monosof black) | Covioien | SN-5698 | |
| Halsey needle holder | Fine Science Tools | 12501-13 | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Reckitt Benckiser | DIN 0281251 | |
| Meloxicam (Metacam) | Boehringer Ingelheim | DIN 02240463 | |
| Amoxicillin (Clamavox) | Pfizer | DIN 02027879 | |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD2000S | |
| APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1) | eBioscience | 17-9668 | |
| Two-photon microscope LSM 710 | Carl Zeiss | Zeiss LSM 710 NLO | |
| Imaging stage | PMCC machine shop | custom design | 15.9 cm (length), 11 cm (width), 0.9 cm (height) |
| Imaris software | Bitplane | Imaris 8.0 | Image analysis software described in Section 3 of the Protocol |
| Zen 2012 | Zeiss | Zen 2012 | Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol |
References
- Zhao, E., et al. Bone marrow and the control of immunity. Cell Mol Immunol. 9 (1), 11-19 (2012).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J Leukoc Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
- Fridlender, Z. G., Albelda, S. M. Tumor-associated neutrophils: friend or foe? Carcinogenesis. , (2012).
- Fridlender, Z. G., et al. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: 'N1' versus 'N2 TAN. Cancer Cell. 16 (3), 183-194 (2009).
- Coffelt, S. B., et al. IL-17-producing [ggr][dgr] T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis. Nature. 522 (7556), 345-348 (2015).
- Kitamura, T., Qian, B. Z., Pollard, J. W.
- Granot, Z., et al. Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung. Cancer Cell. 20 (3), 300-314 (2011).
- Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicol Pathol. 34 (5), 548-565 (2006).
- Pittet, M. J., Weissleder, R.
- Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging. IntraVital. 3 (2), e29917 (2014).
- Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. (96), e52476 (2015).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic Progenitor Cell Rolling in Bone Marrow Microvessels: Parallel Contributions by Endothelial Selectins and Vascular Cell Adhesion Molecule 1. J. Exp. Med. 188 (3), 465-474 (1998).
- Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow. J. Vis. Exp. (91), e51683 (2014).
- Lassailly, F., Foster, K., Lopez-Onieva, L., Currie, E., Bonnet, D. Multimodal imaging reveals structural and functional heterogeneity in different bone marrow compartments: functional implications on hematopoietic stem cells. Blood. 122 (10), 1730-1740 (2013).
- Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo. Methods Mol Biol. 750, 215-224 (2011).
- Balan, M., Kiefer, F. A novel model for ectopic, chronic, intravital multiphoton imaging of bone marrow vasculature and architecture in split femurs. IntraVital. 4 (2), e1066949 (2015).
- Hansen-Algenstaedt, N., et al. Femur window--a new approach to microcirculation of living bone in situ. J Orthop Res. 23 (5), 1073-1082 (2005).
- Xu, N., Lei, X., Liu, L. Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy. J. Vis. Exp. (55), e3296 (2011).
- Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
- Bucher, K., et al. Fluorescent Ly6G antibodies determine macrophage phagocytosis of neutrophils and alter the retrieval of neutrophils in mice. J Leukoc Biol. 98 (3), 365-372 (2015).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), (2013).
- Koewler, N. J., et al. Effects of a Monoclonal Antibody Raised Against Nerve Growth Factor on Skeletal Pain and Bone Healing After Fracture of the C57BL/6J Mouse Femur. J. Bone Miner Res. 22 (11), 1732-1742 (2007).
- Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).
- Liu, K., et al. A murine femoral segmental defect model for bone tissue engineering using a novel rigid internal fixation system. J Surg Res. 183 (2), 493-502 (2013).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
- Vacaru, A., Vitale, J., Nieves, J., Baron, M. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. Singh, S. R., Coppola, V. 1194, Springer. New York. 289-312 (2014).
