Introduction
Das Knochenmark ist ein wichtiges Organ beteiligt bei der Hämatopoese und Immunregulation. Es besteht aus einem hämatopoetischen Komponente hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) und einem stromal Komponente , die nicht-hämatopoetischen Vorläuferzellen enthält, die zu Mesenchymzellen 1 ergeben. Zwei Drittel der hämatopoetischen Aktivität wird 2 auf die Erzeugung von myeloischen Zellen gewidmet. Insbesondere kann eine große Anzahl von Neutrophilen werden im Knochenmark produziert, mit 1-2 x 10 11 pro Tag erzeugten Zellen in einem normalen erwachsenen Menschen 2. Neutrophile sind die erste Verteidigungslinie gegen mikrobielle Infektionen und sind meist im Knochenmark reserviert , bis Stress ihre Mobilisierung löst peripheren Neutrophilen 1,3 zu ergänzen. Zusätzlich zu ihrer anti-mikrobiellen Wirkung, legen neuere Studien eine wichtige Rolle der Neutrophilen in der Krebsbiologie, sowohl pro- und mit anti-tumorigenen Phänotyp in Abhängigkeit von den transformierenden WachstumsFaktor beta (TGF-β) Signalisierung im Tumormikromilieu 4,5. Darüber hinaus zeigten Studien , dass Neutrophile , die in primären Tumoren anreichern ausüben pro-tumorigenen und metastatischen Wirkungen , die durch die zytotoxische Funktion von T - Zellen zu unterdrücken 6,7, während Neutrophilen im Umlauf eine zytotoxische, anti-metastatischen Effekt 8 ausüben. Als solche Untersuchung von hämatopoetischen Zellen im Knochenmark, insbesondere Neutrophilen, ist entscheidend ihre Rolle Regulierung in Immun- und Tumor Aufklären.
Histopathologie und eine vollständige periphere Blutbild werden routinemßig 9 auszuwerten zelluläre und strukturelle Veränderungen im Knochenmark verwendet. Jedoch liefern diese Verfahren nur statische Informationen von verschiedenen Zellpopulationen oder Gewebemikrostrukturen. Längs in vivo Bildgebung kann mit den Standardverfahren in Kombination verwendet werden , um die Dynamik mehrerer zellulärer, vaskulären und stromalen Komponenten sowie von Zelle zu c zu beurteilenell-Wechselwirkungen in einer Längs Weise. Intravitalmikroskopie (IVM), definiert als Bildgebung der Tiere bei mikroskopischer Auflösung 10, leben , ist besonders nützlich für die in der gleichen Probe dynamische zelluläre Prozesse über die Zeit der Beurteilung, die Anzahl der Versuchstier erforderlich ist, verringert. IVM wird oft mit einer chronisch transplantierten Fensterkammer (WC) kombiniert, um das Organ von Interesse für die Bildgebung über einen Zeitraum von Wochen bis Monaten zuzugreifen. Schädel- und Rücken-skinfold WC-Modelle haben die längste Geschichte der Verwendung bis in die Mitte der 1990er Jahre zurückgehen. In jüngerer Zeit andere organspezifische WC Modelle wie diejenigen des Brustfettpolster und verschiedenen Unterleibsorgane wurden 11 entwickelt.
Der typische Ansatz für die Bildgebung Knochenmark in vivo hat in erster Linie beteiligt Exposition der Schädelkalotte von Mäusen, in denen die ausgedünnten Knochen 14.12 direkte Visualisierung von Einzelzellen mit minimalen chirurgischen Eingriff ermöglicht. Jedoch kann der Calvaria bone marrow be verschieden von der anderer Knochen, wie beispielsweise die langen Knochen, wie durch eine geringere Anzahl von HSPCs und hypoxischen Zellen in Calvaria gezeigt, die 15 Wartung und Entwicklung von HSPCs reduziert anzeigt. Daher, alternative Ansätze für die Zellkomponenten in dem langen Knochen der Beurteilung untersucht. Dazu zählen direkte Exposition des Oberschenkelknochenmark 16 und ektopische Transplantation von Spalt Femur in der Rückenhaut WC 17. Jedoch ist die erstere eine Terminal Verfahren, das nicht Verfolgen von zellularen, strukturelle und funktionelle Veränderungen über längere Zeiträume erlaubt es, letztere wahrscheinlich stört die normale Knochenmarksfunktion aufgrund der Transplantation von Femur zu einer ektopischen Stelle innerhalb der dorsalen skinfold WC. Ein anderes Verfahren, das orthotope serielle Bildgebung von femoralen Knochenmark über die Zeit ermöglicht, ist die Verwendung eines WC in den Oberschenkelknochen. Ein früherer Bericht zeigte langfristige Bildgebung der Mikrozirkulation in der Oberschenkelknochenmark ein mitFemur WC in Mäusen 18. Darüber hinaus zeigten die Autoren Visualisierung von Tumorzellen in dem Femur, was anzeigt, seine Nützlichkeit in marrow Metastasierung Überwachung Knochen. Allerdings wurde diese WC-Design beschränkt durch seine Größe (1,2 cm Durchmesser) und relativ kleinen Abbildungsbereich (4 mm Durchmesser), die nur geeignet für große Mäuse war (26-34 g, 3-6 Monate alt) wodurch die Ansatz unpraktisch für den Routineeinsatz.
Daher ist ein neues WC mit einer kleineren Gesamtgrße und größeren Innenabbildungsbereich wurde für die Zwecke dieser Studie entwickelt. Das Ziel dieser Studie war es, ein Verfahren bereitzustellen für verschiedene Zelltypen in dem femoralen Knochenmark-Bildgebung. Das Femur WC-Modell wurde im Haus entwickelt und wurde verwendet, Neutrophile innerhalb des 3D-Gefäßnetz zu visualisieren und zu verfolgen. Unter Verwendung dieses Modells IVM des Knochenmarks kann seriell über 40 Tage durchgeführt werden. Dieser Ansatz kann zur Erläuterung der Prozesse der Hämatopoese, Immunregulation eine auf einer Vielzahl von Gebieten angewendet werden,nd Tumorentwicklung.
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Protocol
HINWEIS: Bei allen Tier Arbeit wurde unter Protokoll # 2615 von der University Health Network Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt durchgeführt.
1. Chirurgische Vorbereitung der Maus
- Vor der Operation sterilisieren alle chirurgischen Instrumente und die Fensterkammer (WC) durch Autoklavieren. Ergänzen Sie die Trinkwasser mit 50 mg / kg Körpergewicht von Amoxicillin 2 Tage vor der Operation. Injizieren Sie die Maus mit 0,1 mg / kg Körpergewicht von Buprenorphin intraperitoneal 4 Stunden vor der Operation.
- Anesthetize die athymischen Nacktmaus durch intraperitoneale Injektion von 350-400 & mgr; l Salzlösung, die 80 mg / kg Ketamin und 13 mg / kg Xylazin (Hinweis: Diese von der Institutional Animal Care Committee genehmigt wurde, und wir haben keine Erfahrung mit negativen Auswirkungen gehabt ). Bestätigen Sie die richtige Anästhesie durch die Prüfung für Fussreflex. Weiter für Atmungsmuster, Schleimhautfarbe und Fussreflex während des Verfahrens zu beobachten.
- Führen Sie die chirurgische procedures unter einem Biosicherheitsschrank sterilen Bedingungen während der Operation zu erhalten. Platzieren Sie die Maus auf einem elektrischen Heizkissen mit einem Operationstuch bedeckt auf Körpertemperatur während der Operation erhalten. Führen Sie alle chirurgischen Eingriffe unter dem Stereomikroskop.
- Tragen Sie Augensalbe, die Augen während der Operation feucht zu halten. Wiederholen erforderlich, wenn während des chirurgischen Eingriffs. Sterilisieren der Arbeitsbereich der Maus, indem sie mit 7,5% Povidon-Iod Abwischen, 70% Isopropylalkohol und 10% Povidon-Iod nacheinander und zweimal wiederholen dieses Verfahren.
- Machen Sie eine 10 mm Längshautschnitt unter Verwendung von Skalpell mit einer Klinge (15 #), den Oberschenkelknochen von der lateralen Seite nähert. Setzen Sie die Oberschenkelknochen zwischen den Beuge- und Streckmuskeln durch stumpfe Dissektion Pinzette und hemostats mit Muskel-Funktionalität zu gewährleisten.
- Legen Sie die U-förmigen Leiste unter dem Knochen, und installieren Sie das WC (Abbildung 1). Sichern Sie die Bar mit dem Fenster mit zwei Muttern und ziehen Sie die Muttern mit fürCEPS. Füllen Sie den Raum zwischen dem Knochen und dem WC mit Zahnzement.
- Abzuschleifen den kortikalen Knochen in einer 6 x 2 mm 2 Bereich mit einem Mikrobohrer optischen Zugang zur Markhöhle zu gewinnen.
Hinweis: Überprüfen Sie sorgfältig Verdünnung der kortikalen Knochen unter dem Mikroskop, während der Durchführung dieses Verfahrens. Lassen Sie eine intakte, fast transparente Periostschicht des Knochens. - Legen Sie die 8 mm Deckglas auf das Fenster, und sichern Sie das Deckglas mit einem Sprengring zu halten, an Ort und Stelle.
- Stellen Sie die Muskulatur der Beuger und Strecker wieder an ihren ursprünglichen Standorten mit einer Zange mit ihrer Funktion nach der Operation zu erhalten. Nähen Sie die Dermis mit 5-0 Naht und einen Nadelhalter.
- Überwachen Sie die Maus für die Wiederherstellung, bis er bei Bewusstsein ist und in der Lage, sich frei zu bewegen. Legen Sie das Tier in einen neuen Käfig, wenn erholt.
- Nach der Wiederherstellung der Bildaufnahme auf das Tier noch am selben Tag oder den folgenden Tagen (siehe Abschnitt 2) durchführen. Überwachen Sie die physical Zustand täglich der Maus.
Hinweis: Überwachen physikalischen Bedingungen, wie Gewicht auf Glied trägt, krümmte, schnellen oder flache Atmung, Hinterbeinschwellungen, Selbstverstümmelung, Cellulitis und schwere Dermatitis. - Geben intraperitoneale Injektion von 0,1 mg / kg Körpergewicht von Buprenorphin für 3 Tage und 1 mg / kg Körpergewicht von Meloxicam für 5 Tage nach der Operation für die Behandlung von postoperativen Schmerzen und Entzündungen. Weiter die Amoxicillin-ergänzt Wasser für 5 Tage bietet.
- Am experimentellen Endpunkt, einschläfern das Tier von CO 2 Narkose durch eine sekundäre Methode gefolgt (zB Zervikaldislokation).
2. Bildaufnahme mit kombinierten Multi-Photonen-und konfokale Mikroskopie
- Vor der Bebilderung, betäuben die Maus durch intraperitoneale Injektion einer 350-400 & mgr; l Kochsalzlösung, die 80 mg / kg Ketamin und 13 mg / kg Xylazin. Alternativ können inhalierbare Anästhetikum, wenn verfügbar.Bewerben Augensalbe.
- Injizieren Sie die Mischung aus intravaskuläre Farbstoffe zur Markierung von Gefäßen (0,65 mg 2 MDa Fluorescein (FITC) -Dextran) und Neutrophilen (4 ug Allophycocyanin (APC) -Anti-Ly6G Antikörper).
- Verwenden ein aufrechtes kombinierten Multiphotonen und konfokalen Mikroskop, ausgestattet mit einem Multiphotonen-Laserentfernungs 705-980 nm für die Zweiphotonenanregung sowie Einzelphotonen Laser, die Anregungswellenlängen von Blau bis Rot liefert.
- Stellen Sie eine maßgeschneiderte Abbildungsstufe auf das Mikroskop (Abbildung 1B). Sichern Sie die Maus auf der Bühne durch die beiden Enden des WC-Klemm mit Krokodilklemmen.
Hinweis: Kritische Komponenten der Phase sind: zwei Krokodilklemmen die WC zu halten, und ein Heizelement physiologischen Temperatur (37 ° C) der Maus, während der Bildgebung zu erhalten. - Schalten Sie die Zwei-Photonen-Laser und dem konfokalen System, und starten Sie die Bildaufnahme-Software von "Start System" klicken. Ein Fenster mit vier Registerkarten (Suchen,Beschaffung, Bearbeitung und Wartung) wird geöffnet.
- Legen Sie die Imaging-Kanäle. Klicken Sie auf "Smart Setup" unter dem Acquisition Registerkarte und wählen Sie die Farbstoffe, die für die Bildgebung verwendet werden: FITC (488 nm Anregung, 493-588 nm Emission) und APC (633 nm Anregung und 638 bis 743 nm Emission). Wählen Sie "Beste Signal" und klicken Sie auf "Übernehmen".
- Fügen Sie die Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) Bildakquisitionskanal manuell. Schalten Sie die Zwei-Photonen-Laser unter dem "Laser" Fenster in der Acquisition Registerkarte. Unter der Kanäle-Fenster klicken Sie auf das "+" Zeichen einen Titel hinzuzufügen.
- Stellen Sie die SHG-Spur auf. Ändern Sie die Wellenlänge 840 nm unter Kanäle Fenster, die nach oben und unten Pfeile, und wählen Sie den Erfassungsbereich von 415 bis 425 nm unter "Light Path" Fenster, um die Schieberegler verwenden.
- Klicken Sie auf "Okulare Online" unter der Registerkarte Suchen. Klicken Sie auf FITC unter der Filtereinstellung für FITC den Bereich von Interesse zu betrachten und stellen Sie den Fokus manuell durch Drehen ter Fokusknopf auf der Seite des Mikroskops. Wenn die Region von Interesse befindet, klicken Sie auf "Okulare offline" unter der Registerkarte Suchen.
- Klicken Sie auf die Registerkarte Acquisition. Wählen Sie FITC Spur unter Kanäle Fenster und klicken Sie auf "Live", um das Bild von FITC-Dextran mit 5X Ziel der Vorschau anzeigen. Stellen Sie den Fokus, wenn nötig, und klicken Sie auf "Stop" unter Acquisition Registerkarte um die Vorschau zu stoppen.
- drehen manuell zu 20X Wasser Ziel durch ein Rad über den Linsen zu bewegen. Sehen Sie das Bild wieder für FITC-Dextran die 20x-Objektiv mit und stellen Sie Master Gain und Pinhole unter der Kanäle Fenster optimales Signal und Kontrast zu erzielen. Wiederholen Sie für andere Kanäle, indem Sie APC und SHG-Tracks unter dem TV-Fenster.
- Wählen Sie die Bildparameter. Klicken Sie auf "Erfassungsmodus" das Fenster zu öffnen. Stellen Sie die Bildgröße 1.024 x 1.024 Pixel zu sein, und Mittelung von 4X Bilder in hoher Qualität zu erhalten.
- Erwerben Sie eine 2D-Snapshot. Wählen Sie alle Kanäle unter Kanäle gewinnenund dow klicken Sie auf "Snap" unter dem Reiter Acquisition. Prüfen Sie die Qualität des Bildes und Bildparameter ändern, wenn nötig.
- Erwerben Sie 2D-Zeitraffer-Bild.
- Check "Time Series" in der Acquisition Registerkarte aus der Zeitreihenfenster zu öffnen. Geben Sie in 0 unter den Intervallen, und 40 für Gesamtzahl der Scans 40 Bilder kontinuierlich ohne Zeitintervall zu nehmen.
Hinweis: 40 Scans etwa 5 Minuten lange Zeitreihen mit einer Scan-Geschwindigkeit von 7,5 sec / Rahmen und der Bildgröße von 600 um x 600 um erzeugt. Die Zeitabstände und die Anzahl von Abtastungen auf dem Mikroskop abhängig, Bildaufnahme-Einstellungen und der Bildrate der Kamera. Eine feste Intervallzeit (> 0 sec) verwendet werden können Zeitrafferbilder aufgenommen zu verschiedenen Zeitpunkten zu vergleichen. Eine längere Zeitraffer-Bildgebung Dauer kann in Abhängigkeit von der erwarteten durchschnittlichen Geschwindigkeit von neutrophilen Granulozyten (oder andere Zellen von Interesse) in der experimentellen Bedingungen erforderlich.
- Check "Time Series" in der Acquisition Registerkarte aus der Zeitreihenfenster zu öffnen. Geben Sie in 0 unter den Intervallen, und 40 für Gesamtzahl der Scans 40 Bilder kontinuierlich ohne Zeitintervall zu nehmen.
- Erwerben Sie 3D-Bild.
- Check "Z-Stack" in der Acquisition Registerkarte aus der Z-Stack-Fenster zu öffnen. Starten Sie den "Live" Vorschaumodus für FITC-Dextran. Konzentrieren Sie sich auf der Oberseite der Probe und klicken Sie auf "Set First", und konzentrieren sich auf das andere Ende der Probe und klicken Sie auf "Set Last" in der Z-Stack-Fenster.
- Legen Sie das Intervall 10 & mgr; m unter dem Z-Stack-Fenster sein. In Abhängigkeit von der ersten und der letzten in dem vorhergehenden Schritt ausgewählte optische Scheibe, wird diese 10-20 Scheiben erzeugen, mit optischen Gesamtdicke von 90-180 um auf.
Hinweis: Die z-Stapelintervall von der Größe des Pinholes abhängig ist, die die Dicke der optischen Scheibe bestimmt. Das Intervall kleiner sein als die Dicke der optischen Schicht. - Klicken Sie auf "Start Experiment" unter der Registerkarte Acquisition sammeln Bilder zu starten.
- Erwerben Sie 3D-Zeitraffer-Bild.
- Check "Time Series" und "Z-Stack" in der Acquisition Registerkarte aus der Zeitreihe zu öffnenund die Z-Stapel-Fenster.
- Richten Sie die Zeitreihe und Z-Stapelaufnahmeparameter wie in den Schritten 2.14 und 2.15 beschrieben. Klicken Sie auf "Start Experiment" unter der Registerkarte Acquisition sammeln Bilder zu starten.
- Überwachen Sie die Maus während der Bildgebung, um sicherzustellen, es stabil und bewusstlos ist. Wenn die Maus während der Bildgebung instabil und / oder bei Bewusstsein ist, entfernen Sie die Maus von der Bühne, injizieren zusätzliche 100-150 ul der Anästhesielösung intraperitoneal und Bildgebung fortzusetzen.
Hinweis: Zeichen der Instabilität sind schnelle Atmung und Bewegung der Maus, die als Verschiebung Artefakte in aufgenommenen Bildern zu sehen ist. - Nach der Bildaufnahme, nehmen Sie die Maus von der Bühne und wieder in den Käfig. Verwenden Sie eine Heizlampe es warm zu halten, und überwachen Sie die Maus, bis er bei Bewusstsein ist.
3. Bildanalyse und Quantifizierung
- Verwenden Sie die Bildanalyse-Software, um die 3D-und Zeitreihendaten zu analysieren. Öffnen Sie die Software undBilder hinzufügen, indem Sie sie in den offenen Bildschirm ziehen, die "Arena" Ansicht aufgerufen wird. Klicken Sie doppelt auf eine Bilddatei, es zu öffnen; das Bild wird unter "Surpass" Ansicht geöffnet werden.
- Erstellen Sie ein 2D / 3D-Bild.
- Von der "Mehr" Bar auf der oberen rechten Ecke gefunden, klicken Sie auf "Bearbeiten / Show Anzeige Einstellung" "Display-Einstellung" Fenster zu öffnen. Optimieren Sie die Fluoreszenz-Anzeige durch die Schwellenwerte für jeden Kanal eingestellt wird, und eine Momentaufnahme um das Bild zu speichern.
- Generieren Objektspuren mit Zeitraffer-Bilder.
- Öffnen Sie das Bild analysiert werden unter "Surpass" Ansicht. Klicken Sie auf das Symbol mit einem Bild der orange Punkte, unterhalb der "Surpass" Symbol gefunden. Dadurch wird eine neue "Spots" Fenster zu öffnen.
- Überprüfen Sie "Track Spots (over Time)" und klicken Sie auf den blauen Pfeil ab, um zum nächsten Schritt zu gehen. Wählen Sie den Kanal, die Objekte enthalten, unter "Source Channel" zu verfolgen, und stellen Sie die geschätzte Objekt diameter unter "Geschätzte XY Durchmesser" durch eine Zahl in der Eingabe. Klicken Sie auf den blauen Pfeil, um den nächsten Schritt zu gehen.
Hinweis: Für die Neutrophilen-Tracking, wählen Sie den Kanal enthält APC Fluoreszenz für Neutrophile und stellen Sie den Objektdurchmesser bis 12 um basierend auf der bekannten Größe von Neutrophilen. - In dem Fenster finden und "Qualität" Filter auswählen, indem Sie auf den Pfeil nach unten klicken. Beachten Sie die von der Software definierten Stellen und stellen Sie die Schwelle manuell ein- oder Flecken auszuschließen. Sobald Schwelle definiert ist, klicken Sie auf den blauen Pfeil, um das "Tracking" Schritt zu gehen.
- Bei Algorithmus, zu finden und "Autoregressiven Motion-Algorithmus" auswählen, indem Sie auf den Pfeil nach unten klicken. Typ in 10 & mgr; m für "Max Distance" und 3 für "Max Gap Size" unter Parameter gefunden. Abhaken "Lücken füllen mit allen erfassten Objekte" Tracking zu starten, und klicken Sie auf den blauen Pfeil, um den nächsten Schritt zu gehen.
Hinweis: "Autoregressiven Bewegung Algorithmus" verwendet wird foder Objekte, die Bewegung gerichtet haben, da sie Spuren erzeugt aus früheren Bewegung auf den vorhergesagten Standort. "Max Distance" und "Max Gap Size" kann auf der erwarteten Dimension und Geschwindigkeit des Objekts angepasst werden, je verfolgt wird, sowie die Gesamtdauer des Zeitraffer-Bild. - Unter Filtertyp, wählen Sie den Filter "Track Dauer". Klicken Sie auf den grünen Pfeil Verfolgung zu beenden, und überprüfen Sie die Tracks, die generiert wurden. Gehen Sie zurück zum vorherigen Schritt bei Bedarf manuell die Titel sortieren.
- Wenn die erzeugten Zeitraffer-Bildverwehungen, richtig für die translationale Drift.
- Klicken Sie auf das Symbol mit einem Bild von einem Bleistift. Dies ist ein Register für das Editieren, die "Titel bearbeiten" öffnet sich. Untersuchen Sie die Zeitraffer-Bild und eine Referenzpunkt finden, die nicht für alle Bilder bewegen sollte.
- In der linken oberen Ecke des Bildschirms finden "Pointer" Fenster und abhaken "Select" die cu zu aktivierenRSOR einen Platz für die Auswahl. Klicken Sie auf die der Referenzpunkt.
- Klicken Sie auf "Richtig Drift" im "Edit Tracks" Fenster. Abhaken "Translational Drift". Die Software wird die korrigierte Reihe von Bildern automatisch generieren.
- zelluläre Bewegung durch die Objektspuren im Zeitraffer Bilder definiert messen.
- Unter dem "Titel bearbeiten" Fenster, abhaken "Tracks" und eine Spur wählen, die die Bewegung einer Zelle darstellt. Der ausgewählte Titel wird in gelb in der Zeitreihen-Bild hervorgehoben.
- Klicken Sie auf das Symbol mit einem Bild eines Graphen, der die "Statistik" Fenster (Registerkarte Statistik) zu öffnen.
- Unter "Auswahl", wählen Sie "Spur-Drehzahl-Mittelwert", indem Sie auf den Pfeil nach unten klicken, die Bahngeschwindigkeit für die ausgewählte Spur bedeuten zu erzeugen. Wählen Sie verschiedene Tracks und die Schritte wiederholen, um die Bahngeschwindigkeit für alle Zellen von Interesse bedeuten messen.
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Representative Results
Murine femoral bone marrow erfolgreich zugegriffen , um die WC Verwendung Visualisierung einzelner Neutrophilen und Gefäßnetze zu ermöglichen. Figur 1 zeigt das WC Instrument und beschreibt die chirurgische Prozedur, die Exposition des Oberschenkelknochens und Ausdünnung der Kortikalis beinhaltet optischen Zugang im Inneren des zu gewinnen Knochen. Die Operation wird in den Mäusen gut vertragen; sie wurden für 5 Tage für negative körperliche Reaktionen, wie der hinteren Gliedmaßen Schwellung, nicht-Gewicht Lager auf Glied, Selbstverstümmelung, Cellulitis und Dermatitis, sowie Schäden an der WC beurteilt nach der Operation, ohne Bericht der Not. Bemerkenswert ist, bleibt das Fenster optisch klar für IVM für bis zu 40 Tage, die auch nach einer Intervention langfristige Beurteilung der zellulären und strukturellen Veränderungen können zu ermöglichen.
Vaskulatur im Knochenmark kann durch intravaskuläre Farbstoffe, wie FITC-Dextran dargestellt werden(Abbildung 2). Da der Kontrast auf der Injektion des Farbstoffes abhängt, stellt das erfasste Bild funktionelle Vaskulatur wo ausreichende Strömungs Blut. Zusätzlich zu der Vaskulatur kann Neutrophile in vivo gefärbt werden Antikörper anti-Ly6G verwenden. 3A und 3B den gleichen Bereich des Knochenmarks zu verschiedenen Zeitpunkten beobachtet repräsentieren, wobei Neutrophile zu sehen sind sowohl in der intravaskulären und extravaskulären Raum. Diese Bereiche wurden durch die Gefäß Sehenswürdigkeiten geprägt. Rhodamin 6G kann als Alternative zu Anti Ly6G verwendet werden Neutrophile in vivo zu färben; aber es diffundiert aus dem Gefäßsystem und Flecken Monozyten im extravasalen Raum in einer nicht-spezifischen Weise. Daher wird anti-Ly6G bevorzugt , weil sie spezifische Abbildungs von Neutrophilen ermöglicht. 3C Bildgebung des kortikalen Knochens repräsentiert, die hauptsächlich aus Kollagenfasern besteht. Die maximale Tiefe für die Bildgebung erreichtin diesem Versuch beträgt 180 & mgr; m (3C).
Zeitraffer-Fluoreszenzbildgebung ermöglicht Tracking und Quantifizierung von zellulären Bewegung in vivo. 4A zeigt Verfolgung von Neutrophilen im Knochenmark vaskulären Nische. Imaging ohne zusätzlichen Zeitintervall zwischen jedem Scan ermöglicht eine genaue Verfolgung von Zellen; jedoch wird ein Teil Benutzereingabe erforderlich ist, um die Genauigkeit der Spuren von der Software erzeugten verbessern. Verfolgen von Spots (dh Zellen von Interesse) ermöglicht die Quantifizierung von verschiedenen Parametern ab , wie beispielsweise mittlere Bahngeschwindigkeit (4B). Andere Parameter, die umfassen mess können, sind aber nicht beschränkt auf, Streckenlänge, Änderung der Punktgröße, Form und Intensität. Dieser Test liefert eine Quantifizierung verschiedener Parameter, die die Charakterisierung von Zellbewegungen und Wechselwirkungen zu verbessern.
Abbildung 1: Femur Fensterkammer (WC), Abbildungsstufe und das chirurgische Verfahren (A) Nach Maß Titan Oberschenkels WC mit einem U-förmigen Bügel, der den Oberschenkelknochen in Position zu fixieren dient.. Das WC hat einen Durchmesser von 8 mm Deckglas, durch einen Sprengring gesichert. (B) Nach Maß Abbildungsstufe. Ein Heizelement ist an der Unterseite der Bühne angeordnet, um die physiologischen Temperatur der Maus während der Bildgebung zu erhalten. Die beiden Krokodilklemmen werden verwendet, um das WC zu halten. (C - H) Chirurgische Verfahren zur Bestimmung des Oberschenkels WC zu installieren. (C) Der Oberschenkel ist zwischen den Beuge- und Streckmuskeln ausgesetzt. Muskeln nicht während des Verfahrens entfernt. (D) Der U-förmige Bar wird unter dem Oberschenkelknochen platziert, und (E) ist das WC installiert und gesichert zwei Muttern. (F) Zahnzement wird zwischen dem Knochen angelegt und derWC den Raum zu füllen. (G) Die Dermis wird vernäht und (H) das Deckglas an Ort und Stelle mit dem Haltering befestigt ist. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: 3D - Fluoreszenzabbildung von vaskulären Netzwerk im Knochenmark in vivo Representative Bild der Vaskulatur in dem Knochenmark, durch den Femur WC abgebildet.. Vaskulatur (grün) wird durch Schwanzveneninjektion von 2 MDa FITC-Dextran sichtbar gemacht. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: 3D - Bildgebung von vaskulären Netzwerk, Neutrophilen und Knochenmatrix in vivo Bilder von Vaskulatur und Neutrophilen im Knochenmark (A) 3 Tage und (B) 10 Tage nach dem Femur WC Chirurgie.. Neutrophile, gefärbt durch Schwanzveneninjektion von APC-markierten Ly6G Antikörper sind sowohl in den intravaskulären und Extravasalraum gesehen. Die Pfeile zeigen auf die Gefäßstruktur an beiden Tagen zu sehen, was auf die Fähigkeit, die gleiche Stelle im Laufe der Zeit zu verfolgen. Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. (C) Knochenmatrix kann unter Verwendung von SHG (weiß) visualisiert werden, zusätzlich zu den Gefäßen (grün) und Neutrophilen (rot). Das Bild wurde 40 Tage nach der Operation WC erworben. Maßstabsbalken = 70 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Tracking Neutrophilen Bewegung innerhalb des Gefäßnetz des Knochenmarks in vivo (A) Spurbahnen von Neutrophilen im Gefäßnetz.. Die Titel werden automatisch generiert die Software des integrierten in Autoregressiven Bewegungsalgorithmus. Jeder weiße Punkt repräsentiert ein Mittelpunkt eines Teilchens (Neutrophile) verfolgt. Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. Die mittlere (B) Bahngeschwindigkeit gemessen für die intravaskuläre und extravaskulärem Neutrophilen, was darauf hinweist Unterschied in der Bewegung von Neutrophilen (Error bar = Mittelwert + SD, * p = 0,0176, zweiseitigen t-Test). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version diese Figur.
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Discussion
Echtzeit, Serien Abbildung der dynamischen zellulärer Prozesse in Knochenmark enthält Informationen, die sonst herausfordernd ist unter Verwendung herkömmlicher Techniken, wie beispielsweise die Histologie und die Gesamtblutwerte zu erhalten. Das Femur WC hier beschriebene Modell bietet einzigartige Möglichkeiten, zelluläre und strukturelle Veränderungen im Knochenmark im Laufe der Zeit zu untersuchen. Obwohl ein Femur WC Modell bereits berichtet wurde, unser neuartiges Design bietet eine größere Abbildungsfeld und kleinere Gesamt WC Größe, die für den Einsatz in erwachsenen Mäusen mehr kompatibel sind. Das Femur WC-Modell kann in einer Vielzahl von Mausstämmen einschließlich immunokompetenten und / oder transgenen Mäusen Reporter verwendet werden.
Es gibt wichtige Schritte während der Operation, die die Gesamtdauer und Qualität der Bildgebung bestimmen. Wenn das Femur auszusetzen, nur eine stumpfe Dissektion der Muskeln zwischen Beuger und Strecker durchgeführt wird; Entfernung dieser Muskeln kann zu einer verminderten Beweglichkeit der Maus und Mus führent vermieden werden. Ferner muss der Kortikalis Schleif sorgfältig durchgeführt werden. Schleif etwa 50 um ist ausreichend für die optische Bildgebung, während die strukturelle Integrität des femoralen Gefäßnetz aufrechterhalten wird. Anwendung von Zahnzement um den Knochen ist entscheidend für die chirurgisch exponierten Bereich abdichtet, Flüssigkeitsansammlung zu verhindern, und eine klare optische Abbildungsfenster für über einen Monat aufrechterhalten, während das Risiko einer Infektion zu reduzieren. Der Zahnzement wirkt auch das WC an Ort und Stelle zu fixieren, von dem WC zu verhindern um den Oberschenkelknochen dreht. Schließlich verwendet der Sicherungsring die Abdeckglas zu halten ist geeignet für den Einsatz mit Wassertauchobjektiv, wasser Dichtung bereitstellt. Der Sprengring wird über Klebstoffe empfohlen, das Deckglas auf das WC zu befestigen, da die Zugabe von Klebstoffen, die Lücke zwischen dem Knochen und dem Deckglas, oder legen Sie das Deckglas in einem leichten Winkel in Bezug auf die Bildebene erhöhen kann, wodurch die erreichbare Eindringtiefe reduziert für Bildgebung. Außerdem, Der Schnappring ist nützlich, wenn das Deckglas werden gereinigt oder ausgetauscht werden muss.
Zusätzlich zu der Operation gibt es mehrere kritische Schritte erfolgreich optische Abbildung des Knochenmarks zu erhalten. Dem Bild innerhalb des Femur WC wird das WC horizontal zur Abbildungsstufe für die richtige Eintauchen der Objektivlinse angeordnet. Die maßgeschneiderte Abbildungsstufe ist für diesen Zweck geeignet, wie sie zur Anpassung des Winkels des WC in Bezug auf die Linse ermöglicht. Darüber hinaus ist die Gestaltung des WC, insbesondere der Größe des U-förmigen Stab, hält den Knochen in einer horizontalen Position möglichst nahe an der Abdeckglas möglichst optimale Eindringtiefe zu erzielen. Während der Bilderzeugung kann Atmungsartefakte als horizontale Linien in den Fluoreszenzbildern zu beobachten. Zusätzlich zu den WC an die Abbildungsstufe zu sichern, kann die Temperatur des Heizelements unter der Abbildungsstufe eingestellt werden, ausreichend um das Tier zu erwärmen übermäßige Atmung zu minimieren. Eine dünne Schicht aus Gazekann angeordnet werden helfen zwischen der Maus und der erwärmten Stufe weiter Atmungsartefakte während der Bildgebung zu reduzieren. In Abhängigkeit von der biologischen Bildgebung Ziel, Aufnahmeparameter wie Bildrate, Abbildungsvolumen und Bilddauer auch eingestellt werden kann, genügend Bilder zu sammeln, experimentelle Fragestellungen zu adressieren. Zum Beispiel Geschwindigkeit der Migration von Neutrophilen und Crawling kann 19-21 unter verschiedenen experimentellen Bedingungen von 2,8 & mgr; m / min für ansässige Neutrophilen unter basalen Bedingungen , um überall im Bereich von 5-10 um / min für Neutrophile unter Entzündungsbedingungen abweichen. Somit würde die entsprechende Bilderzeugungsgeschwindigkeit und die Dauer für neutrophile Tracking in vivo auch auf experimentellen Bedingungen basierend abweichen. Darüber hinaus, wie aus den Ergebnissen zu sehen ist, von Zellen innerhalb der Vaskulatur Tracking würde eine schnelle Bildkamera mit einer hohen Bildrate (30 Bilder / s) erforderlich. wenn die Zielzellen in Extravasalraum jedoch wohnen, oder wenn die Zell-zu-Zell-Zusan von Interesse wird erwartet, dass langsamer auftreten, sollte die Bildqualität einer höheren Priorität als Bildgebungsgeschwindigkeit werden.
Der Einfluss der injizierten Antikörper für in vivo Zellfärbung auf die zelluläre Funktion muss ebenfalls berücksichtigt werden. In unserer Studie verwendeten wir anti-Ly6G Antikörper (1A8 Klon), die typischerweise bei hohen Dosen verwendet (150-250 ug) Neutrophile aus dem Kreislauf zu verarmen und ihre Rolle bei verschiedenen Krankheitsmodellen untersuchen. Yipp und Kubes gezeigt , dass Fluorochrom-markierten Anti-Ly6G Antikörper Rekrutierung von Leukozyten bei niedrigen intravaskuläre Injektion Dosen (1-40 ug) 22 nicht stören. Allerdings ist eine neuere Studie legt nahe , dass Fluorochrome, große Unterschiede in der molekularen Masse und der chemischen Struktur, mit unterschiedlich die Funktion von Anti-Ly6G 23 beeinflussen können. Die Studie zeigte , dass Anti-Ly6G-FITC markiert, aber nicht PE- und Antikörper-APC markierte, effektiv Neutrophile in vivo bei einer niedrigen Konzentration verarmt (30 ug).In unserer Studie haben wir beobachten keine Überstunden Neutrophilen Verarmungs 4 ug APC-markierten Anti-Ly6G verwenden. Dennoch weitere Charakterisierung der Funktion der Fluorochrom-markiertem anti-Ly6G Antikörper in vivo erforderlich ist seine Verwendung in intravital Bildgebung zu validieren. Dies gilt auch für andere Antikörper, die funktionelle Fähigkeit haben, zelluläre Interaktionen zu verändern. Als eine Alternative zu in vivo Zellfärbung mit Antikörpern, transgenen Mäusen reporter 24 und / oder markierten fluoreszierenden Zellen 25 können Neutrophile oder andere Zellpopulation von Interesse sichtbar zu machen in vivo verwendet werden.
Der Oberschenkel WC Modell in diesem Protokoll beschrieben ermöglicht die Abbildung für bis zu 40 Tage nach der Operation. Einige der Herausforderungen für die langfristige Bildgebung dieses WC-Modell gehören die verzögerte Knochenheilungsprozess und die Wartung eines sauberen Glasfenster. Bemerkenswert ist, beobachten wir nicht Zeichen offensichtlichen Knochenheilung nach dem WC-Implantation, die würde include Verdickung der Knochenhaut; Dies ist nicht unerwartet , da die Knochenheilungsprozess tritt in der Regel nach 1 ½-3 Monate 26,27. Die Aufrechterhaltung eines sauberen und optisch klares Fenster kann durch die Anwendung des Dentalzement, und die Verwendung von Sprengring und Deckglas, die mit dem Gewebe eine feste Wasser-Siegel bieten erreicht werden. Das Deckglas kann gelegentlich mit Baumwollspitzen von außen gereinigt werden, um Staub und Schmutz zu entfernen. Das WC hat eine breite Abbildungsfeld, fast die gesamte Länge der Diaphyse Bereich abdeckt (ungefähr 8,4-8,6 mm 28), die es 18 besser als die zuvor veröffentlichten Modell macht. Allerdings ist der Zugang zu den distalen Regionen und die tiefere Markhöhle begrenzt. Insbesondere die trabekuläre reichen Metaphyse, an den distalen Enden der Diaphyse befindet, ist bekannt , in HPSCs 29 reich zu sein. Diese Bereiche können histologisch zugegriffen werden oder durch IVM als Terminal Prozedur. Alternativ können unterschiedliche Bildgebungsverfahren wie Mikro-compausgeschüttete Tomographie können die distalen Regionen des Knochenmarks in vivo 30 bis Bild verwendet werden. Solche Verfahren sind zu IVM komplementär, Anatomie, einen integrierten Ansatz bietet für die Bewertung und die verschiedenen zellulären und strukturellen Veränderungen und Wechselwirkungen innerhalb des Knochenmarks.
Das hier beschriebene Protokoll bietet einen neuartigen Ansatz für die Langzeit spatiotemporalen Beurteilung des femoralen Knochenmark in Mäuse auf zellulärer Auflösung. Die Verfahren ermöglichen dargestellt in vivo Bildgebung über serielle biologisch relevanten Zeitskalen Bewegungen einer einzelnen Zelle oder Zellpopulationen zu verfolgen, während sie gleichzeitig strukturelle und funktionale Informationen des Knochenmarks zu erhalten. weiter zu charakterisieren zellulären und funktionellen Veränderungen, wie beispielsweise Verfolgen von zellularen Bewegungen zusätzlich kann quantitative Bildanalyse durchgeführt werden. Die Anwendung dieses Femur WC - Modell in verschiedenen Stämmen von Mäusen, insbesondere in transgenen Mäusen Reporter 31,Weitere Untersuchungen können individuell markierten Zellpopulationen mehrere ermöglichen wie bei der Hämatopoese Beteiligten. Daher ist das beschriebene Protokoll weithin für eine breite Palette von präklinischen Studien verschiedene biologische Prozesse innerhalb des lebenden Maus - Knochenmark beteiligt, einschließlich Untersuchungen in der Hämatopoese, Leukämie, HPSC Transplantation, Immunregulation, Knochenmark - Mikroumgebung (zB hypoxischen Nische) und der Beitrag von Immunzellen zu Tumorprogression und Metastasierung.
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Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Die Autoren möchten die Advanced Optical Mikroskopie Facility (www.aomf.ca) an der Universität Health Network für die Unterstützung bei der Mikroskopie und Herr Jason Ellis von der Prinzessin Margaret Cancer Center Machine Shop zu danken für das WC-Herstellung und die Abbildungsstufe. Wir möchten auch Dr. Iris Kulbatski für Manuskript Bearbeitung danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NRCNU-F athymic nude mice | Taconic | Ncr nude | 8-10 weeks old, female |
| Saline | Baxter | JB1302P | |
| Ketamine hydrochloride | Bioniche Animal Health Canada, Inc. | DIN 01989529 | |
| Xylazine | Bayer HealthCare, Bayer Inc. | DIN 02169592 | |
| Surgical drape | Proxima | DYNJP2405 | |
| Electric heating pad | Life Brand | 57800827375 | |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M60 | |
| Eye ointment (tear gel) | Novartis | T296/2 | |
| 7.5% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-151-16 | |
| 70% isopropyl alcohol | GreenField | P010IP7P | |
| 10% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-150-05 | |
| Scalpel handle (#3) | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blade (#15) | VWR | 89176-368 | |
| Spring Scissors curved | Fine science Tools | 15023-10 | |
| Baby-Mixter Hemostat | Fine science Tools | 13013-14 | |
| Fine Scissors | Fine science Tools | 14094-11 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine science Tools | 11151-10 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats | Fine science Tools | 13008-12 | |
| Micro-drill | Harvard Apparaus | 72-6065 | |
| Micro-drill burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | |
| Femur window chamber | PMCC machine shop | custom design | 9.1 mm- 8.5 mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9 mm (distance between two holes), 0.7 mm (thickness) |
| U-shaped bar | PMCC machine shop | custom design | 13.8 mm (length), 1.6 mm (width), 3.7 mm (height) |
| Coverglass (8 mm) | Warner Instruments | HBIO 64-0701 CS-8R | |
| Retaining ring (8 mm) | ACKLANDS GRAINGER | UNSPSC # 31163202 | |
| Nuts (hexagon stainless steel) | Fastenal | 70701 | |
| Dental cement | 3M | RelyX U200 | |
| Suture (5-0 Monosof black) | Covioien | SN-5698 | |
| Halsey needle holder | Fine Science Tools | 12501-13 | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Reckitt Benckiser | DIN 0281251 | |
| Meloxicam (Metacam) | Boehringer Ingelheim | DIN 02240463 | |
| Amoxicillin (Clamavox) | Pfizer | DIN 02027879 | |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD2000S | |
| APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1) | eBioscience | 17-9668 | |
| Two-photon microscope LSM 710 | Carl Zeiss | Zeiss LSM 710 NLO | |
| Imaging stage | PMCC machine shop | custom design | 15.9 cm (length), 11 cm (width), 0.9 cm (height) |
| Imaris software | Bitplane | Imaris 8.0 | Image analysis software described in Section 3 of the Protocol |
| Zen 2012 | Zeiss | Zen 2012 | Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol |
References
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