Introduction
A medula óssea é um órgão importante envolvidos na hematopoiese e regulação imune. É constituída por um componente que contém células germinais hematopoiéticas e progenitoras hematopoiéticas (hspCs), e um componente do estroma contendo células progenitoras não hematopoiéticas que dão origem a células mesenquimais 1. Dois terços da actividade hematopoiética é dedicado à produção de células mielóides 2. Em particular, um grande número de neutrófilos são produzidas na medula óssea, com 1-2 x 10 células 11 gerado por dia num ser humano adulto normal 2. Os neutrófilos são a primeira linha de defesa contra infecções microbianas e muitas vezes são reservados na medula óssea até que o estresse desencadeia a sua mobilização para completar os neutrófilos periféricos 1,3. Em adição aos seus efeitos anti-microbianos, estudos recentes sugerem um papel importante na biologia de neutrófilos cancro, tendo ambos pro- e anti-tumorigénica fenótipos dependendo de crescimento transformantefator beta (TGF-β) de sinalização no microambiente tumoral 4,5. Além disso, estudos demonstraram que os neutrófilos que se acumulam em tumores primários exercer efeitos pró-tumorigénicas e metastáticos através da supressão da função das células T citotóxica 6,7, enquanto que os neutrófilos em circulação exercer um agente citotóxico, efeito anti-metastático 8. Como tal, a investigação de células hematopoiéticas da medula óssea, particularmente os neutrófilos, é crucial para elucidar o seu papel na regulação imune e tumor.
A histopatologia e uma contagem completa do sangue periférico são rotineiramente usadas para avaliar as alterações celulares e estruturais na medula óssea 9. No entanto, estes métodos apenas fornecem informação estática de diferentes populações de células ou de tecidos microestruturas. Longitudinal imagem in vivo pode ser utilizado em combinação com os métodos padrão para avaliar a dinâmica de vários componentes celulares, vasculares e do estroma, bem como célula-a-Cinterações ell de forma longitudinal. Microscopia intravital (IVM), definida como imagem de animais que vivem em microscópica resolução 10, é particularmente útil para avaliar os processos celulares dinâmicas ao longo do tempo na mesma amostra, reduzindo o número de animal experimental necessário. IVM é frequentemente combinada com uma câmara janela cronicamente transplantado (WC) para acessar o órgão de interesse para geração de imagens ao longo de um período de semanas a meses. modelos WC cranianos e dorsal-dobra cutânea tem a mais longa história de uso que remonta a meados de 1990. Mais recentemente, outros modelos WC especificas de órgãos, tais como os de almofada de gordura mamaria e vários órgãos abdominais foram desenvolvidos 11.
A abordagem típica para geração de imagens de medula óssea in vivo tem uma exposição envolvido principalmente da calvária de ratos, onde o osso mais fina permite a visualização direta de células individuais com o mínimo de intervenção cirúrgica 12-14. No entanto, a medula óssea pode b calváriae distinta da de outros ossos, tais como o osso longo, tal como demonstrado por um menor número de hspCs e células hipóxicas em calvárias, o que indica a manutenção e desenvolvimento de hspCs 15 reduzida. Portanto, abordagens alternativas para avaliar os componentes celulares do osso longo têm sido investigados. Estes incluem a exposição direta da medula óssea femoral 16 e transplante ectópica do fêmur divisão na dobra cutânea dorsal WC 17. No entanto, o primeiro é um procedimento terminal que não permite o rastreamento de alterações celulares, estruturais e funcionais durante períodos de tempo mais longos, e este último provavelmente perturba a função normal da medula óssea devido ao transplante de fêmur a um site ectópica no interior do WC dorsal de dobras cutâneas. Um outro método que permite imagens seriadas ortotópico de medula óssea femural ao longo do tempo é o uso de um WC no osso femoral. Um relatório anterior demonstrou imagem latente a longo prazo da microcirculação na medula óssea do fémur usando umfêmur WC em ratos 18. Além disso, os autores demonstraram a visualização de células tumorais no fémur, o que indica a sua utilidade em metástases da medula óssea de monitorização. No entanto, este design WC era limitado pelo seu grande tamanho (1,2 cm de diâmetro) e a área de imagem relativamente pequena (4 mm de diâmetro), o que era apenas adequado para grande ratinhos (26-34 g, 3-6 meses de idade), tornando assim o aproximar-se impraticável para uso rotineiro.
Por conseguinte, um novo WC com um tamanho global menor e maior área de imagem interna foi concebido para a finalidade do presente estudo. O objectivo deste estudo foi o de proporcionar um método para imagiologia de vários tipos de células na medula óssea do fémur. O modelo WC fêmur foi desenvolvido in-house e foi usado para visualizar e acompanhar neutrófilos dentro da rede vascular 3D. Utilizando este modelo, MIV da medula óssea pode ser realizado em série ao longo de 40 dias. Esta abordagem pode ser aplicada a uma variedade de campos para elucidar os processos de hematopoiese, uma regulação imuneo desenvolvimento do tumor nd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Todos os trabalhos animal foi realizado sob o protocolo nº 2615 aprovado pelo Comitê Animal Care Institucional e Use a Rede Universitária de Saúde.
1. Preparação cirúrgica do Rato
- Antes da cirurgia, todos os esterilizar instrumentos cirúrgicos e a câmara de janela (CC) em autoclave. Suplemento da água potável com 50 mg / kg de peso corporal de amoxicilina de 2 dias antes da cirurgia. Injectar o rato com 0,1 mg / kg de peso corporal de buprenorfina por via intraperitoneal quatro horas antes da cirurgia.
- Anestesiar o rato nu atímicos por injeção intraperitoneal de solução salina 350-400 ul contendo 80 mg / kg de ketamina e 13 mg / kg de xilazina (Nota: Este foi aprovado pela Comissão de Cuidados Institucionais Animal, e nós não ter tido qualquer experiência com efeitos adversos ). Confirmar a anestesia adequada através de testes de reflexo pé. Continue observando para padrão respiratório, a cor das mucosas e do reflexo do pé durante o procedimento.
- Executar a pr cirúrgicaocedures sob uma cabine de segurança biológica para manter condições estéreis durante a cirurgia. Posicione o mouse sobre uma almofada de aquecimento eléctrico coberto com um tecido cirúrgico para manter a temperatura do corpo durante a cirurgia. Executar todos os procedimentos cirúrgicos sob o microscópio estereoscópico.
- Aplicar pomada para manter os olhos úmidos durante a cirurgia. Repita se necessário durante o procedimento cirúrgico. Esterilizar a área operacional do mouse limpando com 7,5% iodopovidona, álcool isopropílico a 70% e 10% iodopovidona consecutivamente, e repita este procedimento duas vezes.
- Faça um 10 milímetros incisão cutânea longitudinal usando bisturi com lâmina (# 15), aproximando-se do fémur do lado lateral. Expor o fêmur entre os músculos flexores e extensores por dissecção romba usando uma pinça e hemostats para garantir a funcionalidade muscular.
- Inserir a barra em forma de U sob o osso, e instalar a CC (Figura 1). Fixe a barra com a janela usando duas porcas, e aperte as porcas com aceps. Encher o espaço entre o osso e o WC com cimento dental.
- Triturar o osso cortical numa região de 6 x 2 mm2 com um micro-broca para ganhar acesso óptico para a cavidade medular.
Nota: Verifique cuidadosamente afinamento do osso cortical sob o microscópio durante a realização deste procedimento. Deixar uma camada de periósteo intacto, quase transparente do osso. - Coloque a lamela 8 mm sobre a janela, e garantir a lamela com um anel elástico para mantê-lo no lugar.
- Reajuste a musculatura dos flexores e extensores de volta para seus locais originais usando uma pinça para manter a sua função após a cirurgia. Suturar a derme usando 5-0 sutura e um suporte de agulha.
- Monitorar o mouse para a recuperação, até que ele está consciente e é capaz de se mover livremente. Coloque o animal em uma gaiola nova, quando recuperado.
- Após a recuperação, realizar a aquisição de imagens sobre o animal no mesmo dia ou nos dias seguintes (ver secção 2). Monitorar o physicondição de cal do mouse diária.
Nota: Monitorar as condições físicas, tais como rolamento de peso no membro, curvando, respiração rápida ou superficial, inchaço dos membros posteriores, auto-mutilação, celulite e dermatite grave. - Dê injecção intraperitoneal de 0,1 mg / kg de peso corporal de buprenorfina por 3 dias, e 1 mg / kg de peso corporal do meloxicam durante 5 dias após a cirurgia para o tratamento da dor pós-operatória e inflamação. Continuar a fornecer a água suplementada com amoxicilina durante 5 dias.
- No ponto final experimental, sacrificar o animal por CO 2 narcose seguido por um método secundário (por exemplo, deslocamento cervical).
2. Aquisição de Imagem Usando Combined multi-fótons e microscopia confocal
- Antes da imagiologia, anestesiar o rato através de injecção intraperitoneal de uma solução salina de 350-400 ul contendo 80 mg / kg de cetamina e 13 mg / kg de xilazina. Como alternativa, use anestésico inalável, quando disponível.Aplicar pomada.
- Injectar a mistura de corantes intravasculares para a vasculatura rotulagem (0,65 mg de 2 MDa de fluoresceína (FITC) -dextrano) e neutrófilos (4 ug de aloficocianina (APC) anticorpo-Ly6G -anti).
- Usar um multi-fotão vertical combinadas e microscópio confocal equipado com um laser multi-fotão variando 705-980 nm para a excitação de dois fotões, bem como lasers de fotões individuais que fornece os comprimentos de onda de excitação de azul para vermelho.
- Definir um estágio de imagem feitos sob medida para o microscópio (Figura 1B). Fixe o mouse sobre o palco, fixando as duas extremidades do WC com pinças.
Nota: Os componentes críticos da fase são: duas pinças para segurar o WC, e um elemento de aquecimento para manter a temperatura fisiológica (37 ° C) do mouse durante o exame. - Ligue o laser de dois fótons e do sistema confocal, e lançar o software de aquisição de imagem, clicando em "Sistema Start". Uma janela com 4 abas (Localize,Aquisição, processamento e manter) será aberta.
- Configurar os canais de imagem. Clique em "Configuração Inteligente" sob a guia Aquisição e escolher os corantes que serão utilizados para geração de imagens: FITC (488 nm de excitação, 493-588 nm de emissão) e APC (633 nm de excitação e de emissão 638-743 nm). Escolha "Melhor Signal" e clique em "Aplicar".
- Adicionar a geração de segundo harmônico (SHG) imagem canal de aquisição manualmente. Ligue o laser de dois fótons sob a janela "Laser" na guia Acquisition. Sob a janela de Canais, clique no sinal "+" para adicionar uma faixa.
- Configure a faixa SHG. Alterar o comprimento de onda de 840 nm sob a janela Canais usando as setas acima e abaixo, e escolher a faixa de detecção para ser 415-425 nm sob a janela "Caminho de Luz", utilizando a barra deslizante.
- Clique em "ocular Online" na guia Localizar. Clique FITC sob a configuração de filtro para FITC para visualizar a região de interesse e ajustar o foco manualmente, virando tele concentrar botão do lado do microscópio. Quando a região de interesse está localizado, clique em "ocular off-line", na guia Localizar.
- Clique na guia Acquisition. Selecionar a trilha FITC sob a janela Channels e clique em "Live" para visualizar a imagem de FITC-dextrano com objetivo de 5X. Ajuste o foco, se necessário, e clique em "Stop" na guia Acquisition para parar a pré-visualização.
- ligar manualmente a 20X objetivo água movendo uma roda por cima das lentes. Ver a imagem novamente para FITC-dextrano com o objetivo 20X, e ajustar Ganho Master e Pinhole sob a janela de Canais para conseguir sinal e um contraste perfeito. Repita o procedimento para outros canais, selecionando faixas de APC e SHG sob a janela de Canais.
- Escolha os parâmetros de imagem. Clique em "Modo de Aquisição" para abrir a janela. Defina o tamanho do quadro para ser 1.024 x 1.024 pixels, e média de 4X para obter imagens de alta qualidade.
- Adquirir um instantâneo 2D. Selecione todos os canais sob Canais ganhardow e clique em "Snap", na guia Acquisition. Verifique a qualidade da imagem e alterar os parâmetros de imagem, se necessário.
- Adquirir imagem time-lapse 2D.
- Verifique fora "Séries Temporais" na guia Acquisition para abrir a janela Time Series. Digite 0 sob os intervalos, e 40 para o número total de verificações para levar 40 imagens continuamente, sem intervalo de tempo.
Nota: 40 scans gera cerca de 5 minutos de tempo-série com uma velocidade de digitalização de 7,5 seg / frame e o tamanho da imagem de 600 mm x 600 mm. Ajuste o intervalo e número de exames, dependendo do microscópio, as configurações de aquisição de imagem ea taxa de quadros da câmera. Um intervalo de tempo fixo (> 0 seg) pode ser utilizado para comparar imagens de lapso de tempo adquiridas em diferentes pontos de tempo. Uma duração de imagem mais lapso de tempo pode ser necessária, dependendo da velocidade média esperada de neutrófilos (ou outras células de interesse) na condição experimental.
- Verifique fora "Séries Temporais" na guia Acquisition para abrir a janela Time Series. Digite 0 sob os intervalos, e 40 para o número total de verificações para levar 40 imagens continuamente, sem intervalo de tempo.
- Adquirir imagem 3D.
- Verifique fora "Z-Stack" na guia Acquisition para abrir a janela Z-Stack. Iniciar o modo de visualização "ao vivo" para FITC-dextrano. Concentre-se no topo da amostra e clique em "Set First", e concentrar-se na outra extremidade da amostra e clique em "Definir Última" na janela do Z-stack.
- Defina o intervalo a ser de 10 mm sob a janela do Z-stack. Dependendo da primeira e da última fatia óptico seleccionada na etapa anterior, isso irá gerar 10-20 fatias, com a espessura óptica total de 90-180 uM.
Nota: O intervalo de Z-pilha é dependente do tamanho do furo de pino, que determina a espessura da fatia óptico. Definir o intervalo a ser menos do que a espessura da fatia óptico. - Clique em "Iniciar Experimento" na guia Acquisition para começar a recolher imagens.
- Adquirir imagem time-lapse 3D.
- Verifique fora "Séries Temporais" e "Z-stack" na guia Acquisition para abrir o Time Seriese as janelas Z-stack.
- Configurar o Time Series e parâmetros de aquisição Z-stack como descrito nos passos 2.14 e 2.15. Clique em "Iniciar Experimento" na guia Acquisition para começar a recolher imagens.
- Monitorar o mouse durante o exame para ter certeza que é estável e inconsciente. Se o mouse é instável e / ou consciente durante o exame, remova o mouse do palco, injetar adicionais 100-150 mL da solução anestésica por via intraperitoneal, e continuar de imagem.
Nota: Os sinais de instabilidade incluem respiração rápida e movimento do mouse, o que pode ser visto como deslocando artefatos em imagens adquiridas. - Após a aquisição da imagem, dê o mouse para fora do palco e devolvê-lo para a jaula. Use uma lâmpada de aquecimento para mantê-lo quente, e monitorar o rato até que ele esteja consciente.
Análise 3. Imagem e quantificação
- Usar a imagem de software de análise para analisar os dados em 3D e de séries temporais. Abra o software eadicionar imagens arrastando-os para a tela aberta, que é chamado vista "Arena". Clique duas vezes em um arquivo de imagem para abri-la; a imagem será aberta em vista "Superar".
- Criar uma imagem 2D / 3D.
- A partir do bar "Mais" encontrado no canto superior direito, clique em "Editar / Show Ajuste Display" para abrir a janela "Display Ajuste". Otimizar a exibição de fluorescência, ajustando os limites para cada canal e tirar um instantâneo para salvar a imagem.
- Gerar faixas de objetos a partir de imagens de lapso de tempo.
- Abra a imagem a ser analisada sob visão "Superar". Clique no ícone com uma imagem de pontos alaranjados, encontrada abaixo do ícone "Superar". Isto irá abrir uma nova janela "Spots".
- Verifique fora "pontos de trilha (com o tempo)" e clique na seta azul para ir para a próxima etapa. Selecione o canal que contém os objetos para rastrear sob "Channel Source", e definir o diamet objeto estimadoer under "diâmetro XY estimado", digitando um número. Clique na seta azul para ir para a próxima etapa.
Nota: Para o acompanhamento de neutrófilos, seleccionar o canal que contém a APC fluorescência para os neutrófilos e definir o diâmetro do objecto a 12 um com base no tamanho conhecido de neutrófilos. - Na janela, localizar e selecionar o filtro "Qualidade", clicando na seta para baixo. Observe os pontos definidos pelo software e ajustar manualmente o limiar para incluir ou excluir pontos. Uma vez limite é definido, clique na seta azul para ir para o passo "Tracking".
- No caso do algoritmo, localizar e selecionar "Motion Algoritmo Autoregressive", clicando na seta para baixo. Digite 10 mm para "Max Distance" e 3 para "Max Gap Size" encontrado em Parâmetros. Verifique fora "preencher as lacunas com todos os objectos detectados" para começar a controlar, e clique na seta azul para ir para a próxima etapa.
Nota: "algoritmo de movimento Autoregressive" é usado fou objetos que têm direcionado o movimento, uma vez que gera faixas com base na localização prevista do movimento anterior. "Max Distance" e "Max Gap tamanho" pode ser ajustado dependendo da dimensão e velocidade do objeto esperado sendo monitorado, bem como a duração total da imagem time-lapse. - Em Tipo de Filtro, selecione o filtro "Track Duração". Clique na seta verde para finalizar rastreamento, e verificar as faixas que foram gerados. Volte para a etapa anterior se necessário para classificar manualmente as faixas.
- Se os desvios imagem lapso de tempo gerados, corrigir o desvio de translação.
- Clique no ícone com uma imagem de um lápis. Este é um guia de edição que se abre "Tracks Editar" janela. Examine a imagem de lapso de tempo e encontrar um ponto de referência que não deve estar se movendo para todas as imagens.
- No canto superior esquerdo da tela, encontrar "Pointer" janela e verificar fora "Select" para activar o cursor para a selecção de um local. Clique no local de referência.
- Clique em "Deriva Correct" na janela "Editar faixas". Verifique fora "Translational tração". O software irá gerar automaticamente a série corrigida de imagens.
- Medir o movimento celular definida pelas faixas de objetos em imagens de lapso de tempo.
- Sob a janela "Editar faixas", marque "Tracks" e selecione uma faixa que representa o movimento de uma célula. A faixa selecionada será destacada em amarelo na imagem de séries temporais.
- Clique no ícone com uma imagem de um gráfico para abrir a janela (guia estatísticas) "Estatísticas".
- Em "Selection", selecione "Track Velocidade Média", clicando na seta para baixo para gerar a velocidade em pista significa para a faixa selecionada. Escolha diferentes faixas e repita os passos para medir a velocidade em pista significa para todas as células de interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Medula óssea femural de murino é acessado com sucesso utilizando o WC para permitir a visualização de neutrófilos individuais e redes vasculares. A Figura 1 mostra o instrumento WC e descreve o procedimento cirúrgico, o que envolve a exposição do osso femoral e adelgaçamento do osso cortical para ganhar acesso óptico no interior da osso. A cirurgia é bem tolerada em ratinhos; eles foram avaliados para reações físicas adversas, como inchaço dos membros posteriores, não-peso rolamento no membro, auto-mutilação, celulite e dermatite, bem como danos ao WC durante 5 dias após a cirurgia, sem nenhum relato de sofrimento. Notavelmente, a janela permanece opticamente clara para IVM para até 40 dias, o que pode permitir avaliação a longo prazo de alterações celulares e estruturais na sequência de uma intervenção.
Vasculatura dentro da medula óssea pode ser visualizado por corantes intravasculares, tais como FITC-Dextrano(Figura 2). Uma vez que o contraste é dependente da injecção do corante, a imagem adquirida representa vasculatura funcional, onde existe fluxo de sangue suficiente. Para além da vasculatura, os neutrófilos podem ser coradas in vivo utilizando anticorpo anti-Ly6G. A Figura 3A e 3B representam a mesma área da medula óssea observada em diferentes pontos de tempo, em que os neutrófilos são observados, tanto na intravascular e espaço extravascular. Estas áreas foram caracterizados por os pontos de referência vasculares. Rodamina 6G pode ser utilizado como uma alternativa aos medicamentos anti-Ly6G para corar neutrófilos in vivo; No entanto, se difunde para fora da vasculatura e manchas de monócitos no espaço extravascular de uma forma não específica. Portanto, anti-Ly6G é preferido porque permite imagiologia específica de neutrófilos. A Figura 3C representa imagiologia do osso cortical, que é composta principalmente de fibras de colagénio. A profundidade máxima para imagiologia alcançadonesta experiência é de 180 uM (Figura 3C).
Imagiologia de fluorescência de lapso de tempo facilita o controle e quantificação do movimento celular in vivo. A Figura 4A mostra o acompanhamento de neutrófilos no nicho vascular medula óssea. Imagiologia sem intervalo de tempo adicional entre cada digitalização permite um acompanhamento preciso das células; No entanto, alguma entrada do utilizador é necessária para melhorar ainda mais a precisão de faixas gerados pelo software. Rastreamento de pontos (ou seja, as células de interesse) permite a quantificação de vários parâmetros, tais como a média de velocidade em pista (Figura 4B). Outros parâmetros que podem ser medidas incluem, mas não estão limitados a, comprimento, mudança de faixa no tamanho do ponto, forma e intensidade. Este ensaio proporciona a quantificação de vários parâmetros que melhoram a caracterização dos movimentos e das interacções celulares.
Figura 1: câmara janela Femur (WC), estágio de imagem e o procedimento cirúrgico (A) WC titânio fêmur Custom-made com uma barra em forma de U que serve para fixar o fêmur no lugar.. O WC detém uma tampa de vidro 8 mm de diâmetro, fixado por um anel elástico. (B) estágio de imagem feitos sob medida. Um elemento de aquecimento é colocada no fundo do palco para manter a temperatura fisiológica do rato durante o exame. As duas pinças são usadas para manter o WC. (C - H) Procedimento cirúrgico para a instalação do WC fêmur. (C) O fêmur é exposta entre os músculos flexores e extensores. Os músculos não são removidos durante o procedimento. (D) A barra em forma de U é colocado sob o fêmur, e (E) o WC está instalado e protegido usando duas porcas. Cimento (F) dental é aplicada entre o osso e oWC para encher o espaço. (G) A derme é suturada e (H) a tampa de vidro é fixada no lugar com o anel de retenção. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: 3D imagens de fluorescência da rede vascular na medula óssea in vivo Imagem representativa da vasculatura na medula óssea, fotografada através do fémur WC.. Vasculatura (verde) é visualizado por injecção na veia da cauda de 2 MDa FITC-Dextrano. Barra de escala = 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: imagem 3D da rede vascular, neutrófilos e matriz de osso in vivo de imagens de vasculatura e neutrófilos na medula óssea (A) e 3 dias (B), 10 dias após a cirurgia fémur WC.. Os neutrófilos, coradas por injecção na veia da cauda de anticorpo marcado com APC Ly6G, são vistos tanto nos espaços intravasculares e extravascular. As setas apontam para a estrutura vascular visto em ambos os dias, o que indica a capacidade de controlar o mesmo local ao longo do tempo. Barra de escala = 50 mm. (C) da matriz óssea pode ser visualizada utilizando SHG (branco), para além da vasculatura (verde) e neutrófilos (vermelho). A imagem foi obtida 40 dias após a cirurgia WC. Barra de escala = 70 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Seguindo o movimento dos neutrófilos dentro da rede vascular da medula óssea in vivo caminhos (A) Pista de neutrófilos dentro da rede vascular.. As faixas são gerados automaticamente usando o built-in Autoregressive algoritmo de movimento do software. Cada ponto branco representa um ponto central de uma partícula sendo rastreados (neutrófilos). Barra de escala = 50 mm. (B) A média de velocidade em pista medido para intravascular e extravascular neutrófilos, indicando diferença no movimento dos neutrófilos (barra de erro = média + SD, * p = 0,0176, bicaudal teste t). Por favor clique aqui para ver uma versão maior esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Em tempo real, imagens seriadas dos processos celulares dinâmicos na medula óssea fornece a informação que é de outro modo difícil de obter usando técnicas convencionais tais como a histologia e as contagens sanguíneas totais. O modelo WC fêmur descrito aqui fornece uma oportunidade única para investigar alterações celulares e estruturais na medula óssea ao longo do tempo. Embora um modelo fêmur CC tem sido relatado anteriormente, o nosso design inovador proporciona um campo de imagem de visão maior e menor dimensão global WC, que são mais compatíveis para uso em camundongos adultos. O modelo de WC fémur pode ser usada em uma variedade de estirpes de ratinho imunocompetente, incluindo e / ou ratinhos transgénicos repórter.
Há passos críticos durante a cirurgia que determinar a duração total ea qualidade da imagem. Ao expor o fêmur, apenas uma dissecção romba dos músculos entre flexores e extensores é realizada; remoção destes músculos pode resultar em mobilidade reduzida do mouse e must ser evitadas. Além disso, a moagem do osso cortical deve ser realizado cuidadosamente. Moagem de aproximadamente 50 mm é adequada para a imagiologia óptica, mantendo a integridade estrutural da rede vascular femoral. Aplicação do cimento dental ao redor do osso é crucial para a selagem da área exposta cirurgicamente, evitando a acumulação de fluido, e a manutenção de uma janela de imagiologia óptica clara durante mais de um mês, enquanto reduz o risco de infecção. O cimento dental também atua para corrigir o WC no lugar, impedindo que o WC de girar em torno do osso femoral. Por fim, o anel de pressão utilizado para segurar a lamela é adequado para o uso com lentes de imersão em água, o fornecimento de água-selo. A anilha de retenção é recomendado sobre adesivos para fixar a lamela ao WC, porque a adição de adesivos podem aumentar a diferença entre o osso e a lamela, ou colocar a lamela a um ligeiro ângulo em relação ao plano de imagem, reduzindo desse modo a profundidade de penetração possível para imagiologia. além disso, O anel elástico é útil quando a lamela precisa ser limpo ou substituído.
Além da cirurgia, há vários passos críticos para alcançar imagiologia óptica com êxito da medula óssea. Para a imagem dentro do WC fêmur, o WC é colocada horizontalmente para a fase de imagem para a imersão adequada da lente objetiva. A fase imagiologia feito por medida é adequado para este propósito, uma vez que permite ajustamentos do ângulo do WC com relação à lente. Além disso, o desenho da sanita, particularmente o tamanho da barra em forma de U, o osso mantém numa posição horizontal, tal como perto da lamela possível para conseguir a profundidade de penetração óptima. Durante a gravação, os artefactos de respiração podem ser observadas como linhas horizontais em as imagens de fluorescência. Além de garantir a CT para a fase de imagem, a temperatura do elemento de aquecimento sob a fase de imagem pode ser ajustada para aquecer adequadamente o animal para minimizar respiração excessiva. Uma fina camada de gazepode ser colocado entre o rato eo palco aquecida para ajudar a reduzir ainda mais artefatos de respiração durante o exame. Dependendo do destino imagiologia biológica, parâmetros de aquisição, tais como taxa de quadros, o volume de imagens e duração de imagem pode também ser ajustado para coletar imagens suficientes para tratar de questões experimentais. Por exemplo, a velocidade de migração de neutrófilos e o rastreio pode ser diferente em várias condições experimentais, a partir de 2,8 um / min para os neutrófilos sob condições basais residentes para qualquer lugar variando 5-10 uM / min para os neutrófilos sob condições inflamatórias 19-21. Assim, a velocidade de imagem apropriados e duração para o rastreamento de neutrófilos in vivo também diferem com base em condições experimentais. Além disso, como pode ser visto a partir dos resultados, a identificação de células no interior da vasculatura exigiria uma câmara de imagem rápido com uma taxa de fotogramas elevada (30 quadros / seg). No entanto, se as células alvo são residentes no espaço extravascular, ou se o interactio célula-a-célulan de interesse está prevista para ocorrer de forma mais lenta, a qualidade da imagem deve ser priorizada em detrimento da velocidade de imagem.
A influência dos anticorpos injectados in vivo para a coloração de células em função celular, também deve ser considerado. No nosso estudo, utilizou-se anticorpo anti-Ly6G (1A8 clone), o qual é tipicamente utilizado em doses elevadas (150-250 ug) para esgotar os neutrófilos a partir de circulação e estudar o seu papel em vários modelos de doença. Yipp e Kubes demonstrado que o anticorpo anti-Ly6G marcado com fluorocromo não perturbar o recrutamento de leucócitos em doses baixas intravasculares de injecção (1-40 ug) 22. No entanto, um estudo mais recente sugere que fluorocromos, com grandes diferenças na massa molecular e estrutura química, pode diferencialmente influenciar a função de anti-Ly6G 23. O estudo demonstrou que marcado com FITC anti-Ly6G, mas não PE- e anticorpos de APC-rotulado, esgota eficazmente neutrófilos in vivo a uma baixa concentração (30 mg).Em nosso estudo, não observamos horas extras a depleção de neutrófilos utilizando 4 mg de APC-rotulados anti-Ly6G. No entanto, a caracterização adicional da função de anticorpo anti-Ly6G marcado com fluorocromo in vivo é necessário para validar a sua utilização em imagiologia intravital. Isto também se aplica a outros anticorpos que têm a capacidade funcional para alterar as interacções celulares. Como uma alternativa para a coloração de células in vivo com anticorpos, ratinhos transgénicos repórter 24 e / ou células fluorescentes marcadas 25 pode ser usado para visualizar os neutrófilos ou outra população celular de interesse in vivo.
O modelo fêmur WC descrito neste protocolo permite imagiologia por até 40 dias após a cirurgia. Alguns dos desafios para a imagem latente de longo prazo usando este modelo WC incluem o processo de cicatrização óssea retardada e manutenção de uma janela de vidro limpo. Notavelmente, não observamos sinais de cicatrização óssea evidente após a implantação WC, o que inclue espessamento do periósteo; Isso não é inesperado dado que processo de cicatrização óssea geralmente ocorre após 1 ½-3 meses 26,27. Manutenção de uma janela limpa e opticamente transparente pode ser conseguida pela aplicação do cimento dental, e o uso do anel de pressão e proporcionar uma lamela que a água de selagem firme com o tecido. A lamela pode ser ocasionalmente limpos com pontas de algodão a partir do exterior para remover a poeira e detritos. O WC tem um campo de imagem de largura, cobrindo quase todo o comprimento da região da diáfise (aproximadamente 8,4-8,6 mm 28), que o torna superior ao modelo publicado anteriormente 18. Contudo, o acesso às regiões distais e da cavidade da medula mais profunda é limitado. Em particular, a metáfise rico em trabecular, localizados nas extremidades distais da diáfise, é conhecido por ser rico em HPSCs 29. Estas áreas podem ser acedidos histologicamente, ou por um procedimento de maturação in vitro como terminal. Alternativamente, diferentes modalidades de imagem, tais como micro-comptomografia buiu pode ser utilizado para a imagem das regiões distais da medula óssea in vivo 30. Tais métodos são complementares a IVM, proporcionando uma abordagem integrada para avaliar a anatomia e as várias alterações celulares e estruturais e as interacções dentro da medula óssea.
O protocolo descrito aqui oferece uma nova abordagem para a avaliação espaço-temporal de longo prazo de medula óssea femoral em ratinhos a resolução celular. Os métodos apresentados permitem em imagiologia in vivo de série para controlar os movimentos de uma única célula ou de populações celulares em escalas de tempo biologicamente relevantes, enquanto se obtém simultaneamente informação estrutural e funcional da medula óssea. Além disso, a análise quantitativa de imagens pode ser executada para melhor caracterizar as alterações celulares e funcionais, tais como o controlo dos movimentos celulares. Aplicação deste modelo WC fêmur em várias linhagens de camundongos, particularmente em ratos repórter transgênicos 31,pode permitir uma investigação mais aprofundada das várias populações de células individualmente rotulados, tais como aqueles envolvidos na hematopoiese. Portanto, o protocolo descrito é amplamente aplicável a uma ampla gama de estudos pré-clínicos que envolvem vários processos biológicos no interior da medula óssea de murino vivo, incluindo investigações na hematopoiese, leucemia, transplante HPSC, regulação imune, o microambiente da medula óssea (por exemplo, nicho hipóxico) e a contribuição de células do sistema imunológico para a progressão do tumor e metástases.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Facilidade Avançada Microscopia Óptica (www.aomf.ca) na University Health Network para assistência com a microscopia, e o Sr. Jason Ellis do Cancer Center Machine Shop Princess Margaret para o fabrico do WC e do estágio de imagem. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Iris Kulbatski para a edição do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NRCNU-F athymic nude mice | Taconic | Ncr nude | 8-10 weeks old, female |
| Saline | Baxter | JB1302P | |
| Ketamine hydrochloride | Bioniche Animal Health Canada, Inc. | DIN 01989529 | |
| Xylazine | Bayer HealthCare, Bayer Inc. | DIN 02169592 | |
| Surgical drape | Proxima | DYNJP2405 | |
| Electric heating pad | Life Brand | 57800827375 | |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M60 | |
| Eye ointment (tear gel) | Novartis | T296/2 | |
| 7.5% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-151-16 | |
| 70% isopropyl alcohol | GreenField | P010IP7P | |
| 10% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-150-05 | |
| Scalpel handle (#3) | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blade (#15) | VWR | 89176-368 | |
| Spring Scissors curved | Fine science Tools | 15023-10 | |
| Baby-Mixter Hemostat | Fine science Tools | 13013-14 | |
| Fine Scissors | Fine science Tools | 14094-11 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine science Tools | 11151-10 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats | Fine science Tools | 13008-12 | |
| Micro-drill | Harvard Apparaus | 72-6065 | |
| Micro-drill burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | |
| Femur window chamber | PMCC machine shop | custom design | 9.1 mm- 8.5 mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9 mm (distance between two holes), 0.7 mm (thickness) |
| U-shaped bar | PMCC machine shop | custom design | 13.8 mm (length), 1.6 mm (width), 3.7 mm (height) |
| Coverglass (8 mm) | Warner Instruments | HBIO 64-0701 CS-8R | |
| Retaining ring (8 mm) | ACKLANDS GRAINGER | UNSPSC # 31163202 | |
| Nuts (hexagon stainless steel) | Fastenal | 70701 | |
| Dental cement | 3M | RelyX U200 | |
| Suture (5-0 Monosof black) | Covioien | SN-5698 | |
| Halsey needle holder | Fine Science Tools | 12501-13 | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Reckitt Benckiser | DIN 0281251 | |
| Meloxicam (Metacam) | Boehringer Ingelheim | DIN 02240463 | |
| Amoxicillin (Clamavox) | Pfizer | DIN 02027879 | |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD2000S | |
| APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1) | eBioscience | 17-9668 | |
| Two-photon microscope LSM 710 | Carl Zeiss | Zeiss LSM 710 NLO | |
| Imaging stage | PMCC machine shop | custom design | 15.9 cm (length), 11 cm (width), 0.9 cm (height) |
| Imaris software | Bitplane | Imaris 8.0 | Image analysis software described in Section 3 of the Protocol |
| Zen 2012 | Zeiss | Zen 2012 | Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol |
References
- Zhao, E., et al. Bone marrow and the control of immunity. Cell Mol Immunol. 9 (1), 11-19 (2012).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J Leukoc Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
- Fridlender, Z. G., Albelda, S. M. Tumor-associated neutrophils: friend or foe? Carcinogenesis. , (2012).
- Fridlender, Z. G., et al. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: 'N1' versus 'N2 TAN. Cancer Cell. 16 (3), 183-194 (2009).
- Coffelt, S. B., et al. IL-17-producing [ggr][dgr] T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis. Nature. 522 (7556), 345-348 (2015).
- Kitamura, T., Qian, B. Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nat Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).
- Granot, Z., et al. Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung. Cancer Cell. 20 (3), 300-314 (2011).
- Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicol Pathol. 34 (5), 548-565 (2006).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital Imaging. Cell. 147 (5), 983-991 (2011).
- Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging. IntraVital. 3 (2), e29917 (2014).
- Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. (96), e52476 (2015).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic Progenitor Cell Rolling in Bone Marrow Microvessels: Parallel Contributions by Endothelial Selectins and Vascular Cell Adhesion Molecule 1. J. Exp. Med. 188 (3), 465-474 (1998).
- Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow. J. Vis. Exp. (91), e51683 (2014).
- Lassailly, F., Foster, K., Lopez-Onieva, L., Currie, E., Bonnet, D. Multimodal imaging reveals structural and functional heterogeneity in different bone marrow compartments: functional implications on hematopoietic stem cells. Blood. 122 (10), 1730-1740 (2013).
- Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo. Methods Mol Biol. 750, 215-224 (2011).
- Balan, M., Kiefer, F. A novel model for ectopic, chronic, intravital multiphoton imaging of bone marrow vasculature and architecture in split femurs. IntraVital. 4 (2), e1066949 (2015).
- Hansen-Algenstaedt, N., et al. Femur window--a new approach to microcirculation of living bone in situ. J Orthop Res. 23 (5), 1073-1082 (2005).
- Xu, N., Lei, X., Liu, L. Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy. J. Vis. Exp. (55), e3296 (2011).
- Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
- Bucher, K., et al. Fluorescent Ly6G antibodies determine macrophage phagocytosis of neutrophils and alter the retrieval of neutrophils in mice. J Leukoc Biol. 98 (3), 365-372 (2015).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), (2013).
- Koewler, N. J., et al. Effects of a Monoclonal Antibody Raised Against Nerve Growth Factor on Skeletal Pain and Bone Healing After Fracture of the C57BL/6J Mouse Femur. J. Bone Miner Res. 22 (11), 1732-1742 (2007).
- Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).
- Liu, K., et al. A murine femoral segmental defect model for bone tissue engineering using a novel rigid internal fixation system. J Surg Res. 183 (2), 493-502 (2013).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
- Vacaru, A., Vitale, J., Nieves, J., Baron, M. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. Singh, S. R., Coppola, V. 1194, Springer. New York. 289-312 (2014).
