Introduction
Benmärg är ett viktigt organ som deltar i hematopoes och immunreglering. Den består av en hematopoetisk komponent innehållande hematopoietiska stam- och stamfaderceller (HSPCs), och en stromal komponent innehållande icke-hematopoetiska progenitorceller som ger upphov till mesenkymala celler 1. Två tredjedelar av hematopoetisk aktivitet är tillägnad generering av myeloidceller 2. I synnerhet, är ett stort antal neutrofiler som produceras i benmärgen, med 1-2 x 10 11 celler alstras per dag i en normal vuxen människa 2. Neutrofiler är de första försvarslinjen mot mikrobiella infektioner och är oftast reserverade i benmärgen tills stress utlöser deras mobilisering att komplettera perifera neutrofiler 1,3. Förutom sina antimikrobiella effekter, nya studier tyder på en viktig roll neutrofiler i cancerbiologi, som har både pro- och anti-tumörogena fenotyper beroende på transformerande tillväxtfaktorbeta (TGF-β) signalering i tumören mikromiljö 4,5. Dessutom studier har visat att neutrofiler som ackumuleras i primära tumörer utövar pro-tumörogena och metastaserande effekter genom att undertrycka cytotoxiska funktionen av T-celler 6,7, medan neutrofiler i omlopp utöva en cytotoxisk, anti-metastaserande effekt 8. Som sådan, är avgörande för att belysa deras roll i immun- och tumörreglering undersökning av hematopoietiska celler i benmärgen, i synnerhet neutrofiler,.
Histopatologi och en fullständig perifer blodstatus rutinmässigt används för att utvärdera cellulära och strukturella förändringar i benmärgen 9. Men bara dessa metoder ger statisk information av olika cellpopulationer eller vävnadsmikro. Längsgående in vivo imaging kan användas i kombination med standardmetoder för att bedöma dynamiken i flera cellulära, vaskulära och stromala komponenter samt cell-till-cELL interaktioner i ett längsgående sätt. Intravital mikroskopi (IVM), definierad som avbildning av levande djur vid mikroskopisk upplösning 10, är speciellt användbar för att bedöma dynamiska cellulära processer över tiden i samma prov, minska antalet försöksdjur krävs. IVM kombineras ofta med ett kroniskt trans fönster kammare (WC) för att komma åt organ av intresse för avbildning över en period av veckor till månader. Kraniala och rygg-skinfold WC modeller har den längsta historien av användning går tillbaka till mitten av 1990-talet. På senare tid har andra organspecifika WC modeller såsom de av bröstfettkudden och olika bukorganen utvecklats 11.
Den typiska tillvägagångssätt för avbildning benmärg in vivo har huvudsakligen arbetar exponering av calvaria av möss, där den förtunnade benet möjliggör direkt visualisering av enskilda celler med minimal kirurgiska ingrepp 12-14. Emellertid kan calvarial benmärg be skiljer sig från andra ben, såsom långa ben, vilket framgår av ett lägre antal HSPCs och hypoxiska celler i calvaria, vilket indikerar minskat underhåll och utveckling av HSPCs 15. Därför har alternativa metoder för att bedöma cellkomponenter i det långa benet undersökts. Dessa innefattar direkt exponering av lårbens benmärg 16 och ektopisk transplantation av split lårben i rygg skinfold WC 17. Emellertid är den tidigare en terminal förfarande som inte tillåter spårning av cellulära, strukturella och funktionella förändringar över längre tidsperioder, och senare troligen stör normal benmärgsfunktion på grund av transplantation av lårbenet till en ektopisk plats inuti rygg skinfold WC. En annan metod som gör det möjligt för orthotopic seriell avbildning av femoral benmärg över tiden är användningen av en WC i den femorala benet. En tidigare rapport visade långsiktiga avbildning av mikrocirkulationen i lårbens benmärgen med hjälp av enlårben WC i möss 18. Dessutom författarna visat visualisering av tumörceller i lårbenet, vilket indikerar dess användbarhet vid övervakning benmärgs metastas. Emellertid var detta WC konstruktion begränsas av sin storlek (1,2 cm diameter) och relativt liten bildyta (4 mm diameter), som var endast lämplig för stora möss (26-34 g, 3-6 månaders ålder) varigenom närma sig opraktiskt för rutinmässig användning.
Därför har en ny toalett med en mindre total storlek och större inner avbildning område som är avsett för ändamålet med denna studie. Målet med denna studie var att tillhandahålla ett förfarande för avbildning av olika celltyper i den femorala benmärgen. Lårbenet WC-modellen har utvecklats internt och användes för att visualisera och spåra neutrofiler inom 3D vaskulära nätverket. Med hjälp av denna modell, kan IVM i benmärgen göras seriellt över 40 dagar. Detta tillvägagångssätt kan tillämpas på en mängd olika områden för att klargöra processerna för hematopoies, immunreglering ennd tumörutveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla djur Arbetet utfördes enligt protokoll # 2615 godkändes av University Health Network Institutional Animal Care och användning kommittén.
1. Kirurgisk Beredning av Mouse
- Före operation, sterilisera alla kirurgiska instrument och fönsterkammaren (WC) genom autoklavering. Komplettera dricksvattnet med 50 mg / kg kroppsvikt av amoxicillin 2 dagar före operation. Injicera musen med 0,1 mg / kg kroppsvikt av buprenorfin intraperitonealt 4 h före operation.
- Söva atymiska nakna musen genom intraperitoneal injektion av 350-400 pl koksaltlösning innehållande 80 mg / kg ketamin och 13 mg / kg xylazin (Obs: Detta godkändes av Institutional Animal Care kommittén, och vi har inte haft någon erfarenhet med biverkningar ). Bekräfta korrekt anestesi genom att testa för mul reflex. Fortsätt att observera för andningsmönster, slemhinnor färg och fot reflex under förfarandet.
- Utföra den kirurgiska procedures enligt ett biosäkerhet skåp för att upprätthålla sterila förhållanden under operationen. Placera musen på en elektrisk värmedyna täckt med ett operationslakan för att upprätthålla kroppstemperatur under operationen. Utför alla kirurgiska ingrepp under stereomikroskop.
- Applicera ögonsalva för att hålla ögonen fuktiga under operationen. Upprepa om så behövs under den kirurgiska proceduren. Sterilisera verksamhetsområdet av musen genom att torka med 7,5% povidon-jod, 70% isopropylalkohol och 10% povidon-jod i följd, och upprepa proceduren två gånger.
- Gör en 10 mm längsgående snitt i huden med hjälp av skalpell med ett blad (# 15), närmar sig lårbenet från den laterala sidan. Exponera lårbenet mellan flexor och extensor muskler genom trubbig dissektion med pincett och peanger att säkerställa muskelfunktioner.
- Sätt in U-formade bar under benet och installera toalett (Figur 1). Fäst bar med fönstret med hjälp av två muttrar, och dra åt muttrarna med förceps. Fylla utrymmet mellan benet och WC med tandcement.
- Slipa ner det kortikala benet i en 6 x 2 mm 2 region med ett mikroborr för att få optisk access till märghålan.
Obs: försiktigt inspektera förtunning av kortikalt ben under mikroskop när de utför denna procedur. Lämna en intakt, nästan genomskinlig periosteala skiktet av benet. - Placera 8 mm coverglass på fönstret, och säkra coverglass med en låsring för att hålla den på plats.
- Justera muskulatur flexors och sträck tillbaka till sina ursprungliga platser med hjälp av pincett för att behålla sin funktion efter operationen. Sutur dermis använder 5-0 sutur och en nålhållare.
- Övervaka musen för återvinning, tills den är medveten och kan röra sig fritt. Placera djuret i en ny bur när de återvinns.
- Efter återhämtning, utföra bildtagning på djuret på samma dag eller följande dagar (se avsnitt 2). Övervaka den fysiskcal tillståndet hos mus dagligen.
Obs: Övervaka fysiska förhållanden, såsom viktbärande på lem, hunching, snabb eller ytlig andning, bakbens svullnad, självstympning, cellulit och svår dermatit. - Ge intraperitoneal injektion av 0,1 mg / kg kroppsvikt av buprenorfin i 3 dagar, och 1 mg / kg kroppsvikt av meloxikam i 5 dagar efter operationen för behandling av postoperativ smärta och inflammation. Fortsätta att ge den amoxicillin-kompletterat vatten under 5 dagar.
- Vid den experimentella endpoint, avliva djuret med CO 2 narkos följt av en sekundär metod (t.ex. halsdislokation).
2. Image Acquisition Använda Kombinerade fler foton och konfokalmikroskopi
- Före avbildning, söva musen genom intraperitoneal injektion av en 350-400 pl koksaltlösning innehållande 80 mg / kg ketamin och 13 mg / kg xylazin. Alternativt kan du använda inhalerbara anestesi, när dessa blir tillgängliga.Applicera ögonsalva.
- Injicera blandning av intravaskulära färgämnen för märkning kärl (0,65 mg två MDa Fluorescein (FITC) -dextran) och neutrofiler (4 pg av Allophycocyanine (APC) -anti-Ly6G antikropp).
- Använda en upprätt kombinerad multi-photon och konfokalt mikroskop utrustat med en multifoton laser allt 705-980 nm för två-foton-excitation, liksom enstaka foton lasrar som ger excitationsvåglängder från blått till rött.
- Ställ en skräddarsydd imaging skede på mikroskop (Figur 1B). Säkra musen på scenen genom att klämma fast de två ändarna av WC med krokodilklämmor.
Notera: Kritiska komponenter i stadiet är: två krokodilklämmor för att hålla WC, och ett värmeelement för att bibehålla fysiologisk temperatur (37 ° C) av musen under avbildning. - Slå på två-photon laser och konfokala systemet och starta bild förvärv programvara genom att klicka på "Start System". Ett fönster med 4 flikar (Lokalisera,Förvärv, förädling och underhålla) öppnas.
- Ställ in bildkanalerna. Klicka på "Smart Setup" under fliken Förvärv och välja de färgämnen som kommer att användas för avbildning: FITC (488 nm excitation, 493-588 nm emission) och APC (633 nm excitation och 638 till 743 nm emission). Välj "Best Signal" och klicka på "Apply".
- Lägg den andra harmoniska generationen (SHG) bildtagning kanal manuellt. Slå på två-photon laser under "Laser" fönster på fliken Acquisition. Under Kanaler fönstret, klicka på "+" tecken för att lägga till ett spår.
- Ställ in SHG spår. Ändra våglängden till 840 nm under Kanaler fönster med hjälp av upp- och nedpilarna och välj detektionsområdet att vara 415-425 nm under "Ljus Path" fönster med hjälp av skjutreglaget.
- Klicka på "Oculars Online" under fliken Lokalisera. Klicka FITC under inställningen filter för FITC att se regionen av intresse och justera fokus manuellt genom att vrida than fokusera ratten på sidan av mikroskopet. När regionen av intresse ligger, klicka på "Oculars offline" under fliken Lokalisera.
- Klicka på fliken Acquisition. Välj FITC spår under Kanaler fönstret och klicka på "Live" för att förhandsgranska bilden av FITC-dextran med 5X mål. Justera fokus om det behövs, och klicka på "Stop" under fliken Acquisition att stoppa förhandsgranskningen.
- sväng manuellt till 20X vatten mål genom att flytta ett hjul över linserna. Se bilden igen för FITC-dextran med hjälp av 20X objektiv och justera huvud Gain och Pinhole under Kanaler fönstret för att uppnå optimal signal och kontrast. Upprepa för andra kanaler, genom att välja APC och SHG spår under Kanaler fönstret.
- Välj bildparametrar. Klicka på "Acquisition Mode" för att öppna fönstret. Ställ in bildstorleken vara 1024 x 1024 pixlar, och utjämning av 4X att få högkvalitativa bilder.
- Skaffa en 2D ögonblicksbild. Välj alla kanaler under Kanaler vinnerdow och klicka på "Snap" under fliken Acquisition. Kontrollera kvaliteten på bilden och ändra avbildning parametrar om det behövs.
- Förvärva 2D time-lapse bild.
- Bocka av "Time Series" på fliken Förvärv för att öppna tidsserierna fönstret. Skriv in 0 under intervall och 40 för det totala antalet sökningar för att ta 40 bilder kontinuerligt utan tidsintervallet.
Obs: 40 skannar genererar cirka fem minuter lång tidsserier med en skanningshastighet på 7,5 sek / ram och bildstorlek 600 pm x 600 pm. Justera intervall och antalet sökningar beroende på mikroskopet, bildupptagning inställningar och bildhastighet av kameran. Ett fast tidsintervall (> 0 sek) kan användas för att jämföra tidsförlopp bilder som förvärvats vid olika tidpunkter. En längre tidsförlopp imaging varaktighet kan krävas beroende på den förväntade medelhastigheten av neutrofiler (eller andra celler av intresse) i experimentell skick.
- Bocka av "Time Series" på fliken Förvärv för att öppna tidsserierna fönstret. Skriv in 0 under intervall och 40 för det totala antalet sökningar för att ta 40 bilder kontinuerligt utan tidsintervallet.
- Förvärva 3D-bild.
- Bocka av "Z-Stack" på fliken Acquisition att öppna Z-Stack fönster. Starta "Live" förhandsvisning läge för FITC-dextran. Fokus på toppen av provet och klicka på "Set först", och fokusera på den andra änden av provet och klicka på "Set Senaste" i Z-stack fönster.
- Ställ in intervall att vara 10 um under Z-stack fönster. Beroende på den första och den sista optiska skiva som valts i föregående steg, kommer detta att generera 10-20 skivor, med totala optiska tjockleken på 90-180 pm.
Obs! Z-stack intervallet är beroende av storleken på det hål, som bestämmer tjockleken på den optiska skiva. Ställer in intervallet att vara mindre än tjockleken hos den optiska skiva. - Klicka på "Start Experiment" under fliken Förvärv att börja samla bilder.
- Förvärva 3D time-lapse bild.
- Bocka av "Time Series" och "Z-stack" på fliken Förvärv för att öppna tidsseriernaoch Z-stack fönster.
- Ställ in Time Series och Z-stack insamlingsparametrar som beskrivs i steg 2.14 och 2.15. Klicka på "Start Experiment" under fliken Förvärv att börja samla bilder.
- Övervaka musen under avbildning för att se till att den är stabil och medvetslös. Om musen är instabil och / eller medvetet under avbildning, ta bort musen från scenen, injicera ytterligare 100-150 mikroliter av bedövningsmedel lösning intraperitonealt, och fortsätta avbildning.
Obs: Tecken på instabilitet inkluderar snabb andning och rörelse av musen, som kan ses som att flytta artefakter i förvärvade bilder. - Efter bildtagning, ta musen från scenen och returnera den till buren. Använd en värmelampa för att hålla det varmt, och övervaka musen tills det är vid medvetande.
3. Bildanalys och kvantifiering
- Använd bildanalys programvara för att analysera data 3D och tidsserie. Öppna mjukvaran ochlägga till bilder genom att dra dem i öppna skärmen, som kallas "Arena" vy. Dubbelklicka på en bildfil för att öppna den; bilden kommer att öppnas under "Surpass" vy.
- Skapa en 2D / 3D-bild.
- Från "More" bar finns på det övre högra hörnet, klicka på "Redigera / Visa Display Justering" för att öppna "Display Justering" fönstret. Optimera fluorescens displayen genom att justera trösklarna för varje kanal, och ta en ögonblicksbild för att spara bilden.
- Generera objekt spår med tidsförlopp bilder.
- Öppna den bild som ska analyseras under "Surpass" vy. Klicka på ikonen med en bild av orange prickar fann under ikonen "Surpass". Detta kommer att öppna en ny "Spots" fönstret.
- Bocka av "Track fläckar (över tid)" och klicka på den blå pilen för att gå till nästa steg. Välj kanal som innehåller objekten att spåra under "Source Channel", och ange den beräknade objekt Diameter under "Beräknad XY Diameter" genom att skriva en siffra i. Klicka på den blå pilen för att gå till nästa steg.
Obs! Neutrofila spårning, välja kanal som innehåller APC fluorescens för neutrofiler och ange objektdiameter till 12 um baseras på de kända storleken av neutrofiler. - I fönstret, hitta och välja "Quality" filter genom att klicka på nedåtpilen. Observera fläckarna definieras av programvaran och justera tröskeln manuellt för att inkludera eller exkludera fläckar. När tröskeln definieras genom att klicka på den blå pilen för att gå till "Tracking" steg.
- Enligt algoritm, hitta och välja "Autoregressive Motion Algorithm" genom att klicka på nedåtpilen. Skriv in 10 pm för "Max Avstånd" och tre för "Max Gap Size" finns under parametrar. Bocka av "fylla luckorna med alla upptäckta objekt" för att börja spåra och klicka på den blå pilen för att gå till nästa steg.
Obs: "Autoregressive rörelse algoritm" används feller föremål som har riktade rörelse, eftersom det genererar spår utifrån förutspådde plats från föregående rörelse. "Max Avstånd" och "Max Gap Size" kan justeras beroende på den förväntade dimension och hastigheten hos det objekt som spåras, samt den totala varaktigheten för time-lapse bild. - Under Filtreringstyp, välj "Track Längd" filter. Klicka på den gröna pilen för att avsluta spårning och kontrollera de spår som genererades. Gå tillbaka till föregående steg, om nödvändigt att manuellt sortera spåren.
- Om den genererade tidsförlopp bild drivor, korrigera för translationell drift.
- Klicka på ikonen med en bild av en blyertspenna. Detta är en flik redigering som öppnar "Redigera Tracks" fönstret. Undersök time-lapse bilden och hitta en referens plats som inte bör gå för alla bilder.
- I det övre vänstra hörnet av skärmen, hitta "Pointer" fönster och bocka av "Välj" för att aktivera cursor för val av en plats. Klicka på referens plats.
- Klicka på "Rätt Drift" i "Redigera spår" fönstret. Bocka av "Translational Drift". Programvaran kommer automatiskt generera den korrigerade serie bilder.
- Mät cellulär rörelse definieras av objekt spåren i tidsförlopp bilder.
- Under "Redigera spår" fönster, bocka av "Tracks" och välja ett spår som representerar rörelsen hos en cell. Det valda spåret kommer att markeras i gult i tidsseriebild.
- Klicka på ikonen med en bild av en graf för att öppna "Statistik" fönster (fliken statistik).
- Under "Val", välj "banan Mean" genom att klicka på nedåtpilen för att generera banan betyda för det valda spåret. Välj olika spår och upprepa stegen för att mäta spår hastighet betyda för alla celler av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Murin lårbens benmärg framgångsrikt nås med hjälp av WC för att möjliggöra visualisering av enskilda neutrofiler och vaskulära nätverk. Figur 1 visar WC instrument och beskriver det kirurgiska ingreppet, som innebär exponering av lårbens ben och förtunning av kortikalt ben för att få optisk access inuti ben. Operationen är väl tolererad i möss; de bedömdes för negativa fysiska reaktioner, såsom bakbens svullnad, icke-viktbärande på lem, självstympning, cellulit och dermatit, samt skador på WC i 5 dagar efter operation, med ingen rapport om nöd. Noterbart är att fönstret förblir optiskt klar för IVM för upp till 40 dagar, vilket kan göra det möjligt för en långsiktig bedömning av cellulära och strukturella förändringar efter ett ingripande.
Kärl i benmärgen kan visualiseras genom intravaskulära färgämnen, såsom FITC-dextran(Figur 2). Eftersom kontrasten är beroende på injektion av färgämnet, representerar den förvärvade bilden funktionell vaskulatur där det finns tillräckligt blodflöde. Förutom vaskulaturen, kan neutrofiler färgas in vivo med användning av anti-Ly6G antikropp. Figur 3A och 3B representerar samma område i benmärgen observerades vid olika tidpunkter, där neutrofiler syns både i det intravaskulära och extravaskulära rummet. Dessa områden kännetecknas av kärllandmärken. Rodamin 6G kan användas som ett alternativ till anti-Ly6G att färga neutrofiler in vivo; emellertid, diffunderar den ut ur vaskulaturen och fläckar monocyter i det extravaskulära utrymmet på ett icke-specifikt sätt. Därför är anti Ly6G att föredra, eftersom den möjliggör specifik avbildning av neutrofiler. Figur 3C representerar avbildning av det kortikala benet, vilket i huvudsak består av kollagenfibrer. Den maximala djup för avbildning uppnåsi detta experiment är 180 | im (figur 3C).
Time-lapse fluorescens avbildning underlättar spårning och kvantifiering av cellrörelse in vivo. Figur 4A visar spårning av neutrofiler i benmärgen vaskulära nisch. Avbildning med utan extra tidsintervallet mellan varje avsökning medger noggrann spårning av celler; emellertid är vissa användarinmatning erfordras för att ytterligare förbättra noggrannheten i spår som genereras av mjukvaran. Spårning av fläckar (dvs., celler av intresse) möjliggör kvantifiering av olika parametrar, såsom genomsnittliga spårhastighet (figur 4B). Andra parametrar som kan mätas innefattar, men är inte begränsade till, spårlängd, ändring i punktstorlek, form och intensitet. Denna analys ger kvantifiering av olika parametrar som förbättrar karakterisering av cellulära rörelser och interaktioner.
Figur 1: lårbenet fönster kammare (WC), avbildning skede och det kirurgiska ingreppet (A) Skräddarsydda titan lårben WC med en U-formad bar som tjänar till att fixera lårbenet på plats.. WC har en 8 mm täck diameter glas, säkras genom en snäppring. (B) Skräddarsydda avbildning skede. Ett värmeelement är placerat på botten av scenen för att upprätthålla den fysiologiska temperaturen av musen under avbildning. De två krokodilklämmor används för att hålla den WC. (C - H) Kirurgisk procedur för att installera lårbenet WC. (C) Lårbenet exponeras mellan flexor och extensor muskler. Muskler tas inte bort under förfarandet. (D) Den U-formade bar placeras under lårbenet, och (E) WC är installerad och fästs med två muttrar. (F) Dental cement appliceras mellan benet ochWC för att fylla utrymmet. (G) Dermis sys och (H) täckglaset är fixerad på plats med låsringen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: 3D fluorescens avbildning av vaskulära nätverket i benmärgen in vivo representativ bild av kärlsystemet i benmärgen, avbildas genom lårbenet WC.. Kärl (grön) visualiseras genom injektion i svansvenen av två MDa FITC-dextran. Skalstreck = 100 nm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: 3D-avbildning av vaskulära nätverket, neutrofiler och benmatris in vivo Bilder av kärl och neutrofiler i benmärgen (A) 3 dagar och (B) 10 dagar efter lårbenet WC kirurgi.. Neutrofiler, färgade med injektion i svansvenen av APC-märkt Ly6G antikropp, ses både i de intravaskulära och extravaskulära utrymmen. Pilarna pekar på den vaskulära strukturen sett på båda dagarna, vilket indikerar möjligheten att spåra samma plats med tiden. Skalstreck = 50 | im. (C) benmatrisen kan visualiseras med användning av SHG (vit), förutom att vaskulatur (grön) och neutrofiler (röd). Bilden förvärvades 40 dagar efter WC operationen. Skala bar = 70 pm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Spårning neutrofila rörlighet inom det vaskulära nätverket av benmärgen in vivo (A) Spår vägar neutrofiler inom det vaskulära nätverket.. Spår genereras automatiskt med hjälp av programvarans inbyggda Autoregressive Motion algoritm. Varje vit prick representerar en mittpunkt av en partikel som spåras (neutrofiler). Skalstreck = 50 | im. (B) Medel banan mätt för intravaskulära och extravaskulära neutrofiler, vilket indikerar skillnaden i rörelse av neutrofiler (Error bar = medelvärde + SD, * p = 0,0176, tvåsidigt t-test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Realtid, seriell avbildning av de dynamiska cellulära processer i benmärg ger information som annars är utmanande att erhålla med användning av konventionella tekniker, såsom histologi och totala blodstatus. Lårbenet WC modell som beskrivs här ger unika möjligheter att undersöka cellulära och strukturella förändringar i benmärgen över tiden. Även ett lårben WC modell har tidigare rapporterats, ger vår nya design en större avbildning synfält och mindre total toalett storlek, som är mer kompatibel för användning hos vuxna möss. Lårbenet WC-modellen kan användas i en mängd olika musstammar inkluderande immunkompetenta och / eller transgena reporter möss.
Det finns viktiga steg under operationen som avgör den totala utbildningstiden och kvaliteten på avbildning. När exponera lårbenet, är endast en trubbig dissektion av muskler mellan flexors och extensorer utförs; avlägsnande av dessa muskler kan leda till minskad rörlighet på musen och must undvikas. Vidare, slipning av det kortikala benet måste utföras noggrant. Slipning approximativt 50 ^ m är tillräcklig för optisk avbildning samtidigt som den strukturella integriteten hos den femorala vaskulära nätverket. Applicering av dentalcement runt benet är avgörande för tätning av kirurgiskt exponerade området, vilket förhindrar vätskeansamling, och bibehålla en klar optisk avbildning fönster för över en månad och samtidigt minska risken för infektion. Dentala cement verkar även för att fixera WC på plats, vilket förhindrar den WC från att rotera runt den femorala benet. Slutligen är snäppringen används för att hålla täckglas lämpar sig för användning med vatten nedsänkning lins, som ger vatten-tätning. Snäppringen rekommenderas över lim för att fästa täckglas till WC eftersom tillsats av bindemedel kan öka gapet mellan benet och coverglass, eller placera coverglass med en liten vinkel i förhållande till bildplanet, varigenom uppnås inträngningsdjupet för avbildning. DessutomÄr snäppringen användbart när coverglass behöver rengöras eller bytas ut.
Förutom kirurgi, det finns flera viktiga steg för att uppnå framgångsrik optisk avbildning av benmärgen. Till bilden inuti lårbenet WC, är WC placeras horisontellt till bild scenen för korrekt nedsänkning av objektiv. Skräddarsydd imaging steget är lämplig för detta ändamål eftersom det tillåter för justering av vinkeln på WC med avseende på linsen. Dessutom utformningen av WC, i synnerhet storleken på den U-formade bar, upprätthåller benet i ett horisontellt läge så nära coverglass som möjligt för att uppnå optimal penetrationsdjup. Under avbildning kan andningsartefakter observeras som horisontella linjer i fluorescensbilder. Förutom att säkerställa WC till avbildningssteget kan temperaturen hos uppvärmningselementet under avbildningssteget justeras för att på lämpligt sätt värma djuret för att minimera överdriven andning. Ett tunt skikt av gasvävkan placeras mellan musen och den uppvärmda scenen för att ytterligare bidra till att minska andningsartefakter under avbildning. Beroende på biologisk avbildning målet kan förvärvs parametrar såsom bildhastighet, avbildningsvolymen och bildbehandling varaktighet också justeras för att samla tillräckligt med bilder för att hantera experimentella frågor. Till exempel kan hastigheten för neutrofil migration och genomsökning skilja under olika experimentella förhållanden, från 2,8 ^ m / min för bosatta neutrofiler under basala betingelser till någonstans i intervallet 5-10 | j, m / min för neutrofiler i inflammatoriska tillstånd 19-21. Således skulle en lämplig utskriftshastighet och varaktighet för neutrofila spårning in vivo också variera beroende på experimentella betingelser. Dessutom, såsom framgår av resultaten, spårning av celler i vaskulaturen skulle kräva en snabb bildkamera med en hög bildhastighet (30 bilder / sek). Men om målcellerna är bosatta i extravaskulärt, eller om cellen till cell interaction intresse förväntas ske långsammare, bör bildkvalitet prioriteras över utskriftshastighet.
Påverkan av injicerade antikroppar för in vivo-cellfärgning på cellulär funktion måste också beaktas. I vår studie har vi använt anti-Ly6G antikropp (1A8 klon), som vanligtvis används vid höga doser (150-250 pg) att tömma neutrofiler från cirkulationen och studera deras roll i olika sjukdomsmodeller. Yipp och Kubes visade att fluorokrom-märkt anti-Ly6G antikropp inte stör leukocytrekrytering vid låga intravaskulär injektion doser (1-40 ug) 22. Tyder emellertid en mer nyligen genomförd studie som fluorokromer, som har stora skillnader i molekylvikt och kemisk struktur, kan differentiellt påverka funktionen av anti-Ly6G 23. Studien visade att FITC-märkt anti-Ly6G, men inte PE- och APC-märkta antikroppar, effektivt utarmar neutrofiler in vivo vid en låg koncentration (30 | j, g).I vår studie har vi inte observera neutrofila utarmning övertid med hjälp av fyra mikrogram av APC-märkt anti-Ly6G. Icke desto mindre är ytterligare karaktärisering av funktionen av fluorokrom-märkt anti-Ly6G antikropp in vivo erfordras för att validera dess användning i intravital avbildning. Detta gäller även för andra antikroppar som har funktionell förmåga att förändra cellulära interaktioner. Som ett alternativ till in vivo-cellfärgning med antikroppar, transgena reporter möss 24 och / eller märkta fluorescerande celler 25 kan användas för att visualisera neutrofiler eller andra cellpopulationen av intresse in vivo.
Lårbenet WC modell som beskrivs i detta protokoll gör det möjligt för bildbehandling i upp till 40 dagar efter operationen. Några av utmaningarna för långsiktig avbildning med denna toalett modell inkluderar fördröjd skelett läkningsprocessen och underhåll av en ren glasfönster. Särskilt vi inte observera uppenbara tecken på benläkning efter WC implantation, vilket skulle include förtjockning av periostet; Detta är inte oväntat med tanke på att benläkning process sker vanligen efter 1 ½-3 månader 26,27. Upprätthållandet av en ren och optiskt klara fönstret kan uppnås genom applicering av det dentala cement, och användningen av snäppringen och coverglass som ger en fast vatten-tätning med vävnaden. Coverglass kan ibland rengöras med bomulls tips från utsidan för att ta bort damm och skräp. WC har en bred bildfältet, nästan täcker hela längden av diafysen regionen (cirka 8,4-8,6 mm 28), vilket gör det bättre än det tidigare publicerade modellen 18. Men tillgång till de distala regionerna och djupare märghålan är begränsad. I synnerhet är det trabekulära rika metafys, som ligger vid de distala ändarna av diafysen, kända för att vara rika på hPSCs 29. Dessa områden kan nås histologiskt eller genom IVM som en terminal förfarande. Alternativt, olika avbildningsmetoder såsom mikro-compgit tomografi kan användas för att avbilda de distala områdena av benmärg in vivo 30. Sådana metoder kompletterar IVM, vilket ger en integrerad strategi för att bedöma anatomi och de olika cellulära och strukturella förändringar och interaktion i benmärgen.
Protokollet som beskrivs här erbjuder ett nytt tillvägagångssätt för långsiktig spatiotemporala bedömning av den femorala benmärgen hos möss vid cellulär upplösning. De metoder som presenteras möjliggöra in vivo serie imaging att spåra rörelserna hos en enda cell eller cellpopulationer över biologiskt relevanta tidsskalor, samtidigt erhålla strukturell och funktionell information i benmärgen. Dessutom kan utföras kvantitativ bildanalys för att ytterligare karakterisera cellulära och funktionella förändringar, såsom spårning av cellulära rörelser. Tillämpningen av denna lårbenet WC modell i olika stammar av möss, särskilt i transgena reporter möss 31,kan ytterligare underlätta undersökning av flera individuellt märkta cellpopulationer såsom de som är involverade i blodbildningen. Därför är den beskrivna protokollet allmänt gäller för ett brett spektrum av prekliniska studier med olika biologiska processer i levande mus benmärgen, däribland undersökningar i hematopoies, leukemi, HPSC transplantation, immunreglering, benmärgsmikro (t.ex. hypoxisk nisch) och bidraget av immunceller till tumörprogression och metastas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Advanced optisk mikroskopi Facility (www.aomf.ca) vid University Health Network för att få hjälp med mikroskopi, och Mr Jason Ellis från Princess Margaret Cancer Center Machine Shop för tillverkning av toalett och bildstadiet. Vi vill också tacka Dr Iris Kulbatski för manus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NRCNU-F athymic nude mice | Taconic | Ncr nude | 8-10 weeks old, female |
| Saline | Baxter | JB1302P | |
| Ketamine hydrochloride | Bioniche Animal Health Canada, Inc. | DIN 01989529 | |
| Xylazine | Bayer HealthCare, Bayer Inc. | DIN 02169592 | |
| Surgical drape | Proxima | DYNJP2405 | |
| Electric heating pad | Life Brand | 57800827375 | |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M60 | |
| Eye ointment (tear gel) | Novartis | T296/2 | |
| 7.5% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-151-16 | |
| 70% isopropyl alcohol | GreenField | P010IP7P | |
| 10% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-150-05 | |
| Scalpel handle (#3) | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blade (#15) | VWR | 89176-368 | |
| Spring Scissors curved | Fine science Tools | 15023-10 | |
| Baby-Mixter Hemostat | Fine science Tools | 13013-14 | |
| Fine Scissors | Fine science Tools | 14094-11 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine science Tools | 11151-10 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats | Fine science Tools | 13008-12 | |
| Micro-drill | Harvard Apparaus | 72-6065 | |
| Micro-drill burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | |
| Femur window chamber | PMCC machine shop | custom design | 9.1 mm- 8.5 mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9 mm (distance between two holes), 0.7 mm (thickness) |
| U-shaped bar | PMCC machine shop | custom design | 13.8 mm (length), 1.6 mm (width), 3.7 mm (height) |
| Coverglass (8 mm) | Warner Instruments | HBIO 64-0701 CS-8R | |
| Retaining ring (8 mm) | ACKLANDS GRAINGER | UNSPSC # 31163202 | |
| Nuts (hexagon stainless steel) | Fastenal | 70701 | |
| Dental cement | 3M | RelyX U200 | |
| Suture (5-0 Monosof black) | Covioien | SN-5698 | |
| Halsey needle holder | Fine Science Tools | 12501-13 | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Reckitt Benckiser | DIN 0281251 | |
| Meloxicam (Metacam) | Boehringer Ingelheim | DIN 02240463 | |
| Amoxicillin (Clamavox) | Pfizer | DIN 02027879 | |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD2000S | |
| APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1) | eBioscience | 17-9668 | |
| Two-photon microscope LSM 710 | Carl Zeiss | Zeiss LSM 710 NLO | |
| Imaging stage | PMCC machine shop | custom design | 15.9 cm (length), 11 cm (width), 0.9 cm (height) |
| Imaris software | Bitplane | Imaris 8.0 | Image analysis software described in Section 3 of the Protocol |
| Zen 2012 | Zeiss | Zen 2012 | Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol |
References
- Zhao, E., et al. Bone marrow and the control of immunity. Cell Mol Immunol. 9 (1), 11-19 (2012).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J Leukoc Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
- Fridlender, Z. G., Albelda, S. M. Tumor-associated neutrophils: friend or foe? Carcinogenesis. , (2012).
- Fridlender, Z. G., et al. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: 'N1' versus 'N2 TAN. Cancer Cell. 16 (3), 183-194 (2009).
- Coffelt, S. B., et al. IL-17-producing [ggr][dgr] T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis. Nature. 522 (7556), 345-348 (2015).
- Kitamura, T., Qian, B. Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nat Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).
- Granot, Z., et al. Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung. Cancer Cell. 20 (3), 300-314 (2011).
- Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicol Pathol. 34 (5), 548-565 (2006).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital Imaging. Cell. 147 (5), 983-991 (2011).
- Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging. IntraVital. 3 (2), e29917 (2014).
- Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. (96), e52476 (2015).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic Progenitor Cell Rolling in Bone Marrow Microvessels: Parallel Contributions by Endothelial Selectins and Vascular Cell Adhesion Molecule 1. J. Exp. Med. 188 (3), 465-474 (1998).
- Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow. J. Vis. Exp. (91), e51683 (2014).
- Lassailly, F., Foster, K., Lopez-Onieva, L., Currie, E., Bonnet, D. Multimodal imaging reveals structural and functional heterogeneity in different bone marrow compartments: functional implications on hematopoietic stem cells. Blood. 122 (10), 1730-1740 (2013).
- Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo. Methods Mol Biol. 750, 215-224 (2011).
- Balan, M., Kiefer, F. A novel model for ectopic, chronic, intravital multiphoton imaging of bone marrow vasculature and architecture in split femurs. IntraVital. 4 (2), e1066949 (2015).
- Hansen-Algenstaedt, N., et al. Femur window--a new approach to microcirculation of living bone in situ. J Orthop Res. 23 (5), 1073-1082 (2005).
- Xu, N., Lei, X., Liu, L. Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy. J. Vis. Exp. (55), e3296 (2011).
- Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
- Bucher, K., et al. Fluorescent Ly6G antibodies determine macrophage phagocytosis of neutrophils and alter the retrieval of neutrophils in mice. J Leukoc Biol. 98 (3), 365-372 (2015).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), (2013).
- Koewler, N. J., et al. Effects of a Monoclonal Antibody Raised Against Nerve Growth Factor on Skeletal Pain and Bone Healing After Fracture of the C57BL/6J Mouse Femur. J. Bone Miner Res. 22 (11), 1732-1742 (2007).
- Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).
- Liu, K., et al. A murine femoral segmental defect model for bone tissue engineering using a novel rigid internal fixation system. J Surg Res. 183 (2), 493-502 (2013).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
- Vacaru, A., Vitale, J., Nieves, J., Baron, M. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. Singh, S. R., Coppola, V. 1194, Springer. New York. 289-312 (2014).
