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Summary
Um protocolo de pull-down ARN é optimizado aqui para a detecção de interacções entre proteínas de ligação a ARN (RBPs) e não-codificante, bem como ARN de codificação. Um fragmento de ARN a partir do receptor de androgénio (AR) foi usado como um exemplo para demonstrar como recuperar a sua RBP de lystate de adipócitos primários castanhos.
Abstract
proteínas de ligação a ARN (RBPs) estão a emergir como uma camada reguladora no desenvolvimento e função do tecido adiposo. RBPs desempenhar um papel-chave na regulação da expressão de genes aos níveis pós-transcricional por afectar a estabilidade e eficiência de translação de ARNm alvo. técnica pull-down ARN tem sido amplamente utilizado para estudar a interacção RNA-proteína, que é necessário para elucidar o mecanismo subjacente a função ', bem como RNAs não-codificantes longos' RBPs (lncRNAs). No entanto, a abundância de lípidos alta nos adipócitos representa um desafio técnico na realização deste experimento. Aqui, um protocolo de pull-down RNA detalhada é otimizado para a cultura de adipócitos primário. Um fragmento de RNA a partir de (AR) «Região do receptor de andrógeno 3 não traduzida (3'UTR) contendo um elementwas rica adenilato-uridilato usados como exemplo para demonstrar como recuperar seu parceiro RBP, proteína Hur, de lystate adipócitos. O método descrito aqui pode ser aplicado para detectar as interacções entreRBPs e RNAs não codificadoras, bem como entre RBPs e RNAs de codificação.
Introduction
RBPs são proteínas que se ligam ao ARN de cadeia dupla ou simples em células e participam na formação de complexos de ARN-proteína. RBPs pode ligar-se uma variedade de espécies de ARN, incluindo ARNm e ARN não codificantes longos (lncRNAs), e exercem a sua influência aos níveis pós-transcricional. Ambos os RBPs e lncRNAs estão emergindo como novos reguladores no desenvolvimento adiposo e funcionar 1,2,3. Para compreender o mecanismo de RBP- e regulação mediada por lncRNA de vias celulares, é muitas vezes necessário para detectar a interacção entre uma molécula de ARN específica e um ou vários RBPs, e, por vezes, para identificar o espectro completo de parceiros proteicos de um ARN transcrição. No entanto, a experiência pode ser um desafio devido ao seu elevado teor de lípidos em adipócitos. O ARN protocolo suspenso descrito aqui pode ser utilizado para recuperar os parceiros de proteína de um RNA específico a partir dos lisados de culturas de adipócitos primários 4,5.
Justificativa para este protoCol é resumido como se segue. Um isco ARN é transcrito in vitro a partir de um molde de ADN, e conjugado com estreptavidina-revestida esferas magnéticas 4 marcado com biotina. O isco de ARN é incubada com lisados celulares para permitir a formação de complexos de ARN-proteína, que são subsequentemente puxadas para baixo sobre um suporte magnético. Mais especificamente, o ARN protocolo suspenso descrito abaixo utilizar um fragmento de ARN de AR 3'UTR como a isca para recuperar proteína Hur, uma RBP universalmente expresso ligado a 3'UTR do ARNm de 6,7, a partir de uma cultura primária theadipocytelysate. Para testar a especificidade de ligação deste ensaio, um RNAas não-relevantes bem como em branco esferas de estreptavidina é incluído como controlo. Este protocolo é compatível com western blot ou espectrometria de massa (MS) para confirmar a captura de um RBP específico ou para identificar o repertório cheio de RBPs capturados, respectivamente 8.
Estão disponíveis várias técnicas para estudar a interacção RNA-proteínas. Para revelar RNAs ligados por um determinado RBP, RIP (imunoprecipitação RNA) e CLIP (reticulação UV e imunoprecipitação) pode ser aplicado. Em contraste, para identificar parceiros de proteína de um determinado ARN, ARN suspenso, CHIRP (isolamento cromatina por purificação de ARN), QUADRO (análise de hibridação de captura de alvos de ARN) e RAP (purificação de ARN anti-sentido) pode ser aplicado. Em comparação com os posteriores, a técnica de pull-down RNA leva menos esforço para configurar. Pode ser empregue para capturar as proteínas in vitro e in vivo. A abordagem in vivo de RNA pull-down, que é tecnicamente mais exigente do que o seu homólogo in vitro, preserva interações RNA-proteína por reticulação nas células, capta RNAs marcado com aptâmeros de interesse a partir de células e, posteriormente detecta RBPs encadernados. ARN pull-down pode ser utilizado para enriquecer baixas RBPs abundantes, e para isolar e identificar os complexos de ARN-proteína que têm diversos papéis funcionais no controlo de regulação celular 9,10
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Protocol
NOTA: O ARN de interesse no contexto do presente estudo é um fragmento da 3'UTR AR.
1. Preparação de ARN-biotina marcado
- Para obter o RNA, amplificar T7-AR-oligo por PCR, seguida por transcrição in vitro utilizando um estojo comercial e seguindo as instruções do fabricante 11.
NOTA: Os primers para PCR estão listadas na Tabela 4: T7-AR-F e T7-AR-R. - Para o controlo de ligação não específico, amplificar uma sequência parcial do ADN de luciferase de pirilampo (FL) por PCR a partir do plasmídeo psiCHECK-2, seguido por transcrição in vitro.
NOTA: Os primers para PCR estão listadas na Tabela 4: hluc (+) - T7-sonda-F e hluc (+) - R-sonda Tabela 4 sequências de molde e os iniciadores para amplificação por PCR... - Para uma reacção de PCR de 50 uL, misturar 50 ng de ADN (oligo ou plasmídeo), 4 ul de dNTPs (2,5 mM de cada dNTP individuais), 5 ul de tampão de reacção 10x, 1 ul de 2,5 U / & #181; L de polimerase de ADN, 2 ul de 10 mM de iniciadores para a frente, 2 ul de 10 mM de primer reverso, e água isenta de nuclease.
- Executar a amplificação por PCR num termociclador utilizando o seguinte programa. Passo 1: um ciclo de 95 ° C durante 2 min; Passo 2: 35 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg e 72 ° C durante 30 seg (AR) ou 60 seg (FL); Passo 3: um ciclo de 72 ° C durante 10 min.
- Sintetizar ARN biotinilado utilizando um kit de transcrição in vitro, seguindo as instruções do fabricante 11. Neste experimento, use produtos de PCR como modelos para a síntese de RNA. Por um pi in vitro da reacção de 20 transcrição, misturar 200 ng de PCR amplificado de DNA, 2 ul de cada NTP indivíduo, 1 ul 10 mM de biotina-CTP, 2 ul de tampão de reacção 10x, e 2 ul de ARN-polimerase de T7. Incubar a mistura a 37 ° C durante 4 h.
- Após a transcrição in vitro, a mistura de reacção com um mimo ul de 2 U / mL de ADNase a 37 & #176; C durante 15 minutos para degradar ADN molde. Por fim, dilui-se o ARN biotinilado para um volume total de 60 uL para a purificação subsequente.
- Purifica-se ARN biotinilados para remover os sais e os nucleótidos não incorporados utilizando colunas de purificação de acordo com as instruções do fabricante 12. Medir a concentração de ARN e armazenar a -80 ° C para ensaios subsequentes pull-down.
- Para garantir que a estrutura secundária adequada para o ARN de interesse na interacção RNA-proteína, de calor 50 ul de ARN biotinilado (50 pM) a 90 ° C durante 2 min, frio em gelo durante 2 min, em seguida, fornecer com 50 tampão de RNA estrutura ul 2x (Tabela 3), e para permitir o dobramento de RNA, à TA durante 30 min 13,14.
2. Preparação de Grânulos de ARN-conjugado
NOTA: Use um suporte magnético para a separação das esferas magnéticas e sobrenadante.
- Ressuspender as esferas magnéticas revestidas com estreptavidina dentro do recipiente original por breve vortexing seguindo as instruções do fabricante. Transferir 150 ul grânulos em suspensão para um tubo de 1,5 ml. Colocar o tubo no ímã para 1 min. sobrenadante de descarte. Mantenha talão pellet.
NOTA: Em ensaios de pull-down de ARN, quando alíquotas grânulos em suspensão do frasco original, use 50 pérolas ul para um ensaio seguido por western blot e 200 pérolas ul para um ensaio seguido por MS. - Lavar as pérolas uma vez por re-suspensão do grânulo pelete com 1 ml da recomendada pelo fabricante 1x tampão B W & (Tabela 3) (de ligação e de lavagem), seguindo-se a rotação do tubo durante 5 min à temperatura ambiente num rotador. sobrenadante de descarte. Mantenha talão pellet.
- Para inactivar RNase em grânulos, esferas de lavar duas vezes, de cada vez por re-suspensão da pelota talão com 400 uL de tampão A. O tampão A é uma solução alcalina contendo NaOH 0,1 M e NaCl 0,05 M (Tabela 3). Girar o tubo durante 2 min à temperatura ambiente num rotador. sobrenadante de descarte. Mantenha talão pellet. <li> Para remover NaOH a partir de grânulos, grânulos lavar duas vezes, de cada vez por re-suspensão da pelota talão com 400 ul de tampão B (Tabela 3), seguido pela rotação do tubo durante 2 min à temperatura ambiente num rotador. sobrenadante de descarte. Mantenha talão pellet.
- Ressuspender pellet talão com 300 ul 2x W & B tampão, contas dividido em partes iguais e transferir para três tubos de 1,5 ml (100 contas ul por tubo). Fornecer os tubos contendo talão com 100 mL RNase água livre, 100 ul biotinilado FL RNA e 100 ul biotinilados AR 3'UTR RNA, respectivamente.
- Incubar cada mistura de pérolas durante 1 h à temperatura ambiente com rotação. Coloque tubos no ímã para 1 min. Descarte todo o sobrenadante. Manter peletes grânulo.
- Lavar as pérolas duas vezes, de cada vez por re-suspensão da pelota cada grânulo com 400 ul de 1x tampão de W & B, seguido por rotação tubos durante 5 minutos a temperatura ambiente num rotador.
- Coloque tubos no ímã para 1 min. Descarte todo o sobrenadante. Ressuspender cada pelle talãot com 50 ul de tampão de isolamento nuclear (Tabela 3).
3. pr�adip�ito Isolamento e Adipogênese Indução
- Conforme descrito em publicações anteriores 5, dissecar pré-adipócitos da almofada de gordura marrom interescapular (ratinhos de tipo selvagem C57BL6, 3 semanas de idade).
- Crescer e in vitro diferenciar os pré-adipócitos 5. As células estão prontas para aplicação a jusante 4-5 dias após o início da diferenciação.
4. Preparação de Lisado celular dos adipócitos primários
NOTA: Assegurar que todos os procedimentos de preparação de ligado celular são feitas em gelo, e todos os buffers são arrefecidas em gelo. homogeneizadores Dounce de vidro pré-frio no gelo.
- Crescer e diferenciar pré-adipócitos em 15 cm pratos 5 (ver secção 3.2). Cada prato fornece células adequadas para o ensaio de pull-down um RNA. No dia 4 ou dia 5 de diferenciação, meio de cultura de células de descarte, e ce lavarLLS uma vez com 1x PBS.
- Para colher as células, adicionar 10-15 ml de 1x PBS para as células, raspar para recolher as células num tubo de 50 ml, e as células por centrifugação a 200 xg durante 5 min à TA. Elimine o sobrenadante utilizando uma pipeta.
- Ressuspender o sedimento celular em 2 ml de tampão hipotónico (Tabela 3), e incuba-se as células em gelo durante 15 min. Transferência de células para um homogeneizador de vidro de 15 ml Dounce e células de cisalhamento mecanicamente em gelo com 20 golpes.
- Pellets núcleos celulares por centrifugação a 3300 xg durante 15 min a 4 ° C. Mantenha pellet núcleos de gelo para uso posterior (ver secção 4.6). Transferir o sobrenadante para tubos de 1,5 ml, adicionar KCl 3M de sobrenadante para se obter uma concentração final de 150 mM, e centrifugação a 20000 xg durante 15 min a 4 ° C.
- Após a centrifugação, remover cuidadosamente lipidlayeron topo usando uma pipeta, e recolher o sobrenadante como o lisado celular citoplasmática.
- Ressuspender pellet núcleos (ver secção 4.4) em 1 ml de tampão de isolamento nuclear. Tnúcleos ransferência para um homogeneizador de vidro Dounce de 15 ml usando uma pipeta, e os núcleos de cisalhamento mecanicamente em gelo com 100 pancadas. Sedimentar os detritos nucleares por centrifugação a 20000 xg durante 15 min a 4 ° C, e recolher o sobrenadante como o lisado celular nuclear.
- Ou combinar os lisados celulares nuclear e citoplasmática, ou utilizar separadamente cada fracção, para aplicação pendente a jusante. Nesta experiência de demonstração, estas duas fracções de lisado celular foram combinados a uma proporção em volume de 1: 1.
- Adicionar inibidor de RNase para esta ligado celular não fraccionada para se obter uma concentração final de 0,5 U / uL. Retiradas 100 ul de lisado celular como controle de entrada para western blot 15.
5. ligação e eluição de RBP
- lisado celular dividida em três aliquotas iguais (1 ml de lisado celular num tubo de 1,5 ml), e incuba-se com vazio, FL ARN-conjugado e os grânulos AR 3'UTR ARN-conjugados (ver secção 2.8), respectivamente, durante 3 horas a 4 ° Ccom rotação.
- Coloque tubos no ímã para 1 min. Recolher o sobrenadante utilizando uma pipeta de 1 ml, seguido de isolamento de RNA a partir do sobrenadante para confirmar ARN integralidade. Isolar ARN utilizando uma solução de tiocianato de guanidínio-fenol ácido, seguindo as instruções do fabricante (Tabela 2). Avaliar o ARN intacto através da análise de 28S e 18S subunidades de RNA ribossomal. Mantenha pelotas talão no gelo.
- Lavam-se as esferas magnéticas seis vezes, cada vez por ressuspensão cada pellet de talão com 1 ml de tampão de isolamento nuclear contendo 40 U de RNase inibidor e 0,25% de IGEPAL, seguido pela rotação tubos durante 2 minutos à temperatura ambiente num rotador. Usar um suporte magnético para a separação das esferas magnéticas e sobrenadante. Descarte todo o sobrenadante. Mantenha pelotas talão no gelo.
- Use etapas a seguir para eluir complexos de RNA-proteína de esferas para transferência de western. Em primeiro lugar, ressuspender cada pellet de grânulo em 75 ul de tampão de isolamento nuclear; em seguida, adicionar 25 ul 4x western blot carregamento buffer (contendo SDS) para obter um volume total de 100 ul. Finalmente, ferver grânulos em 100 ul desta solução a 95 ° C durante 5 min.
NOTA: Use os seguintes passos para eluir complexos de RNA-proteína de esferas para MS. Passo 1: ressuspender cada pellet de grânulo em 100 ul de tampão de eluição (Quadro 3); Passo 2: incubar as amostras de esferas durante 2-3 horas à temperatura ambiente com rotação; Passo 3: centrífuga e recolher o sobrenadante contendo proteína; Passo 4: concentrar soluções de proteína de 20-30 ul antes da apresentação para MS. - Centrifugue cada 100 ul de amostra de talão a 12000 xg durante 30 seg a 4 ° C, e recolher o sobrenadante. Alíquota de sobrenadante 15 ul para análise western blot (ver secção 6.1 e 6.2). Sondar a membrana resultante com o anticorpo monoclonal de rato Hur diluído (diluição 1: 1000), durante a noite.
6. Western Blotting para verificação da RBP
- RBPs separadas por SDS-PAGE usando técnicas padrão.
- realizar nósStern blotting usando técnicas convencionais através de sondagem para os RBPs associados com o ARN de interesse.
NOTA: Neste experimento demo, foi utilizado anticorpo monoclonal de Hur para a imunodetecção de proteína Hur. - Incubar a membrana com o anticorpo resultante Hur diluído (diluição 1: 1000) em 5% w / v de leite em pó desnatado, 1x TBS, 0,1% Tween - 20 a 4 ° C com agitação suave, durante a noite. Lavar as membranas três vezes com 1x TBST. Incubar membrana com o anticorpo secundário (anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho-HRP) à temperatura ambiente durante 1 h. membrana de lavagem. Desenvolver e registro sinal.
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Representative Results
Nesta experiência de demonstração, um fragmento de ARN de AR foi utilizado como isco para capturar a sua proteína de ligação Hur. Tanto uma isca FL ARN que não é relevante para a proteína Hur, e uma alíquota de esferas de estreptavidina em branco não conjugados serviram como controlos negativos. interacções ARN-proteína podem ocorrer quer no núcleo ou citoplasma, e este protocolo de pull-down pode ser aplicado a total ou fraccionado (nucleares ou citoplasmáticas) lisados celulares. Análise de proteínas por transferência de Western mostra que a amostra de 15 de lisado celular não fraccionada ul (ver secção 4.8), com a não-esfera de controlo de entrada, deu um resultado positivo, indicando que a proteína Hur é detectada no lisado de adipócitos de cultura primário do rato através da utilização o anticorpo monoclonal. A fracção de eluição de ARN de AR deu um resultado positivo, indicando que a proteína Hur é detectada no lisado de adipócitos usando os grânulos AR ARN-conjugados para o ensaio suspenso ARN. Tanto a fracção de ARN e a eluição FL bamostra escorridos grânulo deram resultados negativos, indicando que as interacções não específicas entre um fragmento de ARN e proteína FL Hur, bem como entre os grânulos em branco e proteína Hur não são detectáveis por esta abordagem suspenso ARN. Os resultados destes dois controlos negativos também indicam que uma interacção específica entre o fragmento de ARN e proteína AR Hur for detectado com sucesso pelo protocolo suspenso ARN aqui descrita.
Figura 1: Western Blot Verificação de Hur Capturado pelos RNA suspenso Ensaios de entrada: reconstituído ligado celular (citoplasmática + lisado nuclear);. Grânulos: a amostra em branco de esferas magnéticas revestidas com estreptavidina; FL RNA: esferas de estreptavidina ligadas com o mRNA FL; AR RNA 3'UTR: esferas de estreptavidina ligadas com a 3'UTR do mRNA AR; anticorpo primário: anticorpo monoclonal de Hur; Anticorpo secundário: de cabra anti-mouse IgG-HRP; Abreviatura, FL: luciferase de vaga-lume, AR: receptor de andrógeno; Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| centrifugador |
| termociclador |
| espectrofotômetro |
| rotor |
| electroforese em gel de proteína e aparelhos blotting |
| Magnético |
Tabela 1: Principais Equipamentos utilizados neste estudo Os principais equipamentos utilizados neste estudo..
| No kit de transcrição in vitro |
| RNA biotinilado |
| Girar coluna para a recuperação de fragmentos de DNA e RNA |
| esférulas magnéticas com estreptavidina |
| anticorpo monoclonal Hur rato |
| De cabra anti-IgG de ratinho-HRP |
| livre de nuclease água grau biologia molecular |
| solução salina de tampão fosfato |
| RNase inibidor |
| inibidor da protease |
| Pfu ADN polimerase |
| solução de tiocianato de guanidina-fenol ácido |
Tabela 2: Principais reagentes utilizados neste estudo reagentes principais usados neste estudo..
| Tampão estrutura 2x RNA |
| Tris-HCl 20 (pH 7,4) |
| 0,2 M de KCl | MgCl 2 20 mM |
| 2 mM de DTT |
| 0,8 U / ul de inibidor de RNase |
| tampão A |
| NaOH a 0,1 M |
| NaCl 0,05 M |
| tampão B |
| NaCl 0,1 M |
| 1x W & B (ligação e de lavagem) tampão |
| Tris-HCl a 5 (pH 7,4) |
| 1 M NaCl |
| Tampão 1x Hypotonic |
| mM de Tris-HCl a 10 (pH 7,4) |
| KCl 10 mM |
| 2 mM de MgCl2 |
| 1 mM de DTT |
| 1 mM de PMSF |
| inibidor da protease 1x |
| 1x tampão de isolamento nuclear |
| Tris-HCl 25 (pH 7,4) |
| 150 mM de KCl |
| 2 mM de MgCl2 |
| 1 mM de DTT |
| 0,5% de IGEPAL (ou 0,25% IGEPAL para eluição de RBPs) |
| 1 mM de PMSF |
| inibidor da protease 1x |
| 0,4 U / ul de inibidor de RNase (ou 40 U / ml de RNase inibidor para a eluição de RBPs) |
| 1x tampão de eluição |
| biotina 2 mM em PBS 1x |
. Tabela 3: Principais Soluções utilizadas neste estudo tampão estrutura RNA 2x (ver secção 1.7); Tampão A (secção ver 2.3); Tampão B (ver secção 2.4); 1x W & B (ligação e de lavagem) tampão (ver pontos 2.2, 2.5, 2.7); 1x tampão hipotônico (ver secção 4.3); tampão de isolamento 1x Nuclear (ver secções 2.8, 4.6, 5.3, 5.4); 1x Tampão de eluição (ver nota seguinte seção 5.4).
lways ">Tabela 4: Sequências de molde e os iniciadores para PCR Amplification T7-AR-oligo:. Molde de ADN para amplificação por PCR (ver secção 10,1); T7-AR-F: iniciador directo para a amplificação PCR (ver secção 1.1); T7-AR-R: iniciador inverso para a amplificação PCR (ver secção 1.1); hluc (+) - T7-probe-F: iniciador directo para a amplificação PCR (ver secção 1.2); hluc (+) - Sonda-R: iniciador inverso para a amplificação PCR (ver secção 1.2).
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Discussion
lncRNAs RBPs e desempenham um papel vital na saúde e na doença, no entanto, os mecanismos moleculares destas moléculas são mal compreendidos. Identificação de proteínas que interagem com moléculas lncRNA é um passo fundamental para elucidar os mecanismos de regulação. Enriquecimento de RBPs por o sistema de ensaio suspenso ARN baseia-se na captura em solução de complexo interagir de modo que as proteínas a partir de um lisado celular pode ser selectivamente extraído usando iscas de ARN biotinilados ligados a contas magnéticas de estreptavidina. Vários outros métodos, como CHIRP, gráfico e RAP pode atingir o mesmo objetivo, no entanto estes métodos exige mais esforço de configurar do que o RNA suspenso técnica 16,17,18.
A força principal de ARN suspenso é que ela é relativamente um protocolo simples e fácil de executar. Ambos CHIRP e RAP envolvem um passo de reticulação que preserva ocorrem naturalmente complexos de RNA-proteína e a concepção de um conjunto completo de oligonucleotídeos antisense (90 Nucleotides longo no RAP e 20 nucleotídeos em CHIRP) ladrilhos todo o RNA alvo 16,17,18. ARN de dobragem é um passo crítico para os ensaios de pull-down ARN. A principal limitação deste protocolo é que os RNAs-alvo são sintetizados in vitro e não podem ser correctamente dobrada em estrutura nativa para permitir a correcta ligação com o seu RBP (s). RNAs não-nativo deformadas podem ou não formam interacções proteína-ARN e invalida os ensaios funcionais, ou interacções de forma que só ocorrem in vitro sob condições não fisiológicas. Embora o protocolo pull-down descrito aqui adotado um procedimento bem reconhecida por RNA dobrar 13,14 (ver secção 1.7), ele não garante a dobradura apropriada para outros transcritos de RNA.
RNA pull-down é muitas vezes associada a RIP como uma abordagem complementar para detectar o RNA (s) vinculado pela RBP de interesse 19. Um outro passo crucial no presente protocolo é a remoção da fracção de lípido total de células a partir delisado (ver secção 4.5) porque a abundância alta lipídico em adipócitos maduros apresenta um grande desafio técnico. O protocolo aqui descrito é particularmente desenvolvida para utilização com adipócitos. No entanto, os componentes básicos deste protocolo e o rigor de todos os buffers usados pode ser alterado e adaptado para aplicação a outros modelos de cultura celular. Para tecidos que têm altos níveis de RNase endógena, diferentes ARN protocolos pull-down pode ser aplicada.
ARN suspenso, que utiliza ARN de interesse para identificar os RBPs associados, é uma técnica eficaz e eficiente para sondar as funções e mecanismos fundamentais de lncRNAs, que têm uma ampla gama de funções em células humanas. desenvolvimento futuro da captura à base de RNA, incluindo RNA pull-down, que serão necessários para enfrentar os desafios com que define a componentes, montagem e função de complexos de RNA-proteína, bem como gerar RBPs suficientes de complexos de RNA em proteínas abundantes baixos para MS.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por Singapura NRF comunhão (NRF-2011NRF-NRFF001-025), bem como CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Major materials used in this study. | |||
| MEGAscript kit | Ambion | ||
| Biotin-14-CTP | Invitrogen | ||
| NucAway spin columns | Ambion | ||
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | ||
| HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261) | Santa Cruz Biotechnology | ||
| Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005) | Santa Cruz Biotechnology | ||
| Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free) | HyClone | ||
| Phosphate Buffer Saline (1×PBS) | HyClone | ||
| RNase inhibitor | Bioline | ||
| Protease inhibitor | Sigma | ||
| Pfu Turbo DNA polymerase | Agilent Technologies | ||
| TRIsure | Bioline | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Major equipment used in this study. | |||
| Sorvall Legend Micro 21R centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Sorvall Legend X1R centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Bio-Rad T100 thermal cycler | Bio-Rad | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| BOECO rotator Multi Bio RS-24 | BOECO,Germany | ||
| Protein gel electrophoresis and blotting apparatus | Bio-Rad | ||
| DynaMag-2 magnet | Life Technologies |
References
- Huot, M. É, et al. The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis. Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).
- Sun, L., et al. Long noncoding RNAs regulate adipogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3387-3392 (2013).
- Engreitz, J. M., et al. The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X-chromosome. Science. 341 (6147), 1237973 (2013).
- Zhao, X. Y., Li, S., Wang, G. X., Yu, Q., Lin, J. D. A long noncoding RNA transcriptional regulatory circuit drives thermogenic adipocyte differentiation. Mol Cell. 55, 372-382 (2014).
- Alvarez-Dominguez, J. R., et al. De novo reconstruction of adipose tissue transcriptomes reveals long non-coding RNA regulators of brown adipocyte development. Cell Metab. 21, 764-776 (2015).
- Adams, D. J., Beveridge, D. J., van der Weyden, L., Mangs, H., Leedman, P. J., Morris, B. J. HADHB, HuR, and CP1 bind to the distal 3-untranslated region of human renin mRNA and differentially modulate renin expression. J Biol Chem. 278 (45), 44894-44903 (2003).
- Yeap, B. B., et al. Novel binding of HuR and poly(C)-binding protein to a conserved UC-rich motif within the 3´ untranslated region of the androgen receptor messenger RNA. J Biol Chem. 277, 27183-27192 (2002).
- König, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives. Nat Rev Genet. 13, 77-83 (2012).
- Ferrè, F., Colantoni, A., Helmer-Citterich, M.
- McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15 (1), 203 (2014).
- Lee, Y. S., et al. AU-rich element-binding protein negatively regulates CCAAT enhancer binding protein mRNA stability during long term synaptic plasticity in Aplysia. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15520-15525 (2012).
- Hermann, M., Cermak, T., Voytas, D. F., Pelczar, P. Mouse genome engineering using designer nucleases. J Vis Exp. (86), (2014).
- Tsai, M. C., et al. Long Noncoding RNA as Modular Scaffold of Histone Modification Complexes. Science. 329 (5992), 689-693 (2010).
- Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505, 706-709 (2014).
- Li, H., et al. Identification of mRNA binding proteins that regulate the stability of LDL receptor mRNA through AU rich elements. J Lipid Res. 50 (5), 820-831 (2009).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
- Chu, C., et al. Systematic Discovery of Xist RNA Binding Proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs. Nat Struct Mol Biol. 22 (1), 29-35 (2015).
- Zhao, J., et al. Genome-wide identification of Polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).
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Biologia Molecular Edição 113 RNA pull-down de ligação a RNA proteínas adipócitos não codificante que codificaErratum
Formal Correction: Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture
Posted by JoVE Editors on 08/20/2016.
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Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
*These authors contributed equally
to:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
3Division of Bioengineering, School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
*These authors contributed equally
