Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Detectie van RNA-bindende eiwitten door Published: July 22, 2016 doi: 10.3791/54207
Automatic Translation
*1, *1, 3, 1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School, 2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore, 3Division of Bioengineering, School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Een RNA-pull-down protocol is hier geoptimaliseerd voor detectie van interacties tussen RNA-bindende eiwitten (RBPs) en niet-coderende en coderende RNAs. Een RNA fragment uit androgeenreceptor (AR) werd gebruikt als een voorbeeld om te demonstreren hoe de RBP halen uit lystate primaire bruine adipocyten.

Abstract

RNA-bindende eiwitten (RBPs) ontstaan ​​als een regulerende laag in de ontwikkeling en functie van vet. RBPs spelen een sleutelrol in de regulatie van genexpressie op post-transcriptionele niveau door dat de stabiliteit en translationele efficiëntie van doelwit mRNA. RNA pull-down techniek wordt veel gebruikt om RNA-eiwit interactie die nodig is om het onderliggende mechanisme helderen (lncRNAs) functie RBPs "als lange niet-coderende RNA's te bestuderen. De hoge lipide overvloed in adipocyten vormt een technisch probleem bij het uitvoeren van dit experiment. Hier een gedetailleerd RNA pull-down protocol is geoptimaliseerd voor primaire adipocyten cultuur. Een RNA-fragment uit (AR) 3 'onvertaalde regio androgene receptor (3'UTR) die een adenylaat-uridylate-rijk elementwas als voorbeeld gebruikt om te demonstreren hoe de RBP partner, Hur eiwit op te halen, uit adipocyten lystate. De hier beschreven methode kan worden toegepast op de interacties tussen detecterenRBPs en niet-coderende RNA's, alsook tussen RBPs en codering RNA's.

Introduction

RBPs zijn eiwitten die binden aan een dubbele of enkelstrengs RNA in cellen en participeren in het RNA-eiwitcomplexen. RBPs kunnen verschillende RNA soorten, waaronder mRNA en lange niet-coderende RNA's (lncRNAs) binden en hun invloed op post-transcriptioneel niveau uitoefenen. Zowel RBPs en lncRNAs zijn in opkomst als nieuwe regulatoren in het vet- ontwikkeling en functioneren 1,2,3. Het mechanisme van RBP- en lncRNA gemedieerde regulering van cellulaire routes begrijpen, is het vaak nodig om de interactie tussen een specifiek RNA-molecuul en één of meer RBPs detecteren, en soms het volledige spectrum van eiwit partners van een RNA identificeren vertaling. Echter, het experiment uitdaging vanwege het hoge gehalte aan lipiden in adipocyten. Het RNA pull-down protocol beschreven kunnen worden toegepast om het eiwit partners van een specifiek RNA van de adipocyten lysaten van primaire kweken 4,5 halen.

Reden voor deze protocol wordt als volgt samengevat. Een RNA aas in vitro getranscribeerd vanaf een DNA-matrijs, met biotine gemerkt en geconjugeerd aan met streptavidine beklede magnetische korrels 4. Het RNA aas wordt geïncubeerd met cellysaten, teneinde de vorming van RNA-eiwitcomplexen, die vervolgens neer op een magnetische standaard worden getrokken. Meer specifiek hieronder beschreven het RNA pull-down-protocol een RNA-fragment uit AR 3'UTR als aas om Hur eiwit, een universeel uitgedrukt RBP gebonden aan 3'UTR van mRNA 6,7, van theadipocytelysate van primaire kweek te halen. Om de bindingsspecificiteit van deze assay wordt een niet-relevante RNAas en leeg streptavidineparels opgenomen als controle. Dit protocol is compatibel met western blotting of massaspectrometrie (MS) om de vangst van een specifieke RBP te bevestigen of het volledige repertoire van gevangen RBPs respectievelijk 8 identificeren.

Verschillende technieken beschikbaar voor RNA-eiwit interactie te bestuderens. Om RNAs gebonden door een bepaalde RBP, RIP (RNA immunoprecipitatie) en CLIP (UV crosslinking en immuunprecipitatie) zichtbaar kan worden toegepast. Daarentegen eiwit partners van een bepaald RNA identificeren RNA pull-down, Chirp (chromatine isolatie van RNA zuivering), GRAFIEK (capture hybridisatie-analyse van RNA targets) en RAP (antisense RNA zuivering) kunnen worden toegepast. In vergelijking met de latere, RNA pull-down methode vergt minder inspanning te zetten. Het kan worden toegepast om eiwitten te vangen in vitro en in vivo. De in vivo benadering van RNA pull-down, dat is technisch gezien een grotere uitdaging dan de in vitro tegenhanger, behoudt RNA-eiwit interacties door het verknopen in cellen, vangt-aptameer gelabeld RNA's van de belangstelling van de cellen, en vervolgens gebonden RBPs detecteert. RNA vervolgmenu kan worden gebruikt om lage overvloedige RBPs verrijken en isoleren en identificeren van de RNA-eiwitcomplexen die verschillende functionele rollen hebben bij het ​​regelen cellulaire regulatie 9,10

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Opmerking: Het RNA van belang in het kader van dit onderzoek is een fragment van AR 3'UTR.

1. Bereiding van biotine-gelabelde RNA

  1. Aan het RNA te verkrijgen, amplificeren T7-AR-oligo met PCR, gevolgd door in vitro transcriptie met behulp van een commerciële kit en volgens instructies van de fabrikant 11.
    OPMERKING: Primers voor PCR zijn opgesomd in Tabel 4: T7-AR-F en T7-AR-R.
  2. Voor niet-specifieke binding control, amplificeren van een gedeeltelijke sequentie van de vuurvlieg luciferase (FL) DNA met PCR uit psiCHECK-2 plasmide, gevolgd door in vitro transcriptie.
    OPMERKING: Primers voor PCR zijn opgesomd in Tabel 4: hluc (+) - T7-probe-F en hluc (+) - R-probe Tabel 4 Sequenties van matrijs en primers voor PCR-amplificatie...
  3. Voor een 50 ul PCR reactie, meng 50 ng DNA (oligo of plasmide), 4 pl dNTPs (2,5 mM van elk dNTP), 5 ui 10x reactiebuffer, 1 ui 2,5 U / & #181; l DNA polymerase, 2 pi 10 pM forward primer, 2 pl 10 uM reverse primer, en nuclease-vrij water.
    1. Run PCR-amplificatie in een thermocycler met de volgende programma. Stap 1: één cyclus van 95 ° C gedurende 2 min; Stap 2: 35 cycli van 95 ° C gedurende 30 sec, 55 ° C gedurende 30 sec en 72 ° C gedurende 30 sec (AR) of 60 seconden (FL); Stap 3: één cyclus van 72 ° C gedurende 10 minuten.
  4. Synthetiseren gebiotinyleerd RNA een in vitro transcriptie kit volgens de instructies van de fabrikant 11. In dit experiment gebruikt PCR-producten als matrijzen voor RNA synthese. Voor een 20 pl in vitro transcriptiereactie, meng 200 ng PCR geamplificeerd DNA, 2 pi van elk NTP, 1 gl 10 mM biotine-CTP, 2 ui 10x reactiebuffer en 2 pi T7 RNA polymerase. Incubeer het mengsel bij 37 ° C gedurende 4 uur.
  5. Na in vitro transcriptie, behandel reactiemengsel met 1 pi 2 U / ul DNase op 37 & #176; C gedurende 15 minuten om matrijs-DNA af te breken. Tenslotte verdunnen de gebiotinyleerde RNA tot een totaal volume van 60 pi voor daaropvolgende zuivering.
  6. Zuiver gebiotinyleerd RNA's zouten en opgenomen nucleotiden verwijderen met zuiveringskolommen volgens de instructies van de fabrikant 12. Meet RNA-concentratie en bewaar bij -80 ° C voor daaropvolgende pull-down tests.
  7. Voor een goede secundaire structuur van RNA plaats in RNA-eiwit interactie, warmte 50 pl gebiotinyleerd RNA (50 pM) waarborgen bij 90 ° C gedurende 2 min, chill op ijs gedurende 2 minuten, daarna voorzien van 50 ul 2x RNA structuur buffer (Tabel 3), en laat de RNA vouwen bij kamertemperatuur gedurende 30 min 13,14.

2. Bereiding van RNA-geconjugeerde kralen

OPMERKING: Gebruik een magnetische standaard voor het scheiden van de magnetische kralen en supernatant.

  1. Resuspendeer de met streptavidine beklede magnetische korrels in de originele flacon door kortstondig VorteXing volgende instructies van de fabrikant. Transfer 150 ul geresuspendeerd kralen een 1,5 ml buis. Plaats de buis op de magneet voor 1 min. Teruggooi supernatant. Houd kraal pellet.
    LET OP: In RNA pull-down assays, wanneer aliquoting geresuspendeerd kralen uit originele flacon, gebruik 50 ul kralen voor een test, gevolgd door western blotting, en 200 ul kralen voor een test, gevolgd door MS.
  2. Was parels eenmaal door opnieuw suspenderen bead pellet met 1 ml van de fabrikant aanbevolen 1x W & B (binding en wassen) buffer (tabel 3), gevolgd door het roteren van de buis gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in een rotator. Teruggooi supernatant. Houd kraal pellet.
  3. RNase inactivering op kralen, kralen wassen tweemaal telkens met resuspenderen kraal pellet met 400 ui buffer A. Buffer A een alkalische oplossing die 0,1 M NaOH en 0,05 M NaCl (tabel 3). Draai de buis gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur in een rotator. Teruggooi supernatant. Houd kraal pellet.
    4. <li> NaOH verwijderen van kralen, parels wassen tweemaal telkens met resuspenderen kraal pellet met 400 ul buffer B (tabel 3), gevolgd door het roteren van de buis gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur in een rotator. Teruggooi supernatant. Houd kraal pellet.
  4. Resuspendeer kraal pellet met 300 pi 2x W & B buffer, split kralen even en de overdracht in drie 1,5 ml buizen (100 pi korrels per buisje). Leveren de kraal-bevattende buizen met 100 ul RNase vrij water, 100 ul gebiotinyleerd FL RNA en 100 ul gebiotinyleerde AR 3'UTR RNA, respectievelijk.
  5. Incubeer elke kraal mengsel gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met rotatie. Plaats buisjes op magneet gedurende 1 min. Gooi alle supernatant. Houd kraal pellets.
  6. Wassen kralen tweemaal telkens met resuspenderen elke kraal pellet met 400 pl 1x W & B buffer, gevolgd door het roteren buizen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in een rotator.
  7. Plaats buisjes op magneet gedurende 1 min. Gooi alle supernatant. Resuspendeer elke kraal pellet met 50 gl nucleaire isolatie buffer (tabel 3).

3. preadipocyt Isolatie en Adipogenese Inductie

  1. Zoals beschreven in eerdere publicaties 5, ontleden preadipocyten uit de interscapular bruin vet pad (C57BL6 wild type muizen, 3 weken oud).
  2. Groeien en in vitro differentiëren preadipocyten 5. De cellen zijn klaar voor downstream toepassing 4-5 dagen na aanvang van differentiatie.

4. Voorbereiding van Cellular Lysate van Primary adipocyten

LET OP: Zorg ervoor dat alle procedures van cellysaat bereiding worden gemaakt op het ijs, en alle buffers worden gekoeld op ijs. Pre-chill dounce glas homogenisatoren op ijs.

  1. Groeien en te differentiëren preadipocyten in 15 cm schalen 5 (zie paragraaf 3.2). Elk gerecht biedt voldoende cellen voor een RNA-pull-down test. Op dag 4 of 5 dagen van differentiatie, teruggooi celkweekmedium, en was ceLLS een keer met 1x PBS.
  2. Cellen oogsten, voeg 10-15 ml 1x PBS om cellen te schrapen cellen in een 50 ml buis en pellet cellen te verzamelen door centrifugatie bij 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gooi supernatant met 1 ml pipet.
  3. Hersuspenderen celpellet in 2 ml hypotone buffer (tabel 3) en incubeer cellen op ijs gedurende 15 min. Overdracht cellen om een ​​15 ml Dounce homogenisator glas en afschuiving cellen mechanisch op ijs met 20 slagen.
  4. Pellet celkernen door centrifugatie bij 3300 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. Houd kernen pellet op ijs voor verder gebruik (zie rubriek 4.6). Transfer supernatant 1,5 ml buizen, voeg 3M KCl aan supernatant tot een eindconcentratie van 150 mM en rotatie verkrijgen bij 20.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
  5. Na het centrifugeren, verwijder voorzichtig lipidlayeron de top met behulp van 1 ml pipet, en het verzamelen van bovenstaande vloeistof als de cytoplasmatische cellulaire lysaat.
  6. Resuspendeer kernen pellet (zie paragraaf 4.4) in 1 ml nucleaire isolatie buffer. Transfer kernen een 15 ml dounce glashomogenisator gebruik 1 ml pipet, en afschuiving kernen mechanisch op ijs met 100 slagen. Pellet nucleaire afval door centrifugatie bij 20.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C en verzamel de supernatant nucleaire cellulaire lysaat.
  7. Ofwel combineren de nucleaire en cytoplasmatische cellysaten, of gebruik maken van elke fractie afzonderlijk, voor downstream pull-down toepassing. In deze demonstratie experiment werden deze twee fracties van cellysaat gecombineerd in een volumeverhouding van 1: 1.
  8. Voeg RNase inhibitor deze gefractioneerde cellysaat tot een eindconcentratie van 0,5 U / pl te verkrijgen. Zet opzij 100 pl cellysaat als input control voor western blotting 15.

5. Binding en Elutie van RBP

  1. Cellysaat splitsen in drie gelijke porties (1 ml cellysaat in een 1,5 ml buis) en incubeer met blanco, FL RNA-geconjugeerde en AR 3'UTR RNA-geconjugeerde kralen (zie paragraaf 2.8), respectievelijk, gedurende 3 uur bij 4 ° Cmet rotatie.
  2. Plaats buisjes op magneet gedurende 1 min. Verzamel supernatant met een pipet 1 ml, gevolgd door RNA isolatie van RNA supernatant volledigheid bevestigen. Isoleer RNA met behulp van een zuur guanidinium thiocyanaat-fenol-oplossing volgens de instructies van de fabrikant (Tabel 2). Beoordeel de RNA intact door het analyseren van 28S en 18S subeenheden van ribosomaal RNA. Houd kraal pellets op het ijs.
  3. Was de magnetische korrels zes keer, telkens met resuspenderen elke kraal pellet met 1 ml nucleaire isolatie buffer bevattende 40 U RNase-remmer en 0,25% IGEPAL, gevolgd door roterende buizen gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur in een rotator. Gebruik een magnetische standaard voor het scheiden van de magnetische kralen en supernatant. Gooi alle supernatant. Houd kraal pellets op het ijs.
  4. Gebruik de volgende stappen om RNA-eiwitcomplexen elueren uit kralen voor western blotting. Eerst, resuspendeer elke korrel pellet in 75 ul nucleaire isolatiebuffer; dan, voeg 25 ul 4x western blot laden buffer (met SDS) tot een totaal volume van 100 ul te verkrijgen. Tenslotte kook kralen in deze 100 ul oplossing bij 95 ° C gedurende 5 minuten.
    LET OP: Gebruik volgende stappen om RNA-eiwitcomplexen elueren uit kralen voor MS. Stap 1: resuspendeer elke korrel pellet in 100 ui elutiebuffer (tabel 3); Stap 2: incubeer bead monsters gedurende 2-3 uur bij kamertemperatuur met rotatie; Stap 3: centrifuge en het verzamelen van eiwithoudende supernatant; Stap 4: concentreer eiwit oplossingen voor 20-30 ul vóór inzending voor MS.
  5. Centrifugeer elk 100 pl kralen monster bij 12.000 xg gedurende 30 seconden bij 4 ° C en verzamel supernatant. Aliquot 15 ul supernatant voor western blot analyse (zie paragraaf 6.1 en 6.2). Probe het resulterende membraan met de verdunde Hur muis monoklonaal antilichaam (1: 1000 verdunning), 's nachts.

6. Western Blotting voor Verificatie van RBP

  1. RBPs gescheiden door SDS-PAGE onder toepassing van standaardtechnieken.
  2. voeren wijstern blotten met behulp van standaard technieken door peilen naar de RBPs verband met het RNA van belang.
    LET OP: In deze demo experiment, was Hur muizen monoklonaal antilichaam dat wordt gebruikt voor de immunodetectie van Hur eiwit.
  3. Incubeer de verkregen membraan met verdunde Hur antilichaam (1: 1000 verdunning) in 5% w / v niet-vette droge melk, 1 x TBS, 0,1% Tween - 20 4 ° C onder zacht schudden, 's nachts. Was membraan driemaal met TBST 1x. Incubeer het membraan met het secundaire antilichaam (geit anti-muis IgG-HRP) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Wassen membraan. Ontwikkelen en op te nemen signaal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In deze demo experiment werd een AR-RNA-fragment gebruikt als aas om zijn bindende eiwit hur vast te leggen. Zowel een aas FL RNA dat niet-relevant Hur eiwit en een hoeveelheid ongeconjugeerde lege streptavidineparels dienden als negatieve controles. RNA-eiwit interacties kunnen zich voordoen in kern en cytoplasma en deze pull-down protocol kan worden toegepast op hetzij geheel of gefractioneerd (kern- of cytoplasmische) cellysaten. Van eiwitten door Western blotting toont aan dat het monster van 15 gl ongefractioneerde cellysaat (zie paragraaf 4.8), omdat er geen kraal inputcontrole gaf een positief resultaat aangeeft dat Hur eiwit in de adipocyten lysaat van muizen primaire kweek wordt gedetecteerd door het monoklonale antilichaam. De AR RNA elutie fractie gaf een positief resultaat aangeeft dat Hur eiwit in de adipocyten lysaat gedetecteerd door het AR RNA-geconjugeerde kralen voor het RNA pulldown assay. Zowel de FL RNA elutie fractie en het blank kraal monster gaf negatieve resultaten, wat aangeeft dat niet-specifieke interacties tussen FL RNA-fragment en Hur eiwit, evenals tussen de lege kralen en Hur eiwit niet aantoonbaar door dit RNA pull-down benadering. De resultaten van deze twee negatieve controles blijkt dat een specifieke interactie tussen de AR RNA fragment en Hur eiwit succesvol wordt gedetecteerd door het RNA pulldown protocol beschreven.

Figuur 1
Figuur 1: Western Blot Verificatie van Hur de ban van de RNA Pull-down Testen Input: opgelost cellysaat (cytoplasma + nucleaire lysaat). Kralen: het monster uit blank-streptavidine beklede magnetische korrels; FL RNA: streptavidine kralen verbonden met de FL mRNA; AR 3'UTR RNA: streptavidine beads gebonden met de AR 3'UTR mRNA; Primair antilichaam: hur muis monoklonaal antilichaam; Secundair antilichaam: geit anti-mouse IgG-HRP; Afkorting, FL: vuurvliegluciferase, AR: androgene receptor; Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

centrifuge
Thermal cycler
spectrofotometer
Rotator
Eiwit gelelektroforese en blotapparaat
Magneet

Tabel 1: Major Equipment gebruikt in deze studie Major apparatuur die wordt gebruikt in deze studie..

In vitro transcriptie kit
gebiotinyleerde RNA
Spin kolom voor het herstel van DNA en RNA-fragmenten
Streptavidine magnetische korrels
Hur muis monoklonaal antilichaam
Geit anti-muis IgG-HRP
Nuclease-free moleculaire biologie kwaliteit water
Fosfaatbuffersaline
RNase-remmer
proteaseremmer
Pfu DNA polymerase
Zuur guanidinium thiocyanaat-fenol oplossing

Tabel 2: Major Reagentia die in deze studie Major reagentia gebruikt in deze studie..

<tr>
2x RNA structuur buffer
20 mM Tris-HCl (pH 7,4)
0,2 M KCl
20 mM MgCl2
2 mM DTT
0,8 U / pl RNase remmer
buffer A
0,1 M NaOH
0,05 M NaCI
buffer B
0,1 M NaCl
1x W & B (Binding en Wassen) buffer
5 mM Tris-HCl (pH 7,4)
1 M NaCl
1x Hypotone buffer
10 mM Tris-HCl (pH 7,4)
10 mM KCl
2 mM MgCl2
1 mM DTT
1 mM PMSF
1x proteaseremmer
1x Nuclear isolatie buffer
25 mM Tris-HCl (pH 7,4)
150 mM KCl
2 mM MgCl2
1 mM DTT
0,5% IGEPAL (of 0,25% IGEPAL voor elutie van RBPs)
1 mM PMSF
1x proteaseremmer
0,4 U / pl RNase remmer (of 40 U / ml RNase inhibitor elutie van RBPs)
1x elutiebuffer
2 mM biotine in 1x PBS

. Tabel 3: Major Solutions gebruikt in deze studie 2x RNA structuur buffer (zie paragraaf 1.7); Buffer A (zie paragraaf 2.3); Buffer B (zie paragraaf 2.4); 1x W & B (Binding en Wassen) buffer (zie punten 2.2, 2.5, 2.7); 1x Hypotone buffer (zie paragraaf 4.3); 1x Nuclear isolatie buffer (zie rubrieken 2.8, 4.6, 5.3, 5.4); 1x elutiebuffer (zie NB volgende paragraaf 5.4).

lways "> Template en primers Opeenvolgingen T7-AR-oligo 5'-TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GCT GGG CTT TTT TTT TCT TCT CTT CTC CTT TCT TTT TCT TCT TCC CTC CCT AGC TTA TGA CCG TGG CAG TCT -3 ' T7-AR-F 5'-CTA ATA CGA CTC ACT ATA G -3 ' T7-AR-R 5'-AGA CTG CCA CGG TCA TAA GC -3 ' hluc (+) - T7-probe-F 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGCCCCTGCTAACGACATTTACAACGAG-3 ' hluc (+) - R-probe 5'-CATAATCATAGGGCCGCGCACACAC-3 '

Tabel 4: Sequences van Template en primers voor PCR-amplificatie T7-AR-oligo. DNA-template voor PCR-amplificatie (zie hoofdstuk 10,1); T7-AR-F: voorwaartse primer voor PCR-amplificatie (zie paragraaf 1.1); T7-AR-R: omgekeerde primer voor PCR-amplificatie (zie paragraaf 1.1); hluc (+) - T7-probe-F: voorwaartse primer voor PCR-amplificatie (zie paragraaf 1.2); hluc (+) - probe-R: reverse primer voor PCR-amplificatie (zie paragraaf 1.2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

lncRNAs RBPs en hebben vitale rol in gezondheid en ziekte, maar de moleculaire mechanismen van deze moleculen worden slecht begrepen. Identificatie van eiwitten die interageren met lncRNA moleculen een belangrijke stap naar het ophelderen van de regulatiemechanismen. Verrijking van RBPs door RNA pull-down assay is gebaseerd op in-oplossing vangst van samenwerkend complex waardoor eiwitten uit een cellysaat selectief worden geëxtraheerd met behulp van gebiotinyleerd RNA aas gebonden aan streptavidine magnetische korrels. Verschillende andere methoden, zoals Chirp, CHART en RAP kunnen hetzelfde doel te bereiken, maar deze methoden kost meer moeite op te zetten dan het RNA pull-down techniek 16,17,18.

De grote kracht van RNA pulldown is dat het relatief eenvoudig protocol en gemakkelijk uit te voeren. Zowel CHIRP en RAP leiden tot een verknoping stap die van nature behoudt voorkomende RNA-eiwitcomplexen en het ontwerp van een volledige set van antisense oligonucleotiden (90 nucleofiele exocyclische aminefunctiesotides lang in RAP en 20 nucleotiden lang in Chirp) betegelen van het hele doel-RNA 16,17,18. RNA vouwen is een kritische stap in het RNA pull-down tests. De belangrijkste beperking van dit protocol is dat het doelwit RNA's worden gesynthetiseerd in vitro en kunnen niet goed worden gevouwen in natieve structuur om een goede laten binding met haar RBP (s). Misfolded non-native RNA's kunnen ofwel niet aan RNA-eiwit interacties te vormen en ongeldig functionele assays, of vorm interacties die zich alleen voordoen in vitro onder fysiologische omstandigheden. Hoewel de pull-down protocol hier beschreven, een goed erkende procedure voor RNA vouwen 13,14 (zie paragraaf 1.7), is het niet de juiste vouwing van andere RNA-transcripten te garanderen.

RNA pull-down gaat vaak gepaard met TNO als een complementaire aanpak van het RNA (s) gebonden door de RBP van belang 19 te detecteren. Een andere belangrijke stap in dit protocol is de verwijdering van lipide fractie uit totaal cellysaat (zie paragraaf 4.5) omdat de hoge lipide overvloed in mature adipocyten vormt een grote technische uitdaging. De hier beschreven protocol is vooral ontwikkeld voor adipocyten. Echter, de basiscomponenten van het protocol en de stringentie van alle gebruikte buffers worden gewijzigd en aangepast voor toepassing op andere celkweekmodellen. Voor weefsels die hoge niveaus van endogene RNase hebben, kunnen verschillende RNA pull-down protocollen worden toegepast.

RNA pull-down, die RNAs plaats gebruikt voor de geassocieerde RBPs identificeren, is een effectieve techniek om de cruciale functies en mechanismen van lncRNAs, waarvan een groot aantal rollen in menselijke cellen te onderzoeken. Toekomstige ontwikkeling van RNA gebaseerde vastlegging, waaronder RNA pull-down, nodig zijn om problemen met het definiëren van de onderdelen, assemblage en functie van RNA-eiwitcomplexen, en genereert voldoende RBPs lage overvloedige RNA-eiwitcomplexen MS pakken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Dit werk werd gefinancierd door Singapore NRF Fellowship (NRF-2011NRF-NRFF001-025) als CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Major materials used in this study.
MEGAscript kit  Ambion
Biotin-14-CTP  Invitrogen
NucAway spin columns  Ambion
Dynabeads M-280 Streptavidin  Invitrogen
HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261)  Santa Cruz Biotechnology
Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005)  Santa Cruz Biotechnology
Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free)  HyClone
Phosphate Buffer Saline (1×PBS)  HyClone
RNase inhibitor  Bioline
Protease inhibitor  Sigma
Pfu Turbo DNA polymerase  Agilent Technologies
TRIsure  Bioline
Name Company Catalog Number Comments
Major equipment used in this study.
Sorvall Legend Micro 21R centrifuge  Thermo Scientific
Sorvall Legend X1R centrifuge  Thermo Scientific
Bio-Rad T100 thermal cycler  Bio-Rad
Nanodrop 2000  Thermo Scientific
BOECO rotator Multi Bio RS-24  BOECO,Germany
Protein gel electrophoresis and blotting apparatus  Bio-Rad
DynaMag-2 magnet  Life Technologies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huot, M. É, et al. The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis. Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).
  2. Sun, L., et al. Long noncoding RNAs regulate adipogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3387-3392 (2013).
  3. Engreitz, J. M., et al. The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X-chromosome. Science. 341 (6147), 1237973 (2013).
  4. Zhao, X. Y., Li, S., Wang, G. X., Yu, Q., Lin, J. D. A long noncoding RNA transcriptional regulatory circuit drives thermogenic adipocyte differentiation. Mol Cell. 55, 372-382 (2014).
  5. Alvarez-Dominguez, J. R., et al. De novo reconstruction of adipose tissue transcriptomes reveals long non-coding RNA regulators of brown adipocyte development. Cell Metab. 21, 764-776 (2015).
  6. Adams, D. J., Beveridge, D. J., van der Weyden, L., Mangs, H., Leedman, P. J., Morris, B. J. HADHB, HuR, and CP1 bind to the distal 3-untranslated region of human renin mRNA and differentially modulate renin expression. J Biol Chem. 278 (45), 44894-44903 (2003).
  7. Yeap, B. B., et al. Novel binding of HuR and poly(C)-binding protein to a conserved UC-rich motif within the 3´ untranslated region of the androgen receptor messenger RNA. J Biol Chem. 277, 27183-27192 (2002).
  8. König, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives. Nat Rev Genet. 13, 77-83 (2012).
  9. Ferrè, F., Colantoni, A., Helmer-Citterich, M. Revealing protein-lncRNA interaction. Briefings in Bioinformatics. , 1-11 (2015).
  10. McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15 (1), 203 (2014).
  11. Lee, Y. S., et al. AU-rich element-binding protein negatively regulates CCAAT enhancer binding protein mRNA stability during long term synaptic plasticity in Aplysia. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15520-15525 (2012).
  12. Hermann, M., Cermak, T., Voytas, D. F., Pelczar, P. Mouse genome engineering using designer nucleases. J Vis Exp. (86), (2014).
  13. Tsai, M. C., et al. Long Noncoding RNA as Modular Scaffold of Histone Modification Complexes. Science. 329 (5992), 689-693 (2010).
  14. Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505, 706-709 (2014).
  15. Li, H., et al. Identification of mRNA binding proteins that regulate the stability of LDL receptor mRNA through AU rich elements. J Lipid Res. 50 (5), 820-831 (2009).
  16. McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
  17. Chu, C., et al. Systematic Discovery of Xist RNA Binding Proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
  18. Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs. Nat Struct Mol Biol. 22 (1), 29-35 (2015).
  19. Zhao, J., et al. Genome-wide identification of Polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).

Tags

Molecular Biology RNA pull-down RNA-bindende eiwitten adipocyten niet-coderende codering

Erratum

Formal Correction: Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture
Posted by JoVE Editors on 08/20/2016. Citeable Link.

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

The author list has been updated from:

Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2

1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School

2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore

*These authors contributed equally

to:

Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2

1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School

2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore

3Division of Bioengineering, School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

*These authors contributed equally

Detectie van RNA-bindende eiwitten door<em&gt; In Vitro</em&gt; RNA Pull-down in Adipocyte Cultuur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bai, Q., Bai, Z., Xu, S., Sun, L.… More

Bai, Q., Bai, Z., Xu, S., Sun, L. Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture. J. Vis. Exp. (113), e54207, doi:10.3791/54207 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter