Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الكشف عن البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي Published: July 22, 2016 doi: 10.3791/54207
Automatic Translation
*1, *1, 3, 1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School, 2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore, 3Division of Bioengineering, School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

هو الأمثل بروتوكول المنسدلة RNA هنا للكشف عن التفاعلات بين البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي (الممارسات التجارية التقييدية) وغير مكود، وكذلك الرنا الترميز. تم استخدام جزء من الحمض النووي الريبي مستقبلات الاندروجين (AR) كمثال لشرح كيفية استرداد الممارسات التجارية التقييدية في الفترة من lystate من الخلايا الشحمية البنية الأساسية.

Abstract

البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي (الممارسات التجارية التقييدية) وتظهر على شكل طبقة التنظيمية في تطوير وظيفة الدهنية. الممارسات التجارية التقييدية تلعب دورا رئيسيا في تنظيم التعبير الجيني في مستويات posttranscriptional التي تؤثر على الاستقرار ومتعدية كفاءة من mRNAs الهدف. وقد استخدم RNA تقنية المنسدلة على نطاق واسع لدراسة تفاعل الحمض النووي الريبي البروتين، وهو أمر ضروري لتوضيح الآلية الكامنة وراء وظيفة الممارسات التجارية التقييدية "وكذلك الرنا غير الترميز طويلة" (lncRNAs). ومع ذلك، فإن وفرة الدهون عالية في الخلايا الشحمية تشكل تحديا تقنيا في إجراء هذه التجربة. هنا هو الأمثل بروتوكول مفصلة المنسدلة RNA للثقافة خلية شحمية الأولية. شظية من الحمض النووي الريبي (AR) 3 'المنطقة غير مترجمة مستقبلات الاندروجين في (3'UTR) التي تحتوي على elementwas-محلقة uridylate الغنية تستخدم كمثال لشرح كيفية استرداد الشريك الممارسات التجارية التقييدية لها، البروتين حور من lystate خلية شحمية. الطريقة الموصوفة هنا يمكن تطبيقها للكشف عن التفاعلات بينالممارسات التجارية التقييدية والرنا غير المرمزة noncoding الموجودة، وكذلك بين الممارسات التجارية التقييدية والرنا الترميز.

Introduction

الممارسات التجارية التقييدية هي البروتينات التي ربط مزدوج أو واحد الحمض النووي الريبي RNA في الخلايا والمشاركة في تشكيل المجمعات الحمض النووي الريبي البروتين. الممارسات التجارية التقييدية قد ربط مجموعة متنوعة من الأنواع RNA، بما في ذلك مرنا والرنا غير المكودة طويلة (lncRNAs)، وتمارس تأثيرها على مستويات ما بعد النسخي. كل من الممارسات التجارية التقييدية وlncRNAs والمنظمين كما جديدة بدأت تظهر في التنمية الدهنية وتعمل 1،2،3. لفهم آلية RBP- وتنظيم بوساطة lncRNA مسارات الخلوية، فإنه غالبا ما يكون ضروريا للكشف عن التفاعل بين جزيء RNA محددة واحدة أو عدة الممارسات التجارية التقييدية، وأحيانا، إلى تحديد مجموعة كاملة من الشركاء البروتين من الحمض النووي الريبي نسخة. ومع ذلك، يمكن للتجربة أن يكون تحديا نظرا لنسبة عالية من الدهون في الخلايا الشحمية. بروتوكول المنسدلة RNA هو موضح هنا يمكن استخدام لاسترداد الشركاء البروتين من الحمض النووي الريبي محددة من لست] خلية شحمية من الثقافات الأولية 4،5.

الأساس المنطقي لهذا بروتوولخص العقيد على النحو التالي. والطعم RNA هو كتب في المختبر من قالب الحمض النووي، ومترافق إلى حبات مغناطيسية streptavidin المغلفة 4 المسمى البيوتين. حضنت الطعم RNA مع لست] الخلوية للسماح لتشكيل المجمعات الحمض النووي الريبي البروتين، والتي يتم سحبها بعد ذلك إلى أسفل على الوقوف المغناطيسي. وبشكل أكثر تحديدا، وصف بروتوكول المنسدلة RNA دون استخدام أي جزء من الحمض النووي الريبي AR 3'UTR كما الطعم لاسترداد البروتين الحر، والممارسات التجارية التقييدية أعرب عالميا بد أن 3'UTR من من mRNAs 6،7، من theadipocytelysate الثقافة الابتدائية. لاختبار خصوصية ملزمة من هذا الاختبار، وRNAas غير الحكومية ذات الصلة وكذلك حبات streptavidin فارغة يتم تضمين عن السيطرة. هذا البروتوكول هو متوافق مع النشاف الغربية أو قياس الطيف الكتلي (MS) لتأكيد القبض على الممارسات التجارية التقييدية محددة أو لتحديد مرجع الكامل لهذه الممارسات واستولت على التوالي 8.

تتوفر العديد من التقنيات المتاحة لدراسة تفاعل الحمض النووي الريبي البروتينالصورة. للكشف عن الرنا بد من الممارسات التجارية التقييدية معين، RIP (RNA مناعي) وCLIP (يشابك الأشعة فوق البنفسجية ومناعي) يمكن تطبيقها. في المقابل، لتحديد الشركاء البروتين من الحمض النووي الريبي معينة، RNA المنسدلة، غرد (لونين عزل من قبل تنقية RNA)، الرسم البياني (تحليل التهجين القبض على أهداف RNA) وRAP (تنقية العقاقير RNA) يمكن تطبيقها. بالمقارنة مع لاحقة منها، RNA تقنية المنسدلة يأخذ أقل جهد لاقامة. ويمكن أن تستخدم لالتقاط البروتينات في المختبر، وفي الجسم الحي. النهج المتبع في الجسم الحي من الحمض النووي الريبي المنسدلة، التي هي من الناحية الفنية أكثر صعوبة من نظيرتها في المختبر، يحفظ تفاعلات الحمض النووي الريبي البروتين يشابك في الخلايا، يلتقط الرنا الموسومة أبتمر من الاهتمام من الخلايا، وبعد ذلك بالكشف عن الممارسات التجارية التقييدية المربوطة. RNA المنسدلة يمكن استخدامها لإثراء الممارسات التجارية التقييدية وفرة منخفضة، وعزل وتحديد المجمعات الحمض النووي الريبي البروتين التي لها أدوار وظيفية متنوعة في السيطرة على التنظيم الخلوي 9،10

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: RNA من الفائدة في سياق هذه الدراسة هي جزء من AR 3'UTR.

1. إعداد RNA المسمى البيوتين

  1. للحصول على الحمض النووي الريبي، تضخيم T7-AR-جزئية من قبل PCR، تليها في النسخ المختبر باستخدام طقم التجارية وبعد تعليمات الشركة الصانعة (11).
    وترد الاشعال ل PCR في الجدول 4: ملاحظة T7-AR-F وT7-AR-R.
  2. من أجل السيطرة ملزمة غير محددة، تضخيم تسلسل الجزئي من الحمض النووي يراعة luciferase (فلوريدا) بواسطة PCR من psiCHECK-2 البلازميد، تليها في النسخ المختبر.
    وترد الاشعال ل PCR في الجدول 4: ملاحظة hluc (+) - T7 مسبار-F وhluc (+) - التحقيق-R الجدول 4 متواليات من قالب والاشعال لتضخيم PCR..
  3. ل50 ميكرولتر PCR رد فعل، مزيج 50 نانوغرام الحمض النووي (جزئية أو البلازميد)، 4 dNTPs ميكرولتر (2.5 ملم من كل dNTP الفردية)، 5 ميكرولتر 10X العازلة رد فعل، 1 ميكرولتر 2.5 U / & #181؛ ل DNA البلمرة، 2 ميكرولتر 10 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام، 2 ميكرولتر 10 ميكرومتر التمهيدي العكسي، وnuclease خالية من المياه.
    1. تشغيل التضخيم PCR في cycler الحرارية باستخدام البرنامج التالي. STEP1: دورة واحدة من 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. STEP2: 35 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية (AR) أو 60 ثانية (فلوريدا). STEP3: دورة واحدة من 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  4. توليف الرنا المعقدة البيروكسيديز استخدام في المختبر عدة النسخ التالية تعليمات الشركة الصانعة 11. في هذه التجربة، واستخدام المنتجات PCR كقوالب لتخليق الحمض النووي الريبي. ل20 ميكرولتر في المختبر رد فعل النسخ، مزيج 200 نانوغرام PCR تضخيم الحمض النووي، 2 ميكرولتر من كل NTP الفردية، 1 ميكرولتر 10MM البيوتين CTP، 2 ميكرولتر 10X رد فعل العازلة، و 2 ميكرولتر T7 RNA البلمرة. احتضان الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
  5. بعد النسخ في المختبر، وعلاج خليط التفاعل مع 1 ميكرولتر 2 U / الدناز ميكرولتر في 37 & #176؛ ج لمدة 15 دقيقة لتتحلل قالب الحمض النووي. وأخيرا، يخفف من RNA المعقدة البيروكسيديز إلى الحجم الكلي لل60 ميكرولتر لتنقية اللاحقة.
  6. تنقية الرنا المعقدة البيروكسيديز لإزالة الأملاح والنيوكليوتيدات الفردية باستخدام أعمدة تنقية التالية تعليمات الشركة الصانعة 12. قياس تركيز الحمض النووي الريبي ومخزن في -80 درجة مئوية لفحوصات المنسدلة لاحقة.
  7. لضمان هيكل الثانوي المناسب لRNA من الفائدة في الحمض النووي الريبي البروتين التفاعل والحرارة 50 ميكرولتر البيروكسيديز RNA (50 م) في 90 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، والبرد على الجليد لمدة 2 دقيقة، ثم نورد مع 50 2X ميكرولتر عازلة بنية الحمض النووي الريبي (الجدول 3)، والسماح لالحمض النووي الريبي للطي في RT لمدة 30 دقيقة 13،14.

2. إعداد الخرز-RNA مترافق

ملاحظة: استخدم موقفا المغناطيسي لفصل حبات مغناطيسية وطاف.

  1. resuspend والخرز المغناطيسي streptavidin المغلفة في القارورة الأصلية vorte موجزشينغ يلي تعليمات الشركة الصانعة. نقل 150 ميكرولتر معلق الخرز لأنبوب 1.5 مل. وضع أنبوب على المغناطيس لمدة 1 دقيقة. طاف تجاهل. تبقي حبة بيليه.
    ملاحظة: في الحمض النووي الريبي المقايسات المنسدلة، عندما aliquoting الخرز معلق من قارورة الأصلي، استخدم 50 حبات ميكرولتر لفحص تليها النشاف الغربية، و 200 حبات ميكرولتر لفحص تليها MS.
  2. تغسل حبات مرة واحدة من قبل حبة بيليه مع 1 مل من الموصى بها من المصنع 1X W & B تعليق معاودة التخزين المؤقت (الجدول 3) (ملزم والغسيل)، تليها الدورية الأنبوب لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الدوار. طاف تجاهل. تبقي حبة بيليه.
  3. لتعطيل ريبونوكلياز على الخرز، وغسل حبات مرتين، في كل مرة عن طريق إعادة تعليق حبة بيليه مع 400 ميكرولتر عازلة A. عازلة هو الحل القلوية التي تحتوي على 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم وكلوريد الصوديوم 0.05 M (الجدول 3). تدوير أنبوب لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الدوار. طاف تجاهل. تبقي حبة بيليه.
    4. <li> لإزالة هيدروكسيد الصوديوم من الخرز، وغسل حبات مرتين، في كل مرة من حبة بيليه مع 400 ميكرولتر B العازلة وقف إعادة (الجدول 3)، تليها الدورية الأنبوب لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الدوار. طاف تجاهل. تبقي حبة بيليه.
  4. و resuspend حبة بيليه مع 300 ميكرولتر 2X W & B العازلة، الخرز تقسيم بالتساوي ونقل إلى ثلاثة أنابيب 1.5 مل (100 حبات ميكرولتر في الأنبوب). توريد أنابيب تحتوي حبة مع 100 ميكرولتر ريبونوكلياز المياه مجانا، و 100 ميكرولتر البيروكسيديز FL RNA و 100 ميكرولتر البيروكسيديز AR 3'UTR RNA، على التوالي.
  5. احتضان كل الخليط حبة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع دوران. وضع أنابيب على المغناطيس لمدة 1 دقيقة. تجاهل كل طاف. الحفاظ الكريات حبة.
  6. تغسل حبات مرتين، في كل مرة عن طريق إعادة تعليق كل بيليه حبة مع 400 ميكرولتر 1X W & B العازلة، تليها الدورية الأنابيب لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الدوار.
  7. وضع أنابيب على المغناطيس لمدة 1 دقيقة. تجاهل كل طاف. resuspend كل بيلي حبةر 50 عازلة العزلة النووي ميكرولتر (الجدول 3).

3. Preadipocyte عزل وتكون الشحم التعريفي

  1. كما هو موضح في المنشورات السابقة 5، تشريح preadipocytes من بين الكتفين لوحة الدهون البني (C57BL6 الفئران من النوع البري، 3 أسابيع من العمر).
  2. تنمو في المختبر التفريق بين preadipocytes 5. الخلايا جاهزة للتطبيق المصب بعد 4-5 أيام بدء من التمايز.

4. إعداد الخلوية المحللة من الخلايا الشحمية الأولية

مصنوعة التأكد من أن جميع إجراءات إعداد الخلايا المحللة على الجليد، وفتور جميع المخازن على الجليد: ملاحظة. قبل البرد المجانسة dounce الزجاج على الجليد.

  1. تنمو وتفرق preadipocytes في 15 سم أطباق 5 (انظر القسم 3.2). ويقدم كل طبق خلايا كافية لRNA واحد فحص المنسدلة. في يوم 4 أو 5 أيام من التمايز، ونبذ ثقافة المتوسط ​​خلية، وغسل مLLS مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X.
  2. حصاد الخلايا، إضافة 10-15 مل برنامج تلفزيوني 1X إلى الخلايا، كشط لجمع الخلايا في أنبوب 50 مل، وخلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق على RT. تجاهل طاف باستخدام 1 مل ماصة.
  3. Resuspend بيليه خلية في 2 مل العازلة منخفض التوتر (الجدول 3)، واحتضان الخلايا على الجليد لمدة 15 دقيقة. نقل الخلايا إلى الخالط زجاج 15 مل dounce، والخلايا القص ميكانيكيا على الجليد مع 20 السكتات الدماغية.
  4. بيليه نوى الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 3300 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. الحفاظ بيليه أنويتها على الجليد لاستخدامها مرة أخرى (انظر القسم 4.6). نقل طاف لأنابيب 1.5 مل، إضافة بوكل 3M لطاف للحصول على التركيز النهائي من 150 ملم، وتدور في 20000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  5. بعد الطرد المركزي، وإزالة بعناية lipidlayeron أعلى باستخدام 1 مل ماصة، وجمع طاف مثل المحللة الخلوي حشوية.
  6. و resuspend بيليه أنويتها (انظر القسم 4.4) في 1 مل العازلة العزلة النووية. تنوى ransfer إلى الخالط زجاج 15 مل dounce باستخدام 1 مل ماصة، ونوى القص ميكانيكيا على الجليد مع 100 السكتات الدماغية. بيليه الحطام النووي بواسطة الطرد المركزي في 20000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية، وجمع طاف مثل المحللة الخلوي النووي.
  7. إما الجمع بين لست] الخلوية النووية وحشوية، أو استخدام كل جزء على حدة، لالمصب تطبيق المنسدلة. في هذه التجربة التجريبي، تم الجمع بين هذه الكسور اثنين من المحللة خلية في نسبة حجم 1: 1.
  8. إضافة ريبونوكلياز المانع لهذه المحللة خلية غير المجزأ للحصول على تركيز النهائي من 0.5 U / ميكرولتر. جانبا 100 ميكرولتر من المحللة الخلية عن السيطرة المدخلات للغرب النشاف 15.

5. تجليد وشطف من الممارسات التجارية التقييدية

  1. انقسام الخلايا المحللة إلى ثلاثة قسامات متساوية (1ML المحللة الخلية في أنبوب 1.5 مل)، واحتضان مع فارغة، FL الحمض النووي الريبي مترافق والخرز AR 3'UTR الحمض النووي الريبي مترافق (انظر القسم 2.8) على التوالي، لمدة 3 ساعة على 4 درجات Cمع دوران.
  2. وضع أنابيب على المغناطيس لمدة 1 دقيقة. جمع طاف باستخدام ماصة 1 مل، تليها عزل الحمض النووي الريبي من طاف لتأكيد RNA التكاملية. عزل الحمض النووي الريبي باستخدام الحمض guanidinium حل ثيوسيانات الفينول بعد تعليمات الشركة الصانعة (الجدول 2). تقييم intactness RNA عن طريق تحليل 28S و 18S مفارز من الحمض النووي الريبي الريباسي. الحفاظ الكريات حبة على الجليد.
  3. تغسل حبات مغناطيسية ست مرات، في كل مرة عن طريق إعادة التعليق بيليه كل حبة مع 1 مل العازلة العزلة النووية التي تحتوي على 40 U ريبونوكلياز المانع و 0.25٪ IGEPAL، تليها الدورية الأنابيب لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الدوار. استخدام موقف المغناطيسي لفصل حبات مغناطيسية وطاف. تجاهل كل طاف. الحفاظ الكريات حبة على الجليد.
  4. استخدام الخطوات التالية لأزل المجمعات الحمض النووي الريبي البروتين من حبات لالنشاف الغربية. أولا، resuspend كل بيليه حبة في 75 عازلة العزلة النووية ميكرولتر. ثم، إضافة 25 4x وميكرولتر طخة غربية BUF تحميلفر (التي تحتوي على SDS) للحصول على الحجم الكلي 100 ميكرولتر. وأخيرا، وتغلي الخرز في هذا الحل 100 ميكرولتر في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: استخدم الخطوات التالية لأزل المجمعات الحمض النووي الريبي البروتين من حبات لمرض التصلب العصبي المتعدد. STEP1: resuspend كل بيليه حبة في 100 العازلة شطف ميكرولتر (الجدول 3). STEP2: احتضان عينات حبة لمدة 2-3 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع دوران. STEP3: أجهزة الطرد المركزي، وجمع طاف التي تحتوي على البروتين. STEP4: التركيز حلول البروتين 20-30 ميكرولتر قبل تقديمها للماجستير.
  5. أجهزة الطرد المركزي كل 100 ميكرولتر من عينة حبة في 12000 x ج لمدة 30 ثانية في 4 درجات مئوية، وجمع طاف. قسامة طاف 15 ميكرولتر لتحليل لطخة الغربي (انظر القسم 6.1 و 6.2). تحقيق في الغشاء الناتج مع المخفف هور الماوس وحيدة النسيلة الأجسام المضادة (1: 1000 تمييع)، بين عشية وضحاها.

6. التنشيف الغربية للتحقق من الممارسات التجارية التقييدية

  1. الممارسات التجارية التقييدية منفصلة بواسطة SDS-PAGE باستخدام التقنيات القياسية.
  2. إجراء نحنمؤخرة النشاف باستخدام التقنيات القياسية التي تحقق لالممارسات التجارية التقييدية المرتبطة RNA من الفائدة.
    ملاحظة: في هذه التجربة التجريبي، تم استخدام هور الماوس وحيدة النسيلة الأجسام المضادة للمناعي من البروتين حور.
  3. احتضان الغشاء الناتج مع هور الأجسام المضادة المخفف (1: 1000 تمييع) في 5٪ ث / ت غير دهن الحليب الجاف، 1X TBS، 0.1٪ توين - 20 في 4 ° C مع اهتزاز لطيف، وبين عشية وضحاها. يغسل الغشاء ثلاث مرات مع 1X TBST. احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الثانوية (الماعز المضادة للماوس مفتش-HRP) في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. غسل غشاء. تطوير وإشارة قياسية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في هذه التجربة التجريبي، تم استخدام جزء AR RNA كما الطعم للقبض على بروتين ملزمة لها حور. كل من الحمض النووي الريبي الطعم فلوريدا التي هي غير ذات صلة البروتين حور وقسامة من اللامقترن حبات streptavidin فارغة خدم الضوابط سلبية. يمكن أن تحدث تفاعلات الحمض النووي الريبي البروتين سواء في نواة أو السيتوبلازم، وهذا البروتوكول المنسدلة يمكن تطبيقها على أي مجموع أو مجزأة (النووية أو حشوية) الخلية لست]. تحليل البروتينات التي النشاف الغربي يدل على أن عينة من 15 ميكرولتر المحللة خلية غير المجزأ (انظر القسم 4.8)، كما لا حبة مراقبة المدخلات، أعطى نتيجة إيجابية، مشيرا إلى أن تم الكشف عن بروتين الحر في المحللة خلية شحمية الثقافة الماوس الابتدائي باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة. أعطى شطف جزء AR RNA نتيجة إيجابية، مشيرا إلى أن تم الكشف عن بروتين الحر في المحللة خلية شحمية باستخدام AR حبات الحمض النووي الريبي مترافق لفحص المنسدلة الحمض النووي الريبي. كل من فلوريدا جزء RNA شطف وبأعطت عينة نحيف حبة نتائج سلبية، مشيرا إلى أن التفاعلات غير محددة بين FL جزء RNA والبروتين الحر، وكذلك بين حبات فارغة والبروتين الحر لا يمكن كشفها هذا النهج المنسدلة الحمض النووي الريبي. تشير نتائج هذه الضوابط السلبية اثنين كما أن تفاعل معين بين جزء AR RNA والبروتين هور تم الكشف عن بنجاح بواسطة بروتوكول المنسدلة RNA هو موضح هنا.

شكل 1
الشكل 1: البقعة الغربية التأكيد حور الملتقطة بواسطة فحوصات المنسدلة RNA الإدخال: إعادة تشكيل خلية المحللة (حشوية + المحللة النووية)؛ الخرز: عينة من حبات مغناطيسية فارغة streptavidin المغلفة. FL RNA: حبات streptavidin ملزمة مع FL مرنا. AR RNA 3'UTR: حبات streptavidin ملزمة مع AR 3'UTR مرنا. الأجسام المضادة الأولية: حور الماوس وحيدة النسيلة الأجسام المضادة. الأجسام المضادة الثانوية: الماعز المضادة-mouse مفتش-HRP. اختصار، فلوريدا: يراعة luciferase، AR: مستقبلات الاندروجين، يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

جهاز الطرد المركزي
cycler الحرارية
طيفي
محور دوار
الكهربائي للهلام بروتين وأجهزة النشاف
مغناطيس

الجدول 1: المعدات الرئيسية المستخدمة في هذه الدراسة المعدات الرئيسية المستخدمة في هذه الدراسة.

في عدة نسخ في المختبر
RNA المعقدة البيروكسيديز
تدور عمود لاسترداد DNA و RNA شظايا
حبات مغناطيسية Streptavidin
هور الماوس الأجسام المضادة أحادية المنشأ
الماعز المضادة للماوس مفتش-HRP
Nuclease خالية من البيولوجيا الجزيئية المياه الصف
الفوسفات المالحة العازلة
ريبونوكلياز المانع
مثبط البروتياز
البلمرة PFU الحمض النووي
guanidinium حمض حل ثيوسيانات الفينول

الجدول 2: الكواشف الرئيسية المستخدمة في هذه الدراسة الكواشف الرئيسية المستخدمة في هذه الدراسة.

<TR>
عازلة هيكل 2X RNA
20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.4 درجة الحموضة)
0.2 M بوكل
20 ملي MgCl2
2 ملي DTT
0.8 U / ميكرولتر المانع ريبونوكلياز
عازلة لل
0.1 M هيدروكسيد الصوديوم
0.05 M كلوريد الصوديوم
B العازلة
0.1 M كلوريد الصوديوم
1X W & B (وتجليد والغسل) عازلة
5 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (pH7.4)
1 M كلوريد الصوديوم
عازلة 1X ناقص التوتر
10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.4 درجة الحموضة)
10 ملي بوكل
2 مم MgCl2
1 ملم DTT
1 ملم PMSF
1X مثبط البروتياز
عازلة العزلة 1X النووية
25 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.4 درجة الحموضة)
150 ملي بوكل
2 مم MgCl2
1 ملم DTT
0.5٪ IGEPAL (أو 0.25٪ IGEPAL لشطف من الممارسات التجارية التقييدية)
1 ملم PMSF
1X مثبط البروتياز
0.4 U / ميكرولتر ريبونوكلياز المانع (أو 40 U / مل ريبونوكلياز المانع لشطف من الممارسات التجارية التقييدية)
عازلة 1X شطف
2 مم البيوتين في برنامج تلفزيوني 1X

الجدول 3: حلول الرئيسية المستخدمة في هذه الدراسة عازلة بنية الحمض النووي الريبي 2X (انظر القسم 1.7)؛ العازلة ألف (انظر القسم 2.3)؛ B العازلة (انظر القسم 2.4)؛ 1X W & B (وتجليد والغسل) عازلة (أنظر الفصل 2.2، 2.5، 2.7)؛ عازلة 1X ناقص التوتر (انظر القسم 4.3)؛ عازلة العزلة 1X النووية (أنظر الفصل 2.8، 4.6، 5.3، 5.4)؛ 1X شطف عازلة (انظر ملاحظة القسم التالي 5.4).

lways "> قالب والاشعال متواليات T7-AR-بنسبة ضئيلة 5'- تكت AAT ACG ACT CAC TAT AGG GCT GGG CTT TTT TTT تكت CTT تكت لجنة مكافحة الإرهاب CTT تكت TTT تكت تكت TCC جنة مكافحة الإرهاب CCT AGC TTA TGA CCG TGG CAG تكت -3 " T7-AR-F 5'- CTA ATA CGA جنة مكافحة الإرهاب ACT ATA G -3 " T7-AR-R 5'- AGA CTG التقييم القطري المشترك CGG TCA TAA GC -3 " hluc (+) - T7 مسبار-F 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGCCCCTGCTAACGACATTTACAACGAG-3 " hluc (+) - التحقيق-R 5'-CATAATCATAGGGCCGCGCACACAC-3 "

الجدول 4: متواليات من قالب والاشعال ل PCR التضخيم T7-AR-جزئية: قالب الحمض النووي لتضخيم PCR (انظر القسم 10.1)؛ T7-AR-F: التمهيدي إلى الأمام لتضخيم PCR (انظر القسم 1.1)؛ T7-AR-R: عكس التمهيدي لتضخيم PCR (انظر القسم 1.1)؛ hluc (+) - T7 مسبار-F: التمهيدي إلى الأمام لتضخيم PCR (انظر القسم 1.2)؛ hluc (+) - التحقيق-R: التمهيدي العكسي لتضخيم PCR (انظر القسم 1.2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

lncRNAs والممارسات التجارية التقييدية أدوارا حيوية في الصحة والمرض، ولكن الآليات الجزيئية لهذه الجزيئات غير مفهومة. تحديد البروتينات التي تتفاعل مع جزيئات lncRNA هو خطوة مهمة نحو توضيح الآليات التنظيمية. ويستند إثراء الممارسات التجارية التقييدية من قبل نظام فحص المنسدلة RNA على التقاط في حل من التفاعل مجمع بحيث البروتينات من الخلايا المحللة يمكن استخراجها بشكل انتقائي باستخدام الطعوم RNA المعقدة البيروكسيديز بد أن حبات مغناطيسية streptavidin. عدة طرق أخرى مثل غرد، مخطط وRAP قد يحقق نفس الهدف، ولكن هذه الأساليب يأخذ المزيد من الجهد لانشاء من الحمض النووي الريبي المنسدلة تقنية 16،17،18.

القوة الرئيسية من الحمض النووي الريبي المنسدلة هو أنه نسبيا بروتوكول بسيط وسهل القيام بها. كل من غرد وRAP ينطوي على خطوة يشابك أن يحافظ طبيعيا المجمعات الحمض النووي الريبي البروتين وتصميم مجموعة كاملة من أليغنوكليوتيد] العقاقير (90 nucleotides طويلة في RAP، و 20 النيوكليوتيدات طويلة في غرد) تبليط الهدف بأكمله RNA 16،17،18. الحمض النووي الريبي للطي هو خطوة حاسمة في الحمض النووي الريبي المقايسات المنسدلة. القيد الرئيسي من هذا البروتوكول هو أن الرنا الهدف وتوليفها في المختبر ولا يجوز مطوية بشكل صحيح في الهيكل الأصلي للسماح السليم ملزم مع الممارسات التجارية التقييدية (ق). إما أن تفشل الرنا تتجمع غير الأصلية لتشكيل تفاعلات الحمض النووي الريبي البروتين وإبطال المقايسات الفنية، أو تفاعلات الشكل الذي يحدث فقط في المختبر تحت ظروف nonphysiological. على الرغم من أن بروتوكول المنسدلة وصفها هنا اعتمدت إجراءات معترف بها لRNA للطي 13،14 (انظر القسم 1.7)، فإنه لا يضمن للطي المناسب لنسخ الرنا أخرى.

وغالبا ما يقترن RNA المنسدلة مع RIP على أنه نهج تكميلي للكشف عن الحمض النووي الريبي (ق) ملزمة الممارسات التجارية التقييدية من الفائدة 19. خطوة حاسمة أخرى في هذا البروتوكول هو إزالة جزء من المادة الدهنية من خلايا الكليةالمحللة (انظر القسم 4.5) بسبب وفرة الدهون عالية في الخلايا الشحمية ناضجة تقدم تحديا تقنيا كبيرا. تم تطوير بروتوكول صفها هنا بشكل خاص للاستخدام مع الخلايا الشحمية. ومع ذلك، فإن المكونات الأساسية لهذا البروتوكول والتشدد في جميع المخازن المستخدمة يمكن تغييرها وتكييفها لتطبيقها على نماذج الثقافة خلية أخرى للحصول على الأنسجة التي لديها مستويات عالية من ريبونوكلياز الذاتية، ويمكن تطبيق مختلف RNA البروتوكولات المنسدلة.

RNA المنسدلة، والذي يستخدم الرنا من الفائدة للتعرف على الممارسات التجارية التقييدية المرتبطة بها، هي تقنية فعالة وكفؤة للتحقيق في وظائف وآليات المحورية lncRNAs، التي لديها مجموعة واسعة من الأدوار في الخلايا البشرية. التنمية المستقبلية للاعتقال على أساس الحمض النووي الريبي، بما في ذلك RNA المنسدلة، وستكون هناك حاجة لمعالجة التحديات مع تحديد مكونات والتجمع وظيفة من المجمعات الحمض النووي الريبي البروتين، وكذلك توليد الممارسات التجارية التقييدية كافية من انخفاض المجمعات الحمض النووي الريبي البروتين وفيرة لمرض التصلب العصبي المتعدد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

أعلنت أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل سنغافورة جبهة الخلاص الوطني الزمالة (جبهة الخلاص الوطني، 2011NRF-NRFF001-025) وكذلك CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Major materials used in this study.
MEGAscript kit  Ambion
Biotin-14-CTP  Invitrogen
NucAway spin columns  Ambion
Dynabeads M-280 Streptavidin  Invitrogen
HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261)  Santa Cruz Biotechnology
Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005)  Santa Cruz Biotechnology
Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free)  HyClone
Phosphate Buffer Saline (1×PBS)  HyClone
RNase inhibitor  Bioline
Protease inhibitor  Sigma
Pfu Turbo DNA polymerase  Agilent Technologies
TRIsure  Bioline
Name Company Catalog Number Comments
Major equipment used in this study.
Sorvall Legend Micro 21R centrifuge  Thermo Scientific
Sorvall Legend X1R centrifuge  Thermo Scientific
Bio-Rad T100 thermal cycler  Bio-Rad
Nanodrop 2000  Thermo Scientific
BOECO rotator Multi Bio RS-24  BOECO,Germany
Protein gel electrophoresis and blotting apparatus  Bio-Rad
DynaMag-2 magnet  Life Technologies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huot, M. É, et al. The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis. Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).
  2. Sun, L., et al. Long noncoding RNAs regulate adipogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3387-3392 (2013).
  3. Engreitz, J. M., et al. The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X-chromosome. Science. 341 (6147), 1237973 (2013).
  4. Zhao, X. Y., Li, S., Wang, G. X., Yu, Q., Lin, J. D. A long noncoding RNA transcriptional regulatory circuit drives thermogenic adipocyte differentiation. Mol Cell. 55, 372-382 (2014).
  5. Alvarez-Dominguez, J. R., et al. De novo reconstruction of adipose tissue transcriptomes reveals long non-coding RNA regulators of brown adipocyte development. Cell Metab. 21, 764-776 (2015).
  6. Adams, D. J., Beveridge, D. J., van der Weyden, L., Mangs, H., Leedman, P. J., Morris, B. J. HADHB, HuR, and CP1 bind to the distal 3-untranslated region of human renin mRNA and differentially modulate renin expression. J Biol Chem. 278 (45), 44894-44903 (2003).
  7. Yeap, B. B., et al. Novel binding of HuR and poly(C)-binding protein to a conserved UC-rich motif within the 3´ untranslated region of the androgen receptor messenger RNA. J Biol Chem. 277, 27183-27192 (2002).
  8. König, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives. Nat Rev Genet. 13, 77-83 (2012).
  9. Ferrè, F., Colantoni, A., Helmer-Citterich, M. Revealing protein-lncRNA interaction. Briefings in Bioinformatics. , 1-11 (2015).
  10. McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15 (1), 203 (2014).
  11. Lee, Y. S., et al. AU-rich element-binding protein negatively regulates CCAAT enhancer binding protein mRNA stability during long term synaptic plasticity in Aplysia. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15520-15525 (2012).
  12. Hermann, M., Cermak, T., Voytas, D. F., Pelczar, P. Mouse genome engineering using designer nucleases. J Vis Exp. (86), (2014).
  13. Tsai, M. C., et al. Long Noncoding RNA as Modular Scaffold of Histone Modification Complexes. Science. 329 (5992), 689-693 (2010).
  14. Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505, 706-709 (2014).
  15. Li, H., et al. Identification of mRNA binding proteins that regulate the stability of LDL receptor mRNA through AU rich elements. J Lipid Res. 50 (5), 820-831 (2009).
  16. McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
  17. Chu, C., et al. Systematic Discovery of Xist RNA Binding Proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
  18. Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs. Nat Struct Mol Biol. 22 (1), 29-35 (2015).
  19. Zhao, J., et al. Genome-wide identification of Polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).

Tags

علم الأحياء الجزيئي، العدد 113، RNA، وسحب إلى أسفل، ملزم RNA والبروتين، خلية شحمية، غير مكود، والترميز

Erratum

Formal Correction: Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture
Posted by JoVE Editors on 08/20/2016. Citeable Link.

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

The author list has been updated from:

Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2

1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School

2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore

*These authors contributed equally

to:

Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2

1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School

2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore

3Division of Bioengineering, School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

*These authors contributed equally

الكشف عن البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي<em&gt; في المختبر</em&gt; RNA المنسدلة في خلية شحمية الثقافة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bai, Q., Bai, Z., Xu, S., Sun, L.… More

Bai, Q., Bai, Z., Xu, S., Sun, L. Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture. J. Vis. Exp. (113), e54207, doi:10.3791/54207 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter