Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

द्वारा शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन का पता लगाने Published: July 22, 2016 doi: 10.3791/54207
Automatic Translation
*1, *1, 3, 1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School, 2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore, 3Division of Bioengineering, School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

एक शाही सेना पुल से नीचे प्रोटोकॉल यहाँ आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन (RBPs) और noncoding के रूप में भी कोडिंग RNAs के बीच बातचीत का पता लगाने के लिए अनुकूलित है। एण्ड्रोजन रिसेप्टर (एआर) से एक शाही सेना टुकड़ा प्रदर्शित करने के लिए कैसे प्राथमिक भूरे रंग adipocytes के lystate से अपने RBP पुनः प्राप्त करने के लिए एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया गया था।

Abstract

शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन (RBPs) के विकास और वसा के समारोह में एक नियामक परत के रूप में उभर रहे हैं। RBPs लक्ष्य mRNAs की स्थिरता और translational दक्षता को प्रभावित करने से posttranscriptional स्तरों पर जीन अभिव्यक्ति विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। आरएनए पुल से नीचे तकनीक का व्यापक रूप आरएनए प्रोटीन बातचीत, जो तंत्र अंतर्निहित RBPs 'के रूप में अच्छी तरह से लंबे समय से गैर-कोडिंग RNAs' (lncRNAs) समारोह को स्पष्ट करने के लिए आवश्यक है अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, adipocytes में उच्च लिपिड बहुतायत इस प्रयोग के संचालन में एक तकनीकी चुनौती बन गया है। यहाँ एक विस्तृत आरएनए पुल से नीचे प्रोटोकॉल प्राथमिक वसाकोशिका संस्कृति के लिए अनुकूलित है। एण्ड्रोजन रिसेप्टर के (एआर) 3 'untranslated क्षेत्र (3'UTR) एक adenylate-uridylate अमीर कैसे प्रदर्शित करने वसाकोशिका lystate से, अपने RBP साथी, हूर प्रोटीन को पुनः प्राप्त करने के लिए एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया elementwas युक्त से एक शाही सेना टुकड़ा। विधि यहाँ वर्णित के बीच बातचीत का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता हैRBPs और noncoding RNAs, साथ ही बीच RBPs और कोडिंग RNAs।

Introduction

RBPs प्रोटीन है कि कोशिकाओं में डबल या एकल असहाय शाही सेना के लिए बाध्य और आरएनए प्रोटीन परिसरों के गठन में भाग रहे हैं। RBPs mRNA और लंबे noncoding RNAs (lncRNAs) सहित आरएनए प्रजातियों की एक किस्म के लिए बाध्य, और बाद ट्रांसक्रिप्शनल स्तरों पर उनके प्रभाव डालती सकता है। दोनों RBPs और lncRNAs वसा विकास के रूप में उपन्यास नियामकों उभर रहा है और 1,2,3 समारोह कर रहे हैं। RBP- की व्यवस्था और सेलुलर रास्ते में से lncRNA की मध्यस्थता विनियमन समझने के लिए, यह अक्सर एक विशिष्ट आरएनए अणु और एक या कई RBPs के बीच बातचीत का पता लगाने के लिए आवश्यक है, और, कभी कभी, एक शाही सेना के प्रोटीन भागीदारों की पूर्ण स्पेक्ट्रम की पहचान के लिए प्रतिलेख। हालांकि, प्रयोग adipocytes में लिपिड की उच्च सामग्री के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है। आरएनए पुल से नीचे प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित प्राथमिक संस्कृतियों 4,5 के वसाकोशिका lysates से एक विशिष्ट शाही सेना के प्रोटीन के भागीदारों को पुनः प्राप्त करने के लिए नियोजित किया जा सकता है।

इस आद्य के लिए तर्ककर्नल के रूप में संक्षेप है। एक शाही सेना चारा एक डीएनए टेम्पलेट से लिखित विट्रो में है, बायोटिन लेबल और streptavidin लेपित चुंबकीय मोतियों से 4 संयुग्मित। आरएनए चारा आरएनए प्रोटीन परिसरों, जो बाद में एक चुंबकीय स्टैंड पर नीचे खींच रहे हैं के गठन के लिए अनुमति देने के लिए सेलुलर lysates साथ incubated है। अधिक विशेष रूप से, आरएनए पुल से नीचे प्रोटोकॉल नीचे वर्णित हूर प्रोटीन, एक सार्वभौमिक व्यक्त RBP, mRNAs 6.7 की 3'UTR के लिए बाध्य प्राथमिक संस्कृति के theadipocytelysate से पुनः प्राप्त करने के लिए प्रलोभन के रूप में एआर 3'UTR से एक शाही सेना टुकड़ा का उपयोग करें। इस परख के बंधन विशिष्टता का परीक्षण करने के लिए, एक गैर-प्रासंगिक RNAas साथ ही खाली streptavidin मोतियों नियंत्रण के रूप में शामिल किया गया है। इस प्रोटोकॉल एक विशिष्ट RBP का कब्जा पुष्टि करने के लिए या कब्जा कर लिया RBPs क्रमश: 8 से भरा प्रदर्शनों की सूची की पहचान करने के लिए पश्चिमी सोख्ता या मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) के साथ संगत है।

कई तकनीकों आरएनए प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध हैंएस। एक दिया RBP, चीर (आरएनए immunoprecipitation) और क्लिप (यूवी crosslinking और immunoprecipitation) से बंधे RNAs प्रकट करने के लिए लागू किया जा सकता है। इसके विपरीत, एक दिया शाही सेना के प्रोटीन भागीदारों की पहचान करने के लिए, शाही सेना पुल से नीचे, कलरव (आरएनए शुद्धि द्वारा क्रोमेटिन अलगाव), चार्ट (आरएनए लक्ष्य का कब्जा संकरण विश्लेषण) और आरएपी (आरएनए antisense शुद्धि) लागू किया जा सकता है। बाद में लोगों के साथ तुलना में, आरएनए पुल से नीचे तकनीक स्थापित करने के लिए कम प्रयास लेता है। यह इन विट्रो में और vivo में प्रोटीन पर कब्जा करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। आरएनए पुल से नीचे है, जो अपने इन विट्रो समकक्ष से तकनीकी रूप से और अधिक चुनौतीपूर्ण है, के vivo दृष्टिकोण कोशिकाओं में crosslinking द्वारा आरएनए प्रोटीन बातचीत को बरकरार रखता है, कोशिकाओं से ब्याज की aptamer टैग RNAs कब्जा, और बाद में बाध्य RBPs पता लगाता है। आरएनए पुल से नीचे कम प्रचुर मात्रा में RBPs को समृद्ध, और अलग-थलग और सेलुलर विनियमन 9,10 नियंत्रित करने में आरएनए प्रोटीन परिसरों है कि विविध कार्यात्मक भूमिका की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नोट: इस अध्ययन के संदर्भ में ब्याज की शाही सेना एआर 3'UTR का एक टुकड़ा है।

1. बायोटिन लेबल शाही सेना की तैयारी

  1. आरएनए प्राप्त करने के लिए, एक वाणिज्यिक किट का उपयोग और निर्माता के निर्देशों 11 निम्नलिखित बढ़ाना पीसीआर द्वारा T7-AR-oligo, इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा पीछा किया।
    नोट: पीसीआर के लिए प्राइमर तालिका 4 में सूचीबद्ध हैं: T7-AR-एफ और T7-ए आर आर।
  2. गैर विशिष्ट बंधन नियंत्रण के लिए, जुगनू luciferase (फ्लोरिडा) डीएनए पीसीआर द्वारा psiCHECK -2 प्लाज्मिड से, इन विट्रो प्रतिलेखन के बाद की एक आंशिक अनुक्रम बढ़ाना।
    नोट: पीसीआर के लिए प्राइमर तालिका 4 में सूचीबद्ध हैं: hluc (+) - T7 जांच-एफ और hluc (+) - जांच-आर तालिका 4 पीसीआर प्रवर्धन के लिए टेम्पलेट और प्राइमरों के दृश्यों।।।
  3. एक 50 μl पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए, मिश्रण 50 एनजी डीएनए (oligo या प्लाज्मिड), 4 μl dNTPs (प्रत्येक व्यक्ति dNTP के 2.5 मिमी), 5 μl 10x प्रतिक्रिया बफर, 1 μl 2.5 यू / & #181, एल डीएनए पोलीमरेज़, 2 μl 10 माइक्रोन के आगे प्राइमर, 2 μl 10 माइक्रोन रिवर्स प्राइमर, और nuclease मुक्त पानी।
    1. निम्नलिखित प्रोग्राम का उपयोग कर एक थर्मल cycler में पीसीआर प्रवर्धन चलाएँ। Step1: 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस से एक चक्र; Step2: 30 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 35 चक्र, 30 सेकंड के लिए 55 डिग्री सेल्सियस और 30 सेकंड (एआर) या 60 सेकंड (सीए) के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; चरण 3: 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस से एक चक्र।
  4. इन विट्रो प्रतिलेखन किट निर्माता के निर्देशों 11 निम्न का उपयोग कर biotinylated RNAs synthesize। इस प्रयोग में, आरएनए संश्लेषण के लिए टेम्पलेट्स के रूप में पीसीआर उत्पादों का उपयोग करें। एक 20 μl इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के लिए, मिश्रण 200 एनजी पीसीआर प्रवर्धित डीएनए, प्रत्येक व्यक्ति के राष्ट्रीय क्षयरोग नियंत्रण कार्यक्रम के 2 μl, 1 μl 10mM बायोटिन सीटीपी, 2 μl 10x प्रतिक्रिया बफर, और 2 μl T7 शाही सेना पोलीमरेज़। 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण सेते हैं।
  5. 37 & # पर इन विट्रो प्रतिलेखन, 1 μl 2 यू / μl DNase के साथ इलाज के बाद प्रतिक्रिया मिश्रण176, सी 15 मिनट के लिए टेम्पलेट डीएनए नीचा करने के लिए। अंत में, बाद में शुद्धीकरण के लिए 60 μl की कुल मात्रा को biotinylated आरएनए पतला।
  6. Biotinylated RNAs शुद्ध निर्माता के निर्देशों का पालन 12 शुद्धि कॉलम का उपयोग करके लवण और अनिगमित न्यूक्लियोटाइड हटा दें। बाद में पुल से नीचे assays के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर आरएनए एकाग्रता और दुकान उपाय।
  7. 2 मिनट, 2 मिनट के लिए बर्फ पर ठंड के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर आरएनए प्रोटीन बातचीत, गर्मी 50 μl biotinylated आरएनए (50 बजे) में ब्याज की शाही सेना के लिए उचित माध्यमिक संरचना सुनिश्चित करने के लिए, तो 50 μl 2x आरएनए संरचना बफर (तालिका के साथ की आपूर्ति 3), और आरएनए 30 मिनट 13,14 के लिए आरटी पर तह के लिए अनुमति देते हैं।

2. शाही सेना संयुग्मित मोती की तैयारी

नोट: चुंबकीय माला और सतह पर तैरनेवाला के विभाजन के लिए एक चुंबकीय स्टैंड का प्रयोग करें।

  1. संक्षिप्त vorte द्वारा मूल शीशी में streptavidin लेपित चुंबकीय मोती Resuspendजिंग निर्माता के निर्देशों का पालन। एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब resuspended मोती 150 μl स्थानांतरण। चुंबक पर ट्यूब 1 मिनट के लिए रखें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें। मनका गोली रखें।
    नोट: शाही सेना को पुल से नीचे assays में, जब मूल शीशी से resuspended मोती aliquoting, एक परख पश्चिमी सोख्ता द्वारा पीछा के लिए 50 μl मोती, और 200 μl मोती एक परख एमएस के द्वारा पीछा के लिए इस्तेमाल करते हैं।
  2. द्वारा फिर से निलंबित निर्माता की सिफारिश की 1x डब्ल्यू एंड बी के 1 मिलीलीटर के साथ मनका गोली (बंधन और वाशिंग) बफर (तालिका 3) एक बार मोती धोने, एक रोटेटर में कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ट्यूब घूर्णन द्वारा पीछा किया। सतह पर तैरनेवाला त्यागें। मनका गोली रखें।
  3. साथ 400 μl बफर ए बफर मनका गोली फिर से निलंबित द्वारा मनकों पर RNase निष्क्रिय करने के लिए, मोती दो बार धोने, हर बार 0.1 एम NaOH और 0.05 एम NaCl (3 टेबल) युक्त एक क्षारीय समाधान है। एक रोटेटर में कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए ट्यूब घुमाएँ। सतह पर तैरनेवाला त्यागें। मनका गोली रखें।
    4. <li> फिर से निलंबित साथ 400 μl बफर बी मनका गोली (3 टेबल), एक रोटेटर में कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए ट्यूब घूर्णन द्वारा पीछा द्वारा मोतियों से NaOH निकालने के लिए, मोती दो बार धोने, हर बार। सतह पर तैरनेवाला त्यागें। मनका गोली रखें।
  4. 300 μl 2x डब्ल्यू एंड बी बफर के साथ Resuspend मनका गोली, विभाजन मोती समान रूप से और तीन 1.5 मिलीलीटर ट्यूब (ट्यूब प्रति 100 μl मोती) में स्थानांतरित। 100 μl RNase मुक्त पानी के साथ मनका-युक्त ट्यूबों की आपूर्ति, 100 μl biotinylated फ्लोरिडा शाही सेना और 100 μl biotinylated एआर 3'UTR आरएनए, क्रमशः।
  5. रोटेशन के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए प्रत्येक मनका मिश्रण सेते हैं। 1 मिनट के लिए चुंबक पर ट्यूबों रखें। सभी सतह पर तैरनेवाला त्यागें। मनका छर्रों रखें।
  6. 400 μl 1x डब्ल्यू एंड बी बफर के साथ प्रत्येक मनका गोली फिर से निलंबित द्वारा, दो बार मोती धो हर बार, एक रोटेटर में कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ट्यूबों घूर्णन द्वारा पीछा किया।
  7. 1 मिनट के लिए चुंबक पर ट्यूबों रखें। सभी सतह पर तैरनेवाला त्यागें। प्रत्येक मनका पेले Resuspend50 μl परमाणु अलगाव बफर (तालिका 3) के साथ टी।

3. Preadipocyte अलगाव और वसाजनन प्रेरण

  1. पिछले प्रकाशनों 5 में वर्णित है, interscapular भूरा वसा पैड से preadipocytes (C57BL6 जंगली प्रकार चूहों, 3 सप्ताह पुराना) काटना।
  2. आगे बढ़ें और इन विट्रो में preadipocytes 5 अलग। प्रकोष्ठों के बहाव के आवेदन 4-5 दिनों के भेदभाव की दीक्षा के बाद के लिए तैयार हैं।

प्राथमिक एडिपोसाईट से सेलुलर lysate के 4. तैयारी

नोट: सेल lysate तैयारी के सभी प्रक्रिया सुनिश्चित बर्फ पर बना रहे हैं, और सभी बफ़र्स बर्फ पर ठंडा कर रहे हैं। बर्फ पर पूर्व ठंड Dounce कांच homogenizers।

  1. आगे बढ़ें और 15 सेमी व्यंजन 5 (खंड 3.2 देखें) में preadipocytes अलग। प्रत्येक पकवान एक आरएनए पुल से नीचे परख के लिए पर्याप्त मात्रा में कोशिकाओं को प्रदान करता है। दिन 4 या भेदभाव, त्यागने सेल संस्कृति के माध्यम से 5 दिन, और धोने के सीई परएक बार 1x पीबीएस के साथ lls।
  2. कोशिकाओं फसल के लिए, कोशिकाओं को 10-15 मिलीलीटर 1x पीबीएस जोड़ने के लिए, आरटी पर 5 मिनट के लिए 200 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं को एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं, और इकट्ठा करने के लिए परिमार्जन। 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  3. 2 मिलीलीटर में Resuspend सेल गोली hypotonic बफर (3 टेबल), और 15 मिनट के लिए बर्फ पर कोशिकाओं सेते हैं। एक 15 मिलीलीटर Dounce कांच homogenizer कोशिकाओं स्थानांतरण, और 20 स्ट्रोक के साथ यंत्रवत् बर्फ पर कतरनी कोशिकाओं।
  4. गोली सेल 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 3300 XG पर centrifugation द्वारा नाभिक। आगे उपयोग के लिए बर्फ पर नाभिक गोली रखें (खंड 4.6 देखें)। 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण, 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 20,000 XG पर 150 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता, और स्पिन प्राप्त करने के लिए सतह पर तैरनेवाला के लिए 3M KCl जोड़ें।
  5. Centrifugation के बाद, ध्यान से 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करके शीर्ष lipidlayeron हटाने, और cytoplasmic सेलुलर lysate के रूप में सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा।
  6. नाभिक गोली Resuspend 1 मिलीलीटर परमाणु अलगाव बफर में (खंड 4.4 देखें)। टीएक 15 मिलीलीटर Dounce गिलास 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करने के लिए homogenizer ransfer नाभिक, और यंत्रवत् 100 स्ट्रोक के साथ बर्फ पर कतरनी नाभिक। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 20,000 XG पर centrifugation द्वारा परमाणु मलबे गोली, और परमाणु सेलुलर lysate के रूप में सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा।
  7. या तो परमाणु और cytoplasmic सेलुलर lysates गठबंधन है, या नीचे की ओर पुल से नीचे आवेदन के लिए अलग से एक अंश का उपयोग करें। इस डेमो प्रयोग में, सेल lysate के इन दो भागों 1 की मात्रा के अनुपात में संयुक्त थे: 1।
  8. इस unfractionated सेल lysate को RNase अवरोध जोड़े 0.5 यू / μl के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए। पश्चिमी सोख्ता 15 के लिए इनपुट नियंत्रण के रूप में सेल lysate के एक तरफ 100 μl सेट करें।

5. बाध्यकारी और RBP की क्षालन

  1. तीन बराबर aliquots में विभाजित सेल lysate (एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 1ml सेल lysate), और खाली साथ सेते हैं, फ्लोरिडा आरएनए संयुग्मित और एआर 3'UTR आरएनए संयुग्मित मोती क्रमशः 4 डिग्री पर (धारा 2.8 देखें), 3 घंटे के लिए सीरोटेशन के साथ।
  2. 1 मिनट के लिए चुंबक पर ट्यूबों रखें। आरएनए समाकलन पुष्टि करने के लिए 1 मिलीलीटर पिपेट, तैरनेवाला से शाही सेना अलगाव के द्वारा पीछा का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला लीजिए। एक एसिड guanidinium thiocyanate फिनोल समाधान निर्माता के निर्देशों (तालिका 2) निम्नलिखित का उपयोग करके अलग आरएनए। 28S और 18S ribosomal शाही सेना की यूनिटों का विश्लेषण करके आरएनए intactness का आकलन करें। बर्फ पर मनका छर्रों रखें।
  3. 1 मिलीलीटर परमाणु अलगाव 40 यू RNase अवरोध और 0.25% IGEPAL, एक रोटेटर में कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए ट्यूबों घूर्णन द्वारा पीछा किया युक्त बफर के साथ प्रत्येक मनका गोली resuspending द्वारा चुंबकीय मोती छह बार, हर बार धो लें। चुंबकीय माला और सतह पर तैरनेवाला के विभाजन के लिए एक चुंबकीय स्टैंड का प्रयोग करें। सभी सतह पर तैरनेवाला त्यागें। बर्फ पर मनका छर्रों रखें।
  4. पश्चिमी सोख्ता के लिए मोतियों से आरएनए प्रोटीन परिसरों elute करने के लिए निम्न चरणों का प्रयोग करें। सबसे पहले, 75 μl परमाणु अलगाव बफर में प्रत्येक मनका गोली resuspend; उसके बाद, 25 μl 4x पश्चिमी धब्बा लोड हो रहा है buf जोड़नेफेर (एसडीएस युक्त) 100 μl की कुल मात्रा प्राप्त करने के लिए। अंत में, 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर यह 100 μl समाधान में मोती फोड़ा।
    नोट: निम्न चरणों का उपयोग एमएस के लिए मोतियों से आरएनए प्रोटीन परिसरों elute करने के लिए। Step1: 100 μl क्षालन बफर (3 टेबल) में प्रत्येक मनका गोली resuspend; Step2: रोटेशन के साथ कमरे के तापमान पर 2-3 घंटे के लिए मनका नमूने सेते हैं; चरण 3: सेंट्रीफ्यूज और प्रोटीन युक्त सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा; 4.: एमएस के लिए प्रस्तुत करने से पहले 20-30 μl के लिए प्रोटीन समाधान ध्यान केंद्रित।
  5. अपकेंद्रित्र प्रत्येक 100 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के लिए 12,000 XG पर मनका नमूना के μl, और सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण (धारा 6.1 और 6.2 देखें) के लिए विभाज्य 15 μl सतह पर तैरनेवाला। पतला हूर माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ जिसके परिणामस्वरूप झिल्ली जांच (1: 1,000 कमजोर पड़ने), रात भर।

6. RBP के सत्यापन के लिए पश्चिमी सोख्ता

  1. एसडीएस पृष्ठ से अलग RBPs मानक तकनीक का उपयोग।
  2. हम आचरणस्टर्न ब्याज की शाही सेना के साथ जुड़े RBPs के लिए जांच कर रही द्वारा मानक तकनीक का उपयोग सोख्ता।
    नोट: इस डेमो प्रयोग में, हूर माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी हूर प्रोटीन की immunodetection के लिए इस्तेमाल किया गया था।
  3. पतला हूर एंटीबॉडी के साथ जिसके परिणामस्वरूप झिल्ली सेते हैं: 5% (1 1,000 कमजोर पड़ने) डब्ल्यू / वी नोनफेट शुष्क दूध, 1x टीबीएस, 0.1% बीच - 20 4 में कोमल झटकों के साथ सी °, रात भर। 1x TBST के साथ झिल्ली तीन बार धोएं। 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर माध्यमिक एंटीबॉडी (बकरी विरोधी माउस आईजीजी एचआरपी) के साथ झिल्ली सेते हैं। धो झिल्ली। विकास और रिकॉर्ड संकेत।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इस डेमो प्रयोग में, एक एआर आरएनए टुकड़ा इसकी बाइंडिंग प्रोटीन हूर पर कब्जा करने के चारे के रूप में इस्तेमाल किया गया था। दोनों एक फ्लोरिडा आरएनए चारा है कि हूर प्रोटीन के लिए गैर-प्रासंगिक है, और unconjugated खाली streptavidin मोतियों की एक विभाज्य के रूप में नकारात्मक नियंत्रण में कार्य किया। आरएनए प्रोटीन बातचीत या तो नाभिक या कोशिका द्रव्य में हो सकता है, और इस पुल से नीचे प्रोटोकॉल या तो कुल या fractionated (परमाणु या cytoplasmic) सेल lysates के लिए लागू किया जा सकता है। पश्चिमी सोख्ता द्वारा प्रोटीन के विश्लेषण से पता चलता है कि 15 μl unfractionated सेल lysate का नमूना (धारा 4.8 देखें), कोई मनका इनपुट नियंत्रण के रूप में, एक सकारात्मक परिणाम दे दी है, यह दर्शाता है कि हूर प्रोटीन का उपयोग करके माउस प्राथमिक संस्कृति के वसाकोशिका lysate में पता चला है मोनोक्लोनल एंटीबॉडी। एआर आरएनए क्षालन अंश एक सकारात्मक परिणाम दे दी है, यह दर्शाता है कि हूर प्रोटीन आरएनए पुल से नीचे परख के लिए एआर आरएनए संयुग्मित मनकों का उपयोग करके वसाकोशिका lysate में पता चला है। दोनों फ्लोरिडा आरएनए क्षालन अंश और खदुबला मनका नमूना नकारात्मक परिणाम दे दी है, फ्लोरिडा आरएनए टुकड़ा और हूर प्रोटीन के बीच बातचीत का संकेत है कि अविशिष्ट के रूप में अच्छी तरह से खाली माला और हूर प्रोटीन के बीच के रूप में इस शाही सेना को पुल से नीचे दृष्टिकोण से पहचाना नहीं हैं। इन दो नकारात्मक नियंत्रण के परिणाम भी संकेत मिलता है कि एआर आरएनए टुकड़ा और हूर प्रोटीन के बीच एक विशेष बातचीत सफलतापूर्वक आरएनए पुल से नीचे यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल से पता चला है।

आकृति 1
चित्रा 1: हूर के वेस्टर्न ब्लाट सत्यापन आरएनए पुल से नीचे assays के द्वारा कब्जा कर लिया इनपुट: पुनर्गठन सेल lysate (cytoplasmic + परमाणु lysate);। मोती: रिक्त streptavidin लेपित चुंबकीय मोतियों से नमूना; फ्लोरिडा आरएनए: streptavidin मोतियों फ्लोरिडा mRNA के साथ ही; एआर 3'UTR आरएनए: streptavidin मोतियों एआर 3'UTR mRNA के साथ ही; प्राथमिक एंटीबॉडी: हूर माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी; माध्यमिक एंटीबॉडी: बकरी विरोधी-mouse आईजीजी एचआरपी; संक्षिप्त, फ्लोरिडा: जुगनू luciferase, एआर: एण्ड्रोजन रिसेप्टर, यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अपकेंद्रित्र
थर्मल साइक्लर
स्पेक्ट्रोफोटोमीटर
अंग को घुमानेवाली पेशी
प्रोटीन जेल वैद्युतकणसंचलन और सोख्ता तंत्र
चुंबक

तालिका 1: प्रमुख उपकरण इस अध्ययन में इस्तेमाल इस अध्ययन में इस्तेमाल प्रमुख उपकरण।।

इन विट्रो प्रतिलेखन किट में
biotinylated आरएनए
डीएनए और आरएनए के टुकड़े की वसूली के लिए स्तंभ स्पिन
Streptavidin चुंबकीय मोती
हूर माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी
बकरी विरोधी माउस आईजीजी एचआरपी
Nuclease मुक्त आणविक जीव विज्ञान ग्रेड पानी
फॉस्फेट बफर खारा
RNase अवरोध
protease अवरोध
Pfu डीएनए पोलीमरेज़
एसिड guanidinium thiocyanate फिनोल समाधान

तालिका 2: मेजर अभिकर्मकों इस अध्ययन में इस्तेमाल इस अध्ययन में इस्तेमाल मेजर अभिकर्मकों।।

<टीआर>
2x आरएनए संरचना बफर
20 मिमी Tris एचसीएल (पीएच 7.4)
0.2 एम KCl
20 मिमी MgCl2
2 मिमी डीटीटी
0.8 यू / μl RNase अवरोध
बफर
0.1 एम NaOH
0.05 एम NaCl
बफर बी
0.1 एम NaCl
1x डब्ल्यू एंड बी (बाध्यकारी और धुलाई) बफर
5 मिमी Tris एचसीएल (pH7.4)
1 एम NaCl
1x Hypotonic बफर
10 मिमी Tris एचसीएल (पीएच 7.4)
10 मिमी KCl
2 मिमी MgCl2
1 मिमी डीटीटी
1 मिमी PMSF
1x protease अवरोध
1x परमाणु अलगाव बफर
25 मिमी Tris एचसीएल (पीएच 7.4)
150 मिमी KCl
2 मिमी MgCl2
1 मिमी डीटीटी
0.5% IGEPAL (या 0.25% की RBPs क्षालन के लिए IGEPAL)
1 मिमी PMSF
1x protease अवरोध
0.4 यू / μl RNase अवरोध करनेवाला (या 40 यू / एमएल RNase अवरोध RBPs की क्षालन के लिए)
1x क्षालन बफर
1x पीबीएस में 2 मिमी बायोटिन

। तालिका 3: मेजर समाधान इस अध्ययन में इस्तेमाल 2x आरएनए संरचना बफर (खंड 1.7 देखें); बफर (देखें अनुभाग 2.3); बफर बी (धारा 2.4 देखें); 1x डब्ल्यू एंड बी (बाध्यकारी और धुलाई) बफर (वर्गों 2.2, 2.5, 2.7 देखें); 1x Hypotonic बफर (खंड 4.3 देखें); 1x परमाणु अलगाव बफर (वर्गों 2.8, 4.6, 5.3 देखते हैं, 5.4); 1x क्षालन बफर (देखें नोट: निम्न अनुभाग 5.4)।

lways "> खाका और प्राइमरों दृश्यों T7-AR-oligo 5'- TCT AAT ACG अधिनियम सीएसी जैसे AGG GCT GGG सीटीटी TTT TTT TCT सीटीटी TCT सीटीसी सीटीटी TCT TTT TCT TCT टीसीसी सीटीसी सी सी टी एजीसी TTA TGA CCG TGG कैग TCT -3 ' T7-AR-एफ 5'- सीटीए अता सीजीए सीटीसी अधिनियम अता जी -3 ' T7-AR-आर 5'- आगा CTG सीसीए CGG टीसीए TAA जीसी -3 ' hluc (+) - T7 जांच-एफ 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGCCCCTGCTAACGACATTTACAACGAG -3 ' hluc (+) - जांच-आर 5'-CATAATCATAGGGCCGCGCACACAC -3 '

सारणी 4: खाका के दृश्यों और पीसीआर प्रवर्धन T7-AR-oligo के लिए प्राइमर:। पीसीआर प्रवर्धन के लिए डीएनए टेम्पलेट (खंड 1 देखें.1); T7-AR-एफ: पीसीआर प्रवर्धन (धारा 1.1 देखें) के लिए आगे प्राइमर; T7-AR-आर: पीसीआर प्रवर्धन (धारा 1.1 देखें) के लिए प्राइमर रिवर्स; hluc (+) - T7 जांच-एफ: पीसीआर प्रवर्धन के लिए आगे प्राइमर (धारा 1.2 देखें); hluc (+) - जांच-आर: पीसीआर प्रवर्धन (धारा 1.2 देखें) के लिए रिवर्स प्राइमर।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

lncRNAs और RBPs स्वास्थ्य और रोग में महत्वपूर्ण भूमिका है, लेकिन इन अणुओं के आणविक तंत्र खराब समझ रहे हैं। प्रोटीन है कि lncRNA अणुओं के साथ बातचीत की पहचान विनियामक तंत्र elucidating की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम है। आरएनए पुल से नीचे परख प्रणाली द्वारा RBPs के संवर्धन जटिल बातचीत इतना है कि एक सेल lysate से प्रोटीन चुनिंदा streptavidin चुंबकीय मोतियों के लिए बाध्य biotinylated आरएनए फँसाना चाहे का उपयोग कर निकाला जा सकता है की इन समाधान कब्जा पर आधारित है। इस तरह के कलरव, चार्ट और आरएपी के रूप में कई अन्य तरीकों से एक ही लक्ष्य को प्राप्त कर सकते हैं, हालांकि इन तरीकों आरएनए पुल से नीचे तकनीक 16,17,18 से स्थापित करने के लिए और अधिक प्रयास लेता है।

आरएनए पुल से नीचे के मुख्य ताकत है कि यह अपेक्षाकृत एक सरल प्रोटोकॉल और प्रदर्शन करने के लिए आसान है। दोनों कलरव और आरएपी एक crosslinking कदम है कि स्वाभाविक रूप से बरकरार रखता है आरएनए प्रोटीन परिसरों और antisense oligonucleotides का एक पूरा सेट की डिजाइन से होने वाली शामिल (90 Nucleotides लंबे आवाज में, और लंबे समय कलरव में 20 न्यूक्लियोटाइड) पूरे लक्ष्य शाही सेना 16,17,18 खपरैल का छत। आरएनए तह आरएनए पुल से नीचे assays में एक महत्वपूर्ण कदम है। इस प्रोटोकॉल का मुख्य सीमा यह है कि लक्ष्य RNAs इन विट्रो में संश्लेषित कर रहे हैं और उचित इसकी RBP (एस) के साथ बाध्यकारी अनुमति देने के लिए मूल संरचना में सही ढंग से मुड़ा नहीं किया जा सकता है। Misfolded गैर देशी RNAs या तो आरएनए प्रोटीन बातचीत के लिए फार्म और कार्यात्मक assays, या फार्म कि बातचीत केवल nonphysiological की शर्तों के तहत इन विट्रो में होते रद्द करने के लिए विफल हो सकता है। हालांकि पुल से नीचे प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित आरएनए 13,14 तह के लिए एक अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त प्रक्रिया को अपनाया (धारा 1.7 देखें), यह अन्य शाही सेना टेप के लिए उचित तह गारंटी नहीं है।

आरएनए पुल से नीचे अक्सर एक पूरक दृष्टिकोण शाही सेना (एस) ब्याज 19 की RBP से बंधे का पता लगाने के रूप में चीर के साथ युग्मित है। इस प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम कुल सेल से लिपिड अंश को हटाने की हैlysate (धारा 4.5 देखें) क्योंकि परिपक्व adipocytes में उच्च लिपिड बहुतायत एक प्रमुख तकनीकी चुनौती प्रस्तुत करता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल विशेष रूप से adipocytes के साथ उपयोग के लिए विकसित की है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया और सभी buffers की तंगी के बुनियादी घटकों को बदल दिया जा सकता है और अन्य सेल संस्कृति मॉडल के लिए आवेदन के लिए अनुकूलित। ऊतकों है कि अंतर्जात RNase के उच्च स्तर के लिए, विभिन्न आरएनए पुल से नीचे प्रोटोकॉल लागू किया जा सकता है।

आरएनए पुल से नीचे है, जो ब्याज के RNAs का उपयोग करता संबद्ध RBPs की पहचान करने के लिए निर्णायक कार्यों और lncRNAs का तंत्र है, जो मानव कोशिकाओं में भूमिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला है की जांच के लिए एक प्रभावी और कुशल तकनीक है। आरएनए पुल से नीचे सहित आरएनए आधारित कब्जा, के भविष्य के विकास, घटकों, विधानसभा और आरएनए प्रोटीन परिसरों के समारोह को परिभाषित करने के लिए, साथ ही एमएस के लिए कम प्रचुर मात्रा में आरएनए प्रोटीन परिसरों से पर्याप्त RBPs पैदा करने के साथ चुनौतियों का सामना करने की जरूरत होगी।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की।

Acknowledgments

इस काम सिंगापुर एनआरएफ फैलोशिप (एनआरएफ-2011NRF-NRFF001-025) के साथ ही CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Major materials used in this study.
MEGAscript kit  Ambion
Biotin-14-CTP  Invitrogen
NucAway spin columns  Ambion
Dynabeads M-280 Streptavidin  Invitrogen
HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261)  Santa Cruz Biotechnology
Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005)  Santa Cruz Biotechnology
Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free)  HyClone
Phosphate Buffer Saline (1×PBS)  HyClone
RNase inhibitor  Bioline
Protease inhibitor  Sigma
Pfu Turbo DNA polymerase  Agilent Technologies
TRIsure  Bioline
Name Company Catalog Number Comments
Major equipment used in this study.
Sorvall Legend Micro 21R centrifuge  Thermo Scientific
Sorvall Legend X1R centrifuge  Thermo Scientific
Bio-Rad T100 thermal cycler  Bio-Rad
Nanodrop 2000  Thermo Scientific
BOECO rotator Multi Bio RS-24  BOECO,Germany
Protein gel electrophoresis and blotting apparatus  Bio-Rad
DynaMag-2 magnet  Life Technologies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huot, M. É, et al. The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis. Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).
  2. Sun, L., et al. Long noncoding RNAs regulate adipogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3387-3392 (2013).
  3. Engreitz, J. M., et al. The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X-chromosome. Science. 341 (6147), 1237973 (2013).
  4. Zhao, X. Y., Li, S., Wang, G. X., Yu, Q., Lin, J. D. A long noncoding RNA transcriptional regulatory circuit drives thermogenic adipocyte differentiation. Mol Cell. 55, 372-382 (2014).
  5. Alvarez-Dominguez, J. R., et al. De novo reconstruction of adipose tissue transcriptomes reveals long non-coding RNA regulators of brown adipocyte development. Cell Metab. 21, 764-776 (2015).
  6. Adams, D. J., Beveridge, D. J., van der Weyden, L., Mangs, H., Leedman, P. J., Morris, B. J. HADHB, HuR, and CP1 bind to the distal 3-untranslated region of human renin mRNA and differentially modulate renin expression. J Biol Chem. 278 (45), 44894-44903 (2003).
  7. Yeap, B. B., et al. Novel binding of HuR and poly(C)-binding protein to a conserved UC-rich motif within the 3´ untranslated region of the androgen receptor messenger RNA. J Biol Chem. 277, 27183-27192 (2002).
  8. König, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives. Nat Rev Genet. 13, 77-83 (2012).
  9. Ferrè, F., Colantoni, A., Helmer-Citterich, M. Revealing protein-lncRNA interaction. Briefings in Bioinformatics. , 1-11 (2015).
  10. McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15 (1), 203 (2014).
  11. Lee, Y. S., et al. AU-rich element-binding protein negatively regulates CCAAT enhancer binding protein mRNA stability during long term synaptic plasticity in Aplysia. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15520-15525 (2012).
  12. Hermann, M., Cermak, T., Voytas, D. F., Pelczar, P. Mouse genome engineering using designer nucleases. J Vis Exp. (86), (2014).
  13. Tsai, M. C., et al. Long Noncoding RNA as Modular Scaffold of Histone Modification Complexes. Science. 329 (5992), 689-693 (2010).
  14. Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505, 706-709 (2014).
  15. Li, H., et al. Identification of mRNA binding proteins that regulate the stability of LDL receptor mRNA through AU rich elements. J Lipid Res. 50 (5), 820-831 (2009).
  16. McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
  17. Chu, C., et al. Systematic Discovery of Xist RNA Binding Proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
  18. Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs. Nat Struct Mol Biol. 22 (1), 29-35 (2015).
  19. Zhao, J., et al. Genome-wide identification of Polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).

Tags

आण्विक जीवविज्ञान अंक 113 शाही सेना पुल से नीचे शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन वसाकोशिका noncoding कोडिंग

Erratum

Formal Correction: Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture
Posted by JoVE Editors on 08/20/2016. Citeable Link.

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

The author list has been updated from:

Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2

1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School

2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore

*These authors contributed equally

to:

Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2

1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School

2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore

3Division of Bioengineering, School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

*These authors contributed equally

द्वारा शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन का पता लगाने<em&gt; इन विट्रो</emवसाकोशिका संस्कृति में&gt; आरएनए पुल से नीचे
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bai, Q., Bai, Z., Xu, S., Sun, L.… More

Bai, Q., Bai, Z., Xu, S., Sun, L. Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture. J. Vis. Exp. (113), e54207, doi:10.3791/54207 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter