ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
En RNA neddragnings protokoll är optimerad här för detektion av växelverkan mellan RNA-bindande proteiner (RBP-anordningama) och icke-kodande samt kodande RNA. En RNA-fragment från androgenreceptorn (AR) användes som ett exempel för att visa hur man hämtar sin RBP från lystate av primära bruna adipocyter.
Abstract
RNA-bindande proteiner (RBP-anordningama) växer fram som en reglerande skikt i utveckling och funktion av fett. RBP-anordningama spelar en nyckelroll i genuttryck reglering på posttranskriptionell nivåer genom att påverka stabiliteten och translationell effektivitet mål mRNA. RNA rullgardins teknik har använts i stor utsträckning för att studera RNA-proteininteraktioner, som är nödvändiga för att klargöra mekanismen bakom RBP-anordningama "samt långa icke-kodande RNA (lncRNAs) funktion. Men den höga lipid överflöd i adipocyter utgör en teknisk utmaning i att genomföra detta experiment. Här en detaljerad RNA neddragnings protokoll är optimerad för primär adipocyt kultur. En RNA-fragment från androgenreceptorns (AR) 3 'otranslaterad region (3'UTR) innehållande en adenylat-uridylat rika elementwas används som ett exempel för att visa hur man hämtar sin RBP partner, Hur protein, från adipocyt lystate. Den metod som beskrivs här kan användas för att detektera interaktioner mellanRBP-anordningama och icke-kodande RNA, liksom mellan RBP-anordningama och kodande RNA.
Introduction
RBP-anordningama är proteiner som binder till dubbel- eller enkelsträngat RNA i celler och deltar vid bildning av RNA-proteinkomplex. RBP-anordningama kan binda en mängd av RNA-arter, inklusive mRNA och långa icke-kodande RNA (lncRNAs), och utöva sitt inflytande på posttranskriptionsnivåer. Både RBP-anordningama och lncRNAs växer fram som nya regulatorer i fett utveckling och funktion 1,2,3. För att förstå mekanismen för RBP- och lncRNA förmedlad reglering av cellulära vägar, är det ofta nödvändigt att detektera interaktionen mellan en specifik RNA-molekyl och en eller flera RBP-anordningama, och, ibland, för att identifiera det fulla spektrat av proteinpartner till en RNA avskrift. Däremot kan försöket vara en utmaning på grund av den höga halten av lipider i adipocyter. RNA neddragnings protokoll som beskrivs här kan användas för att hämta de proteinpartner för ett specifikt RNA från fettceller lysat av primära kulturer 4,5.
Skälet till detta protocol sammanfattas enligt följande. En RNA-bete är in vitro-transkriberat från en DNA-mall, biotinmärkt och konjugerad till streptavidinbelagda magnetiska pärlor 4. RNA bete inkuberas med cellulära lysat för att medge bildning av RNA-proteinkomplex, som därefter dras ned på en magnetiskt stativ. Närmare bestämt beskrev RNA rullgardinsprotokoll nedan använder en RNA-fragment från AR 3'UTR som bete för att hämta HuR protein, en allmänt uttryckt RBP bunden till 3'UTR av mRNA 6,7 från theadipocytelysate av primär kultur. För att testa bindningsspecificiteten av denna analys, är en icke-relevanta RNAas samt tomma streptavidinpärloma ingår som kontroll. Detta protokoll är kompatibelt med western blotting eller masspektrometri (MS) för att bekräfta att fånga en viss RBP eller för att identifiera hela repertoar av fångade RBP-anordningama, respektive 8.
Flera tekniker är tillgängliga för att studera RNA-proteininteraktions. Att avslöja RNA bundna av en viss RBP, RIP (RNA immunoprecipitation) och CLIP (UV tvärbindning och immunutfällning) kan tillämpas. I motsats, för att identifiera proteinpartner en given RNA, RNA rullgardins, kvitter (kromatin isolering av RNA-rening), kartlägger (infångningshybridisering analys av RNA-mål) och RAP (RNA antisense rening) kan tillämpas. I jämförelse med de senare, tar RNA rullgardins teknik mindre ansträngning för att ställa upp. Den kan användas för att fånga proteiner in vitro och in vivo. In vivo-metod av RNA rullgardins, som är tekniskt mer utmanande än dess in vitro motsvarighet, bevarar RNA-proteininteraktioner genom tvärbindning i celler, fångar aptamer-märkta RNA av intresse från celler, och därefter upptäcker bundna RBP-anordningama. RNA rullgardins kan användas för att berika låga rikliga RBP-anordningama, och för att isolera och identifiera RNA-proteinkomplex som har olika funktionella roller i reglering av cellulär reglering 9,10
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: RNA av intresse i samband med denna studie är ett fragment av AR 3'UTR.
1. Framställning av biotin-märkt RNA
- För att erhålla den RNA, amplifiera T7-AR-oligo med PCR, följt av in vitro transkription med användning av ett kommersiellt kit och följa tillverkarens instruktioner 11.
NOT: Primrar för PCR är listade i tabell 4: T7-AR-F och T7-AR-R. - För icke-specifik bindning kontroll, amplifiera en delsekvens av eldfluga luciferas (FL) DNA genom PCR från psiCHECK-2-plasmid, följt av in vitro transkription.
NOT: Primrar för PCR är listade i tabell 4: hluc (+) - T7-sond-F och hluc (+) - sond-R Tabell 4 Sekvenser av templat och primrar för PCR-amplifiering... - För en 50 pl PCR-reaktion, blanda 50 ng DNA (oligo eller plasmid), 4 pl dNTP (2,5 mM av varje enskild dNTP), 5 pl 10x reaktionsbuffert, 1 pl 2,5 U / & #181; l-DNA-polymeras, 2 | al 10 | iM framåtriktad primer, 2 | al 10 | iM bakåtriktad primer, och nukleasfritt vatten.
- Kör PCR-förstärkning i en termocykler med hjälp av följande program. Steg 1: en cykel av 95 ° C under 2 min; Steg 2: 35 cykler av 95 ° C under 30 sekunder, 55 ° C under 30 sek och 72 ° C under 30 sek (AR) eller 60 sek (FL); Steg 3: en cykel av 72 ° C under 10 min.
- Syntetisera biotinylerade RNA med användning av ett in vitro-transkription kit efter tillverkarens instruktioner 11. I detta experiment använda PCR-produkter som mallar för RNA-syntes. För en 20 pl in vitro transkriptionsreaktion, blanda 200 ng PCR amplifierat DNA, 2 pl av varje enskild NTP, 1 pl 10 mM biotin-CTP, 2 pl 10x reaktion buffert och 2 pl T7 RNA-polymeras. Inkubera blandningen vid 37 ° C under 4 h.
- Efter in vitro-transkription, behandla reaktionsblandningen med ett pl 2 U / | il DNas vid 37 & #176; C under 15 min för att bryta ned templat-DNA. Slutligen späds biotinylerat RNA till en total volym av 60 ul för efterföljande rening.
- Rena biotinylerade RNA för att avlägsna salter och ej inkorporerade nukleotider genom användning av reningskolonner följa tillverkarens instruktioner 12. Mäta RNA-koncentrationen och förvara vid -80 ° C för efterföljande pull-down-analyser.
- För att säkerställa korrekt sekundärstruktur för RNA av intresse i RNA-proteininteraktion, värme 50 | il biotinylerad RNA (50 pM) vid 90 ° C under 2 min, kyla på is under 2 minuter, därefter levererar med 50 | j, l 2x RNA struktur buffert (tabell 3), och möjliggöra för RNA-vikning vid RT i 30 min 13,14.
2. Framställning av RNA-konjugerade pärlor
OBS: Använd en magnetisk monter för separation av de magnetiska pärlorna och supernatanten.
- Resuspendera streptavidinbelagda magnetiska pärlor i originalflaskan med kort vortexing enlighet med tillverkarens instruktioner. Överför 150 l återsuspenderade pärlor till ett 1,5 ml rör. Placera röret på magneten under 1 minut. Släng supernatanten. Hålla pärlpelleten.
OBS: I RNA rullgardins analyser, när alikvotering resuspenderade pärlor från originalflaskan, använd 50 ^ pärlor för en analys följt av Western blotting, och 200 | il pärlor för en analys följt av MS. - Tvätta pärlorna en gång genom återsuspendering pärlpelleten med 1 ml av tillverkarens rekommenderade 1x W & B (bindande och tvättning) buffert (Tabell 3), följt av att det roteras under 5 minuter vid rumstemperatur i en rotator. Släng supernatanten. Hålla pärlpelleten.
- Att inaktivera RNas på kulor, tvätta pärlor två gånger, varje gång genom återsuspendering pärlpelleten med 400 | il buffert A. Buffert A är en alkalisk lösning innehållande 0,1 M NaOH och 0,05 M NaCl (tabell 3). Rotera röret under 2 minuter vid rumstemperatur i en rotator. Släng supernatanten. Hålla pärlpelleten. <li> För att ta bort NaOH från pärlor, tvätta pärlor två gånger, varje gång genom återsuspendering pärlpelleten med 400 | il buffert B (tabell 3), följt av att det roteras under 2 min vid rumstemperatur i en rotator. Släng supernatanten. Hålla pärlpelleten.
- Resuspendera pärla pellets med 300 pl 2x W & B-buffert, split pärlor lika och överför till tre 1,5 ml rör (100 pl pärlor per rör). Leverera pärlinnehållande rör med 100 pl RNas fritt vatten, 100 pl biotinylerad FL RNA och 100 pl biotinylerad AR 3'UTR RNA, respektive.
- Inkubera varje pärla blandningen under 1 h vid rumstemperatur med rotering. Placera rören på magneten under 1 minut. Kasta alla vätskan. Hålla bead pellets.
- Tvätta pärlorna två gånger, varje gång genom återsuspendering varje pärla pelleten med 400 | j, l 1 x W & B-buffert, följt av roterande rör i 5 minuter vid rumstemperatur i en rotator.
- Placera rören på magneten under 1 minut. Kasta alla vätskan. Resuspendera varje pärla pellet med 50 ^ kärnisoleringsbuffert (tabell 3).
3. preadipocyt Isolering och adipogenes Induktion
- Såsom beskrivits i tidigare publikationer 5, dissekera preadipocyter från interskapulära bruna fettkudden (C57BL6 möss av vildtyp, 3 veckor gamla).
- Växa och in vitro differentiera preadipocyter 5. Cellerna är redo för användning nedströms 4-5 dagar efter initiering av differentiering.
4. Framställning av cellysat från primära adipocyter
OBS! Se till alla förfaranden av cellysat beredningen görs på is, och alla buffertar kyldes på is. Pre-chill Dounce glas homogenisatorer på is.
- Växa och differentiera preadipocyter i 15 cm skålar 5 (se avsnitt 3.2). Varje maträtt ger tillräckliga celler för en RNA neddragningsanalys. På dag 4 eller dag 5 av differentiering, kassera cellodlingsmedium, och tvätta ceLLS gång med 1x PBS.
- Att skörda celler, tillsätt 10-15 ml 1 x PBS till cellerna, skrapa för att samla in celler i ett 50 ml rör, och pellets celler genom centrifugering vid 200 xg under 5 min vid RT. Kassera supernatanten med hjälp av en ml pipett.
- Resuspendera cellpelleten i 2 ml hypoton buffert (Tabell 3), och inkubera cellerna på is under 15 min. Överför celler till en 15 ml Dounce glashomogenisator och skjuvning celler mekaniskt på is med 20 slag.
- Pelletscellkärnor genom centrifugering vid 3300 xg under 15 min vid 4 ° C. Håll kärnor pellets på is för vidare användning (se avsnitt 4.6). Överför supernatanten till 1,5 ml rör, tillsätt 3M KCl till supernatanten till erhållande av en slutlig koncentration av 150 mM, och centrifugering vid 20.000 xg under 15 min vid 4 ° C.
- Efter centrifugering, försiktigt bort lipidlayeron toppen med hjälp av en ml pipett och samla supernatanten som cytoplasma cellysat.
- Resuspendera kärnor pelleten (se avsnitt 4.4) i 1 ml kärnisoleringsbuffert. Tverför kärnor till en 15 ml Dounce glashomogenisator med hjälp av en ml pipett och skjuvning kärnor mekaniskt på is med 100 slag. Pelle nukleär debris genom centrifugering vid 20.000 xg under 15 min vid 4 ° C, och samla supernatanten som den nukleära cellulära lysatet.
- Antingen kombinera de nukleära och cytoplasmiska cellulära lysat, eller använda varje fraktion separat, nedströms rullgardins ansökan. I denna demo experiment var dessa två fraktioner av cellysat kombineras vid ett volymförhållande av 1: 1.
- Lägg RNas-inhibitor till detta ofraktionerat cellysat för att erhålla en slutlig koncentration av 0,5 U / | il. Avsatt 100 il cellysat som styringång för western blotting 15.
5. Bindning och eluering av RBP
- Split cellysat i tre lika stora portioner (1 ml cellysat i en 1,5 ml rör), och inkubera med tom, FL RNA-konjugerad och AR 3'UTR RNA-konjugerade pärlor (se avsnitt 2.8), respektive under 3 h vid 4 ° Cmed rotation.
- Placera rören på magneten under 1 minut. Supernatanten med hjälp av en 1 ml pipett, följt av RNA-isolering från supernatanten för att bekräfta RNA fullständighet. Isolera RNA genom att använda en syra guanidiniumtiocyanat-fenol lösning efter tillverkarens instruktioner (Tabell 2). Bedöma RNA intactness genom att analysera 28S och 18S subenheter av ribosomalt RNA. Håll pärla pellets på is.
- Tvätta de magnetiska pärlorna sex gånger, varje gång genom återsuspendering varje pärla pellet med 1 ml kärnisoleringsbuffert innehållande 40 U RNas-inhibitor och 0,25% IGEPAL, följt av roterande rör i 2 minuter vid rumstemperatur i en rotator. Använda ett magnetiskt ställ för separation av de magnetiska pärlorna och supernatanten. Kasta alla vätskan. Håll pärla pellets på is.
- Använd följande steg för att eluera RNA-proteinkomplex från pärlor för western blotting. Först resuspendera varje pärla pelleten i 75 pl kärnisoleringsbuffert; Lägg sedan till 25 l 4x western blot lastning buffer (innehållande SDS) för att erhålla en total volym av 100 pl. Slutligen koka pärlor i denna 100 pl lösning vid 95 ° C under 5 min.
OBS: Använd följande steg för att eluera RNA-proteinkomplex från pärlor för MS. Steg 1: resuspendera varje pärla pelleten i 100 | j, l elueringsbuffert (Tabell 3); Steg 2: inkubera bead prover för 2-3 h vid rumstemperatur med rotation; Steg 3: centrifug och samla proteininnehållande supernatant; Steg 4: koncentrera proteinlösningar till 20-30 ul före inlämning för MS. - Centrifugera varje 100 pl bead provet vid 12.000 xg under 30 sek vid 4 ° C, och samla supernatanten. Alikvotera 15 ul supernatant för Western blot-analys (se avsnitt 6.1 och 6.2). Sondera resulterande membranet med den utspädda HuR mus monoklonal antikropp (1: 1000 utspädning), över natten.
6. Western blotting för Kontroll av RBP
- Separata RBP-anordningama genom SDS-PAGE med användning av standardtekniker.
- genomför viaktern blotting med användning av standardtekniker genom sondering för RBP-anordningama som är associerade med RNA av intresse.
OBS: I denna demo experiment HuR mus monoklonal antikropp som används för immundetektering till Hur protein. - Inkubera det resulterande membranet med det utspädda HuR antikropp (1: 1000 utspädning) i 5% vikt / volym fettfri torrmjölk, 1x TBS, 0,1% Tween - 20 vid fyra ° C med försiktig skakning, över natten. Tvätta membran tre gånger med 1x TBST. Inkubera membranet med den sekundära antikroppen (get-anti-mus-IgG-HRP) vid rumstemperatur under en timme. Tvätt membran. Utveckla och inspelningssignalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna demo experiment en AR RNA-fragment som används som bete för att fånga sitt bindande protein Hur. Både FL RNA bete som är icke-relevant till HuR protein och en portion av okonjugerade blank streptavidinpärloma tjänade som negativa kontroller. RNA-proteininteraktioner kan ske antingen i kärnan eller cytoplasman, och detta neddragnings protokoll kan tillämpas på antingen total eller fraktione (kärnkraft eller cytoplasmiska) cellysat. Analys av proteiner med Western blotting visar att urvalet av 15 pl ofraktionerat cellysat (se avsnitt 4.8), eftersom ingen pärla styringång, gav ett positivt resultat, vilket tyder på att HuR protein detekteras i fettceller lysat av mus primär kultur med hjälp av den monoklonala antikroppen. AR RNA elueringsfraktionen gav ett positivt resultat, vilket tyder på att HuR protein detekteras i fettceller lysat genom att använda AR RNA-konjugerade pärlor för RNA rullgardins analys. Både FL RNA elueringsfraktionen och bstripigt pärla prov gav negativt resultat, vilket tyder på att icke-specifika interaktioner mellan FL RNA-fragment och Hur protein, liksom mellan de tomma pärlor och Hur protein inte påvisas av detta RNA pull-down-strategi. Resultaten av dessa två negativa kontroller indikerar också att en specifik interaktion mellan AR RNA-fragment och HuR protein framgångsrikt detekteras av RNA-neddragnings protokoll som beskrivs här.
Figur 1: Western Blot Kontroll till Hur Fångad av RNA neddragnings Analyser Input: rekonstituerade cellysat (cytoplasma + kärn lysat);. Pärlor: provet från tomma streptavidinbelagda magnetiska pärlor; FL-RNA: streptavidinpärloma bundna med FL-mRNA; AR 3'UTR RNA: streptavidinpärloma bundna med AR 3'UTR mRNA; Primär antikropp: HuR musmonoklonal antikropp; Sekundär antikropp: get-anti-mouse IgG-HRP; Förkortning, FL: eldflugeluciferas, AR: androgenreceptorn, Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Centrifug |
| termocykler |
| spektrofotometer |
| rotator |
| Protein gelelektrofores och blotting apparat |
| Magnet |
Tabell 1: Större utrustning som används i denna studie Större utrustning som används i denna studie..
| In vitro transkription kit |
| biotinylerat RNA |
| Spin kolumnen för återvinning av DNA och RNA-fragment |
| Streptavidin magnetiska pärlor |
| HuR monoklonal musantikropp |
| Get-anti-mus-IgG-HRP |
| Nukleasfritt molekylärbiologi kvalitet vatten |
| Fosfatbuffrad saltlösning |
| RNas-inhibitor |
| proteashämmare |
| Pfu-DNA-polymeras |
| Syra guanidiniumtiocyanat-fenollösning |
Tabell 2: Major reagens som används i denna studie Större reagens som används i denna studie..
| 2x RNA struktur buffert |
| 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) |
| 0,2 M KCl | 20 mM MgCl2 |
| 2 mM DTT |
| 0,8 U / | il RNas-inhibitor |
| buffert A |
| 0,1 M NaOH |
| 0,05 M NaCl |
| buffert B |
| 0,1 M NaCl |
| 1x W & B (Bindning och tvättning) buffert |
| 5 mM Tris-HCl (pH 7,4) |
| 1 M NaCl |
| 1x hypoton buffert |
| 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) |
| 10 mM KCl |
| 2 mM MgCl2 |
| 1 mM DTT |
| 1 mM PMSF |
| 1x proteashämmare |
| 1x Nuclear isoleringsbuffert |
| 25 mM Tris-HCl (pH 7,4) |
| 150 mM KCl |
| 2 mM MgCl2 |
| 1 mM DTT |
| 0,5% IGEPAL (eller 0,25% IGEPAL för eluering av RBP-anordningama) |
| 1 mM PMSF |
| 1x proteashämmare |
| 0,4 U / ul RNas-inhibitor (eller 40 U / ml RNas-inhibitor för eluering av RBP-anordningama) |
| 1x Elueringsbuffert |
| 2 mM biotin i 1 x PBS |
. Tabell 3: Stora lösningar används i denna studie 2x RNA struktur buffert (se avsnitt 1.7); Buffert A (se avsnitt 2.3); Buffert B (se avsnitt 2.4); 1x W & B (Bindning och tvättning) buffert (se avsnitt 2.2, 2.5, 2.7); 1x hypoton buffert (se avsnitt 4.3); 1x Nuclear isoleringsbuffert (se avsnitt 2.8, 4.6, 5.3, 5.4); 1x elueringsbuffert (se OBS följande avsnitt 5.4).
lways ">Tabell 4: Sekvenser av mall och primers för PCR-amplifiering T7-AR-oligo. DNA-mall för PCR-amplifiering (se avsnitt 10,1); T7-AR-F: framåt primer för PCR-amplifiering (se avsnitt 1.1); T7-AR-R: omvänd primer för PCR-amplifiering (se avsnitt 1.1); hluc (+) - T7-probe-F: framåt primer för PCR-amplifiering (se avsnitt 1.2); hluc (+) - sond-R: omvänd primer för PCR-amplifiering (se avsnitt 1.2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
lncRNAs och RBP-anordningama har viktiga roller i hälsa och sjukdom, men de molekylära mekanismerna bakom dessa molekyler är dåligt kända. Identifiering av proteiner som interagerar med lncRNA molekyler är ett viktigt steg mot att belysa de regleringsmekanismer. Anrikning av RBP-anordningama av RNA-neddragningsanalyssystem är baserat på in-lösning infångning av växelverkande komplex så att proteiner från ett cellysat kan selektivt extraheras med användning av biotinylerade RNA-lockbete bundna till streptavidin magnetiska pärlor. Flera andra metoder såsom kvitter, diagram och RAP kan uppnå samma mål, men dessa metoder tar mer ansträngning att installera än RNA rullgardins teknik 16,17,18.
Den huvudsakliga styrkan av RNA neddragnings är att det är relativt ett enkelt protokoll och lätt att utföra. Både CHIRP och RAP involverar ett tvärbindningssteg som bevarar naturligt förekommande RNA-proteinkomplex, och konstruktionen av en full uppsättning av antisens-oligonukleotider (90 nucleotides länge i RAP, och 20 nukleotider lång i Chirp) kakel hela RNA 16,17,18. RNA vikning är ett kritiskt steg i RNA rullgardins analyser. Den största begränsningen av detta protokoll är att mål-RNA syntetiseras in vitro och kan inte vara korrekt vikas in nativa strukturen för att möjliggöra ordentlig bindning med sin RBP (s). Felveckade främmande RNA kan antingen misslyckas med att bilda RNA-proteininteraktioner och ogiltigförklara funktionella analyser eller formulär interaktioner som endast förekommer in vitro under icke fysiologiska förhållanden. Även rullgardins protokoll som beskrivs här antagit en välkänd procedur för RNA vikning 13,14 (se avsnitt 1.7), det garanterar inte korrekt veckning för andra RNA-transkript.
RNA neddragnings är ofta kopplade till RIP som ett komplement för att detektera RNA (s) bunden av RBP av intresse 19. En annan avgörande steg i detta protokoll är att avlägsna lipid fraktion från total celllysat (se avsnitt 4.5) eftersom den höga lipid överflöd i mogna adipocyter utgör en stor teknisk utmaning. Protokollet som beskrivs här är särskilt utvecklad för användning med adipocyter. Däremot kan de grundläggande komponenterna i detta protokoll och stringensen av alla buffertar som används ändras och anpassas för applicering på andra cellodlingsmodeller. För vävnader som har höga nivåer av endogen RNas kan olika RNA rullgardinsprotokoll tillämpas.
RNA rullgardins, som använder RNA av intresse för att identifiera de associerade RBP-anordningama, är en effektiv och effektiv teknik för att sondera de svängbara funktioner och mekanismer lncRNAs, som har ett brett spektrum av roller i mänskliga celler. Framtida utveckling av RNA-baserade fånga, inklusive RNA rullgardins kommer att krävas för att ta itu med utmaningarna med att definiera komponenter, montering och funktion av RNA-proteinkomplex, samt generera tillräckliga RBP-anordningama från låga rikliga RNA-proteinkomplex för MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av Singapore NRF gemenskap (NRF-2011NRF-NRFF001-025) samt CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Major materials used in this study. | |||
| MEGAscript kit | Ambion | ||
| Biotin-14-CTP | Invitrogen | ||
| NucAway spin columns | Ambion | ||
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | ||
| HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261) | Santa Cruz Biotechnology | ||
| Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005) | Santa Cruz Biotechnology | ||
| Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free) | HyClone | ||
| Phosphate Buffer Saline (1×PBS) | HyClone | ||
| RNase inhibitor | Bioline | ||
| Protease inhibitor | Sigma | ||
| Pfu Turbo DNA polymerase | Agilent Technologies | ||
| TRIsure | Bioline | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Major equipment used in this study. | |||
| Sorvall Legend Micro 21R centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Sorvall Legend X1R centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Bio-Rad T100 thermal cycler | Bio-Rad | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| BOECO rotator Multi Bio RS-24 | BOECO,Germany | ||
| Protein gel electrophoresis and blotting apparatus | Bio-Rad | ||
| DynaMag-2 magnet | Life Technologies |
References
- Huot, M. É, et al. The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis. Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).
- Sun, L., et al. Long noncoding RNAs regulate adipogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3387-3392 (2013).
- Engreitz, J. M., et al. The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X-chromosome. Science. 341 (6147), 1237973 (2013).
- Zhao, X. Y., Li, S., Wang, G. X., Yu, Q., Lin, J. D. A long noncoding RNA transcriptional regulatory circuit drives thermogenic adipocyte differentiation. Mol Cell. 55, 372-382 (2014).
- Alvarez-Dominguez, J. R., et al. De novo reconstruction of adipose tissue transcriptomes reveals long non-coding RNA regulators of brown adipocyte development. Cell Metab. 21, 764-776 (2015).
- Adams, D. J., Beveridge, D. J., van der Weyden, L., Mangs, H., Leedman, P. J., Morris, B. J. HADHB, HuR, and CP1 bind to the distal 3-untranslated region of human renin mRNA and differentially modulate renin expression. J Biol Chem. 278 (45), 44894-44903 (2003).
- Yeap, B. B., et al. Novel binding of HuR and poly(C)-binding protein to a conserved UC-rich motif within the 3´ untranslated region of the androgen receptor messenger RNA. J Biol Chem. 277, 27183-27192 (2002).
- König, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives. Nat Rev Genet. 13, 77-83 (2012).
- Ferrè, F., Colantoni, A., Helmer-Citterich, M.
- McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15 (1), 203 (2014).
- Lee, Y. S., et al. AU-rich element-binding protein negatively regulates CCAAT enhancer binding protein mRNA stability during long term synaptic plasticity in Aplysia. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15520-15525 (2012).
- Hermann, M., Cermak, T., Voytas, D. F., Pelczar, P. Mouse genome engineering using designer nucleases. J Vis Exp. (86), (2014).
- Tsai, M. C., et al. Long Noncoding RNA as Modular Scaffold of Histone Modification Complexes. Science. 329 (5992), 689-693 (2010).
- Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505, 706-709 (2014).
- Li, H., et al. Identification of mRNA binding proteins that regulate the stability of LDL receptor mRNA through AU rich elements. J Lipid Res. 50 (5), 820-831 (2009).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
- Chu, C., et al. Systematic Discovery of Xist RNA Binding Proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs. Nat Struct Mol Biol. 22 (1), 29-35 (2015).
- Zhao, J., et al. Genome-wide identification of Polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).
Tags
Molecular Biology RNA pull-down RNA-bindande protein fettceller icke-kodande kodningErratum
Formal Correction: Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture
Posted by JoVE Editors on 08/20/2016.
Citeable Link.
A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.
The author list has been updated from:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
*These authors contributed equally
to:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
3Division of Bioengineering, School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
*These authors contributed equally
