Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

RNA bağlama proteinlerinin tespiti ile Published: July 22, 2016 doi: 10.3791/54207
Automatic Translation
*1, *1, 3, 1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School, 2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore, 3Division of Bioengineering, School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Bir RNA açılan protokolü RNA bağlayıcı proteinlere (RBPS) ve kodlama yapmayan ve kodlama RNA arasındaki etkileşimin saptanması için optimize edilmiştir. androjen reseptörü (AR) için bir RNA fragmanı primer kahverengi adipositlerin lystate onun RBP almak için nasıl kullanılacağını göstermek için bir örnek olarak kullanılmıştır.

Abstract

RNA bağlayıcı proteinler (RBPS) adipoz gelişiminde ve fonksiyonunda bir düzenleyici bir tabaka olarak ortaya çıkmaktadır. RBPS, hedef mRNA stabilitesi ve dönüşüm etkinliğini etkileyerek transkripsiyon sonrası seviyelerde gen ifadesinin düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır. RNA açılan tekniği yaygın mekanizmasının RBPS 'hem de uzun kodlayıcı olmayan RNA'lar' (lncRNAs) işlevini yatan aydınlatmak için gerekli olan RNA-protein etkileşimlerini incelemek için kullanılmıştır. Ancak, adipositlerde yüksek lipid bolluk bu deneyi yapan bir teknik sorun teşkil etmektedir. İşte detaylı RNA açılan protokol birincil adiposit kültürü için optimize edilmiştir. androjen reseptörün (AR) 3 'çevrilmemiş bölge adiposit lystate gelen, onun RBP ortağı Hür proteini almak nasıl göstermek için bir örnek olarak kullanılan bir adenilat-üridilat zengin elementwas içeren (3'UTR) bir RNA fragmanı. Burada tarif edilen yöntem ile etkileşimini tespit etmek için uygulanabilirRBPS ve kodlayıcı olmayan RNA'lar, hem de arasındaki RBPS ve kodlama RNA.

Introduction

RBPS hücrelerde, tek veya çift sarmallı RNA bağlanan ve RNA-protein komplekslerinin oluşturulması katılmak proteinlerdir. RBPS mRNA ve uzun kodlamayan RNA'lar (lncRNAs) de dahil olmak üzere RNA türlerinin, çeşitli bağlamak, ve post-transkripsiyonel seviyede nüfuzlarını olabilir. Hem RBPS ve lncRNAs adipoz geliştirme gibi yeni regülatörleri ortaya çıkan ve 1,2,3 işlev görmektedir. özel bir RNA molekülü ve bir ya da daha RBPS arasındaki etkileşimi saptamak için çoğu zaman gerekli olan, RBP- mekanizmasını ve hücresel yolların lncRNA-aracılı düzenlenmesinin anlamak için, ve bazen de bir RNA protein ortakları tam spektrum tespit etmek transkript. Ancak, deneme nedeniyle adipositlerdeki lipidlerin içeriği yüksek zor olabilir. Burada tarif edilen RNA açılan protokolü primer kültürlerinde 4,5 arasında adiposit lisatlanndan özel bir RNA protein ortakları almak için de kullanılabilir.

Bu proto Gerekçesişöyle col özetlenmiştir. Bir RNA yem, bir DNA şablonu in vivo transkribe olan, biyotin-etiketli streptavidin kaplı manyetik boncuklar 4 ve konjuge. RNA, yem, daha sonra, bir manyetik stand aşağı çekilir RNA-protein kompleksleri oluşumuna olanak sağlamak için hücresel lizatları ile inkübe edilir. Daha spesifik olarak, RNA açılan protokolü aşağıda açıklanan HÜR proteini, birincil kültür theadipocytelysate gelen mRNA 6,7 3'UTR'sinden bağlı bir evrensel ifade RBP almak için yem olarak AR 3'UTR'sinden bir RNA parçası kullanın. Bu deneyde bağlanma spesifitesini test etmek için, uygun olmayan bir RNAas da boş streptavidin boncuk kontrol olarak dahil edilir. Bu protokol belirli RBP yakalama teyit etmek veya çekilen RBPS sırasıyla 8 tam repertuarını tespit etmek western blotting ya da kütle spektrofotometresi (MS) ile uyumludur.

Çeşitli teknikler RNA-protein etkileşimi incelemek için kullanılabilirs. Belirli bir RBP, RIP (RNA immünopresipitasyon) ve CLIP (UV çapraz ve immünopresipitasyon) bağlı RNA'lar ortaya çıkarmak için uygulanabilir. Buna karşılık, belirli bir RNA protein ortakları belirlemek için, RNA açılır, cıvıltı (RNA saflaştırma ile kromatin izolasyon), ABC (RNA hedeflerinin yakalanması hibridizasyon analizi) ve RAP (RNA antisens arıtma) uygulanabilir. Daha sonra olanlar ile karşılaştırıldığında, RNA açılan teknik kurmak için daha az çaba gerektirir. In vitro ve in vivo proteinler yakalamak için kullanılabilir. Onun in vitro meslektaşı daha teknik olarak daha zor RNA pull, in vivo yaklaşım hücrelerinde çapraz bağlama RNA-protein etkileşimleri korur, hücrelerin ilgi aptamer-etiketli RNA'lar yakalar ve daha sonra bağlı RBPS algılar. RNA açılan düşük bol RBPS ettirecek ve izole edilmesi ve hücresel düzenleme 9,10 kontrol farklı fonksiyonel rolleri var RNA-protein kompleksleri tespit etmek için kullanılabilir

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: Bu çalışma kapsamında ilgi RNA AR 3'UTR'sinden bir parçasıdır.

Biotin-etiketli RNA hazırlanması 1.

  1. RNA elde edilmesi için, bir ticari kit kullanılarak ve imalatçının talimatları 11, aşağıdaki in vitro transkripsiyon ve ardından, PCR ile, T7-ar-oligo, yükseltmek.
    Not: PCR primerleri, Tablo 4'te listelenmiştir: T7-AR-F ve T7-AR-R.
  2. Spesifik olmayan bağlanma kontrol için, in vitro transkripsiyon ve ardından psiCHECK-2 plasmidinden PCR ile ateşböceği lusiferaz (FL) DNA, bir kısmi sekansını yükseltmek.
    Not: PCR primerleri, Tablo 4'te listelenmiştir: hluc (+) - T7-prob F hluc (+) - sonda-R, Tablo 4 PCR amplifikasyonu için şablon ve primer dizileri...
  3. 50 | il PCR reaksiyonu için 50 ng DNA (oligo veya plazmit), 4 ul dNTP (her bir dNTP 2.5 mM), 5 ul 10x reaksiyon tamponu, 1 ul 2.5 U / ve karışım #181 L DNA polimeraz, 2 ul 10 uM ileri primer, 2 ul 10 uM ters primeri ve nükleaz içermeyen su.
    1. Aşağıdaki programı kullanılarak, bir termal döngü PCR amplifikasyonu çalıştırın. Adım 1: 2 dakika süreyle 95 ° C'lik bir döngü; Adım 2: 30 saniye 95 ° C 35 döngü, 30 saniye için 55 ° C ve 30 sn (AR) ya da 60 saniye (FL) 72 ° C; Adım 3: 10 dakika boyunca 72 ° C'lik bir döngü.
  4. Imalatçının talimatlarına 11 uygulanarak, bir in vitro kopyalama kiti kullanılarak biyotinile edilmiş RNA'ları sentez. Bu deneyde, RNA sentezi için şablon olarak PCR ürünleri kullanır. 20 ul in vitro transkripsiyon reaksiyonu için, 200 ng PCR ile çoğaltılan DNA, her bir NTP 2 ul, 1 ul 10 mM biyotin-CTP 2 ul 10x reaksiyon tamponu ve 2 ul T7 RNA polimeraz karışımı. 4 saat 37 ° C'de inkübe karışımı.
  5. 37 & # de in vitro olarak transkripsiyonu, 1 ul 2 U / ml DNaz ile muamele reaksiyon karışımının aşağıdakı176 C 15 dk şablon DNA aşağılamak için. Son olarak, daha fazla saflaştınlmadan 60 ul bir toplam hacme biyo-küçültülmüş RNA seyreltin.
  6. Imalatçının talimatlarına 12 Aşağıdaki saflaştırma sütunu kullanarak tuzlarını ve nükleotidleri gidermek için biyotinile edilmiş RNA'ları saflaştınlır. daha sonra açılır deneyleri için -80 ° C'de RNA konsantrasyonu ve mağaza ölçün.
  7. 2 dakika, 2 dakika boyunca buzda 90 ° C'de RNA-protein etkileşimi, ısı 50 ul biyotinile edilmiş RNA (50 pM) daki RNA için uygun sekonder yapısını sağlamak için, daha sonra 50 ul 2x RNA yapısı tamponu (Tablo sahip kaynağı 3), ve 30 dakika 13,14 oda sıcaklığında katlama RNA için izin verir.

RNA eşlenik boncuklar 2. hazırlanması

Not: manyetik boncuklar ve süpernatan ayrılması için manyetik bir stand kullanın.

  1. Kısaca vorte orijinal şişede streptavidin kaplı manyetik boncuklar süspanseXING üreticisinin yönergeleri izleyerek. 1.5 ml tüp boncuk yeniden süspansiyon haline getirildi, 150 ul aktarın. 1 dakika boyunca mıknatıs tüp yerleştirin. Süpernatantı atın. boncuk pelet tutun.
    Not: RNA açılan deneylerinde orijinal şişeden yeniden süspansiyon haline boncuk aliquoting olduğunda, MS, ardından bir deneyde Western blotting ile ve ardından bir deneyde 50 ul boncuk ve 200 ul boncuk kullanır.
  2. Yeniden süspansiyon üreticinin tavsiye 1x W ve B için 1 ml boncuk pelet (bağlanma ve yıkama) tampon maddesi (Tablo 3) bir kez boncuk yıkayın, bir rotatör içine oda sıcaklığında 5 dakika boyunca tüpün döndürülmesi takip etmektedir. Süpernatantı atın. boncuk pelet tutun.
  3. 400 ul tampon A Tampon A ile topuk kısmı pelet yeniden süspansiyon haline getirilerek, her boncuk ilgili RNAaz ari inaktive iki boncuk yıkamak için 0.1 M NaOH ve 0.05 M NaCl (Tablo 3) ihtiva eden bir alkali bir çözümdür. rotator oda sıcaklığında 2 dakika boyunca bir tüp döndürün. Süpernatantı atın. boncuk pelet tutun.
    4. <li> rotator oda sıcaklığında 2 dakika için tüpün döndürülmesi ve ardından yeniden süspansiyon 400 ul tampon B ile boncuk pelet (Tablo 3) ile iki kez, boncuk yıkama boncuklardan her NaOH kaldırın. Süpernatantı atın. boncuk pelet tutun.
  4. 300 ul 2x W & B tamponu ile süspanse boncuk pelet, split boncuk eşit ve üç 1.5 ml tüpler (tüp başına 100 ul boncuklar) içine aktarın. 100 ul RNaz ücretsiz su ile boncuk içeren tüpler kaynağı 100 ul FL RNA ve sırasıyla AR 3'UTR RNA biyotinile 100 ul biyotinile.
  5. dönüşü ile, oda sıcaklığında 1 saat boyunca, her boncuk karışımı inkübe edin. 1 dakika boyunca mıknatıs üzerinde tüpler yerleştirin. tüm süpernatant atın. boncuk pelet tutun.
  6. 400 ul 1 x W & B tamponu ile her kordon pelet yeniden süspansiyon haline getirilerek, iki kez her seferinde boncuk yıkayın, bir rotatör içine oda sıcaklığında 5 dakika boyunca tüpler döner eklenmiştir.
  7. 1 dakika boyunca mıknatıs üzerinde tüpler yerleştirin. tüm süpernatant atın. her kordon Pelle yeniden süspanse50 ul çekirdek yalıtım tamponu (Tablo 3) T.

3. Preadibosit İzolasyon ve adipogenesis İndüksiyon

  1. Önceki yayınlarda 5'te tarif edildiği gibi, interskapular kahverengi yağ pedi Preadipositler (C57BL6 vahşi tip fare, 3 haftalık) keser.
  2. Büyümek ve in vitro preadipositlerden 5 ayırt. Hücreler 4-5 gün farklılaşma başlandıktan sonra aşağı uygulama için hazır.

Birincil adipositlerden Hücresel lizat 4. hazırlanması

NOT: Hücre lizatı hazırlık tüm işlemleri emin olun buz üzerinde yapılır ve tüm tamponlar buz üzerinde soğutulmuş edilir. buz üzerinde önceden soğuk Dounce cam homojenizatörler.

  1. Büyümek ve 15 cm yemekleri 5 (bakınız bölüm 3.2) 'de preadipositlerden ayırt. Her yemeğin bir RNA açılan tahlil için yeterli hücreleri sağlar. günde 4 veya farklılaşması, ıskarta hücre kültür ortamının 5 gün ve yıkama CEbir zamanlar 1x PBS ile LLS.
  2. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj ile 50 ml'lik bir tüp içinde hücreleri ve pelet hücreleri toplamak için kazıma, hücreler hasat hücrelere 10-15 mi 1x PBS ekleyin. 1 ml pipet kullanarak süpernatant atın.
  3. Tekrar süspansiyon hücre 2 ml pelet hipotonik tampon maddesi (Tablo 3), ve 15 dakika süreyle buz üzerinde hücrelerin inkübe. Transferi 15 ml Dounce cam homojenizatör hücreleri ve mekanik buz üzerinde 20 vuruş ile kesme hücreleri.
  4. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 3300 x g'de santrifüjleme ile pellet hücre çekirdekleri. ileride kullanılmak üzere buz üzerinde çekirdekleri pelet tutmak (bölüm 4.6). 1.5 ml tüpler süpernatantı aktarın, 4 ° C'de 15 dakika boyunca 20,000 x g'de bir son 150 mM konsantrasyonuna ve spin elde etmek üzere süpernatana 3M KCI ekleyin.
  5. santrifüj sonrasında, dikkatli 1 ml pipet kullanarak üst lipidlayeron kaldırmak ve sitoplazmik hücresel lizat olarak supernatant toplamak.
  6. çekirdek pelletini 1 ml nükleer izolasyon tamponunda (bakınız bölüm 4.4). Transfer 1 ml pipet kullanarak 15 ml Dounce cam homojenizatör çekirdekler ve mekanik 100 vuruş ile buz üzerinde kayma çekirdekler. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 20,000 x g'de santrifüj ile nükleer yıkıntıları pelet haline ve nükleer hücre lizatı olarak supernatant toplamak.
  7. Ya nükleer ve sitoplazmik hücresel lizatları birleştirmek, ya da aşağı açılan uygulama için, ayrı ayrı fraksiyonu kullanın. Bu tanıtım deneyde, hücre lizatı, bu iki fraksiyon 1 bir hacim oranında birleştirildi: 1 arasındadır.
  8. 0.5 U / ul son konsantrasyon elde etmek için, bu bölünmemiş hücre lizatı RNaz önleyici. Batı lekeleme için 15 giriş kontrol olarak hücre lizatının bir kenara 100 ul ayarlayın.

5. Bağlayıcı ve RBP elüsyonu

  1. Bölünmüş hücre, üç eşit kısma lisatı (1.5 ml bir tüp içinde 1 ml hücre lisatı) ve boş bir kuluçkalanması, FL RNA konjüge ve AR 3'UTR RNA eşlenik boncuklar 4 ° 'de 3 saat boyunca, sırası ile, (bakınız bölüm 2.8) Cdönüşü ile.
  2. 1 dakika boyunca mıknatıs üzerinde tüpler yerleştirin. RNA bütünselliği onaylamak için süpernatanından RNA izolasyonu, ardından 1 ml pipet kullanılarak süpernatan toplamak. Üreticinin talimatlarına (Tablo 2), aşağıdaki bir asit guanidinyum tiosianat-fenol solüsyonu kullanılarak RNA izole edin. ribozomal RNA 28S ve 18S alt birimleri analiz ederek RNA Bozulmamışlık değerlendirin. buz üzerinde boncuk pelet tutun.
  3. rotator oda sıcaklığında 2 dakika için tüpler döner ve ardından 40 U RNaz inhibitör ve% 0.25 IGEPAL içeren 1 mi, nükleer yalıtım tamponu her kordon topağın tekrar askıda bırakılmasıyla manyetik boncuk altı kez, her seferinde yıkayın. manyetik boncuklar ve süpernatan ayrılması için manyetik bir stand kullanın. tüm süpernatant atın. buz üzerinde boncuk pelet tutun.
  4. Western blotting için boncuklardan RNA-protein kompleksleri elüte etmek için aşağıdaki adımları kullanın. İlk olarak, 75 ul nükleer izolasyon tamponunda her boncuk pelet; Daha sonra, 25 ul 4x western blot yükleme buf eklemekfer (SDS içeren) 100 ul toplam hacim elde edilmiştir. Son olarak, 5 dakika boyunca 95 ° C 'de, bu 100 ul çözelti içinde boncuk kaynatın.
    NOT: adımları MS için boncuk RNA-protein kompleksleri Zehir için aşağıdaki. Adım 1: 100 ul elüsyon tamponu (Tablo 3), her topuk kısmı pelet; Adım 2: rotasyon ile oda sıcaklığında 2-3 saat süreyle boncuk örnekleri inkübe; Adım 3: santrifüjden sonra protein ihtiva eden süpernatan toplamak; Adım 4: MS için sunulmadan önce 20-30 ul protein çözümleri konsantre.
  5. Santrifüj, her 100, 4 ° C'de 30 saniye boyunca 12,000 x g'de boncuk örnek ul ve supernatant toplanır. western blot analizi (Bölüm 6.1 ve 6.2) için Kısım 15 ul süpernatant. gece boyunca, (1000 sulandırma 1) ile seyreltildi Hur fare monoklonal antikoru ile elde edilen membran kontrol edin.

RBP doğrulanması için 6. Western Blot

  1. standart teknikler kullanılarak, SDS-PAGE ile ayrı RBPS.
  2. biz Davranışkıç ilgi RNA ile ilişkili RBPS için sondalama tarafından standart teknikler kullanılarak kurutma.
    NOT: Bu demo deneyde, Hür fare monoklonal antikoru Hur proteininin İmmuno için kullanılmıştır.
  3. seyreltilmiş Hür antikor ile sonuçlanan membran inkübe: a / h yağsız süt, 1x TBS% 5 (1 1,000 seyreltme), % 0.1 Tween - 20 4 at Gecede, nazik sallayarak ° C. 1x TBST ile membran üç kez yıkayın. 1 saat süre ile oda sıcaklığında (anti-fare IgG-HRP işaretli keçi) ikincil antikor ile membran inkübe edin. Yıkama membran. Geliştirmek ve kayıt sinyali.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu tanıtım deneyde, AR RNA fragmanı kendi bağlanma proteini Hur yakalamak için yem olarak kullanılmıştır. Hem Hur proteinine ilgili olmayan bir FL RNA yem ve konjüge edilmemiş boş streptavidin boncuk bir alikosu negatif kontrol olarak görev yapmıştır. RNA-protein etkileşimleri çekirdek veya sitoplazmada ya da oluşabilir ve bu açılan protokolü total veya parçalanmış (nükleer ve sitoplazmik) hücre lizatlarında, ya da uygulanabilir. Western blotting ile proteinlerin analizi 15 ul bölünmemiş hücre lizatının örneği Resim boncuk giriş kontrol olarak Hur proteini kullanılarak fare primer kültürünün adiposit lizatı tespit belirten olumlu sonuç verdi, (bölüm 4.8) göstermektedir monoklonal antikor. AR RNA elüsyon fraksiyonu Hur protein, RNA açılan tahlil için AR RNA-konjuge boncuk kullanılarak adiposit lizat tespit belirten olumlu sonuç verdi. FL RNA elüsyon fraksiyonu b Hemsıska boncuk örneği de boş boncuk ve Hur proteini arasında olduğu gibi, FL RNA fragmanı ve Hur proteini arasındaki non-spesifik etkileşimler belirten bu RNA açılan yaklaşımla algılanamaz, olumsuz sonuçlar verdi. Bu iki negatif kontrol sonuçları da AR RNA fragmanı ve Hur protein arasında bir spesifik etkileşim başarılı burada açıklanan RNA açılan protokolü tarafından tespit edilir olduğunu göstermektedir.

Şekil 1
Şekil 1: Hur Western Blot Doğrulama RNA Pull-down Tahliller Yakalanan Girdi: sulandırılmış hücre lizatı (sitoplazmik + nükleer lizat);. Boncuk: Boş streptavidin kaplı manyetik boncuklar örnek; FL RNA: FL mRNA ile bağlı streptavidin boncuklar; AR 3'UTR RNA: AR 3'UTR mRNA ile bağlı streptavidin boncuklar; Birincil antikor Hur fare monoklonal antikoru; İkincil antikor keçi antiIgG-HRP -fare; Kısaltma, FL: ateşböceği lusiferaz, AR: androjen reseptörü; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Santrifüj
termal cycler
spektrofotometre
döndürücü
Protein jel elektroforezi ve lekeleme aparatı
Mıknatıs

Tablo 1: Bu Çalışmasında Kullanılan Önemli Ekipman Bu çalışmada kullanılan başlıca ekipman..

Vitro transkripsiyon kiti içinde
biyo-küçültülmüş RNA
DNA ve RNA fragmanlarının geri kazanımı için sütun Spin
Streptavidin manyetik taneleri
Hür fare monoklonal antikoru
Keçi anti-fare IgG-HRP
Nukleazsız moleküler biyoloji sınıf su
Fosfat tamponlu salin
RNaz inhibitör
Proteaz inhibitörü
Pfu DNA polimeraz
Asit guanidinyum tiosianat-fenol çözeltisi

Tablo 2: Bu Çalışmasında Kullanılan başlıca Reaktifler Bu çalışmada kullanılan başlıca reaktif..

<tr>
2x RNA yapısı tampon
20 mM Tris-HCl (pH 7.4)
0.2 M KCI
20 mM MgCI2
2 mM DTT
0.8 U / ul RNaz inhibitör
Tampon A
0.1 M NaOH
0.05 M NaCI
tampon B
0.1 M NaCl
1x W & B (Binding ve Yıkama) tamponu
5 mM Tris-HCl (pH 7.4)
1 M NaCl
1x hipotonik tampon
10 mM Tris-HCI (pH 7.4)
10 mM KCI
2 mM MgCl2
1 mM DTT
1mM PMSF
1x proteaz inhibitörü
1x Nükleer izolasyonu tampon
25 mM Tris-HCl (pH 7.4)
150 mM KCI
2 mM MgCl2
1 mM DTT
% 0.5 IGEPAL (ya da% 0.25 RBPS edilene benzer şekilde, IGEPAL)
1mM PMSF
1x proteaz inhibitörü
0.4 U / ul RNaz inhibitörü (ya da 40 U / ml RNaz inhibitör RBPS edilene benzer şekilde,),
1x Elüsyon tamponu
1x PBS içinde 2 mM biyotin

. Tablo 3: Bu Çalışmasında Kullanılan başlıca Çözümler 2x RNA yapısı tamponu (bölüm 1.7 bakınız); A (bkz bölüm 2.3) tampon; Tampon B (Bölüm 2.4'e bakınız); 1x W & B (Binding ve Yıkama) tamponu (bölümler 2.2, 2.5, 2.7 bakınız); 1x Hipotonik tamponu (bölüm 4.3'e bakınız); 1x Nükleer izolasyonu tampon (5.4 bölümler 2.8, 4.6, 5.3); 1x Elüsyon tamponu (Not Aşağıdaki bölüm 5.4).

> "Lways Şablon ve primerler Diziler T7-ar-oligo 5'TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GTT GGG CTT TTT TTT TCT CTT TCT CTC CTT TCT TTT TCT TCT TCC CTC CCT AGC TTA TGA CCG TGG CAG TCT -3 ' T7-AR-F 5'CTA ATA CGA CTC ACT ATA G -3 ' T7-AR-R 5'AGA CTG CCA CGG TCA TAA GC -3 ' hluc (+) - T7-prob-F 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGCCCCTGCTAACGACATTTACAACGAG-3 ' hluc (+) - sonda-R 5'-CATAATCATAGGGCCGCGCACACAC-3 '

Tablo 4: Şablon Diziler ve PCR Amplifikasyon T7-AR-oligo için Astar:. PCR amplifikasyonu için DNA şablonu (bakınız bölüm 10,1); T7-AR-F: PCR amplifikasyonu (bölüm 1.1) ileri primer; T7-AR-R: PCR amplifikasyonu (bölüm 1.1) için ters primer; hluc (+) - T7-sonda-F: PCR amplifikasyonu için ileri primer (bölüm 1.2); hluc (+) - sonda-R: PCR amplifikasyonu (bölüm 1.2) ters astar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

lncRNAs ve RBPS ancak bu moleküllerin moleküler mekanizmalar tam olarak anlaşılmamıştır, hastalık ve sağlıkta önemli roller üstlenir. lncRNA molekülleri ile etkileşime proteinlerin tanımlanması düzenleyici mekanizmaların tanıtılması yolunda önemli bir adımdır. RNA açılan deney sistemi ile RBPS zenginleştirilmesi, bir hücre lizatından proteinler seçici streptavidin manyetik taneleri bağlanmış biyo-küçültülmüş RNA yemler kullanılarak elde edilebilir, böylece kompleks etkileşim içinde çözeltisi yakalama dayanır. Böyle cıvıltı, TABLOSU ve RAP gibi bazı diğer yöntemler ancak bu yöntemler RNA açılan teknik 16,17,18 daha kurmak için daha fazla çaba gerektirir, aynı hedefe ulaşmak olabilir.

RNA pull ana gücü nispeten basit bir protokoldür ve uygulaması kolay olmasıdır. Hem CHIRP ve RAP RNA-protein kompleksleri ve antisens oligonükleotitlerin tam bir set tasarımını meydana doğal koruyan bir çapraz bağlama aşamasını içeren (90 Nükleofilikotides uzun RAP ve 20 nükleotid uzunluğunda Chirp olarak) tüm hedef RNA 16,17,18 fayans. RNA katlama RNA açılan deneylerinde kritik bir adımdır. Bu protokol ana sınırlama hedef RNAlar, in vitro olarak sentezlenir ve doğru şekilde RBP (ler) bağlanma, uygun izin vermek için ana yapıya katlanamaz olmasıdır. Yanlış katlanmış yerli olmayan RNA'lar sadece fizyolojik olmayan koşullarda in vitro meydana fonksiyonel tahlilleri veya form etkileşimleri RNA-protein etkileşimleri oluşturmak ve geçersiz başarısız olabilir ya. Burada anlatılan açılan protokol 13,14 katlama RNA iyi tanınan prosedürü kabul rağmen, diğer RNA transkriptleri için uygun katlanmasına garanti etmez, (bölüm 1.7 bakınız).

RNA açılan çoğunlukla ilgi 19 RBP bağlı RNA (ler) tespit etmek tamamlayıcı bir yaklaşım olarak RIP ile birleştirilmiştir. Bu protokol bir diğer kritik adım toplam hücreden lipid fraksiyonu atılmasıdırLizat (bkz bölüm 4.5) olgun adipositlerde yüksek lipid bolluk büyük bir teknik meydan okuma sunuyor çünkü. Burada açıklanan protokol, özellikle adipositler kullanılmak üzere geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu protokol ve kullanılan tüm tamponlar sıkılık temel bileşenleri değiştirilebilir ve diğer hücre kültürü modellerine uygulanması için adapte edilebilir. Endojen RNase yüksek seviyelerde doku için farklı RNA açılan protokoller uygulanabilir.

ilişkili RBPS tanımlamak için ilgi RNA'lar kullanan RNA açılan, insan hücrelerinde rolleri geniş bir yelpazesi var lncRNAs pivot fonksiyonları ve mekanizmaları, prob etkin ve verimli bir tekniktir. RNA pull dahil RNA bazlı yakalama, gelecekteki gelişimi, bileşenleri, montaj ve RNA-protein kompleksleri fonksiyonunu tanımlayan yanı sıra MS için düşük bol RNA-protein kompleksleri yeterli RBPS üreten ile zorlukların üstesinden gelmek için gerekli olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Bu eser Singapur NRF bursu (NRF-2011NRF-NRFF001-025) yanı sıra CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014) tarafından finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Major materials used in this study.
MEGAscript kit  Ambion
Biotin-14-CTP  Invitrogen
NucAway spin columns  Ambion
Dynabeads M-280 Streptavidin  Invitrogen
HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261)  Santa Cruz Biotechnology
Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005)  Santa Cruz Biotechnology
Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free)  HyClone
Phosphate Buffer Saline (1×PBS)  HyClone
RNase inhibitor  Bioline
Protease inhibitor  Sigma
Pfu Turbo DNA polymerase  Agilent Technologies
TRIsure  Bioline
Name Company Catalog Number Comments
Major equipment used in this study.
Sorvall Legend Micro 21R centrifuge  Thermo Scientific
Sorvall Legend X1R centrifuge  Thermo Scientific
Bio-Rad T100 thermal cycler  Bio-Rad
Nanodrop 2000  Thermo Scientific
BOECO rotator Multi Bio RS-24  BOECO,Germany
Protein gel electrophoresis and blotting apparatus  Bio-Rad
DynaMag-2 magnet  Life Technologies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huot, M. É, et al. The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis. Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).
  2. Sun, L., et al. Long noncoding RNAs regulate adipogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3387-3392 (2013).
  3. Engreitz, J. M., et al. The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X-chromosome. Science. 341 (6147), 1237973 (2013).
  4. Zhao, X. Y., Li, S., Wang, G. X., Yu, Q., Lin, J. D. A long noncoding RNA transcriptional regulatory circuit drives thermogenic adipocyte differentiation. Mol Cell. 55, 372-382 (2014).
  5. Alvarez-Dominguez, J. R., et al. De novo reconstruction of adipose tissue transcriptomes reveals long non-coding RNA regulators of brown adipocyte development. Cell Metab. 21, 764-776 (2015).
  6. Adams, D. J., Beveridge, D. J., van der Weyden, L., Mangs, H., Leedman, P. J., Morris, B. J. HADHB, HuR, and CP1 bind to the distal 3-untranslated region of human renin mRNA and differentially modulate renin expression. J Biol Chem. 278 (45), 44894-44903 (2003).
  7. Yeap, B. B., et al. Novel binding of HuR and poly(C)-binding protein to a conserved UC-rich motif within the 3´ untranslated region of the androgen receptor messenger RNA. J Biol Chem. 277, 27183-27192 (2002).
  8. König, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives. Nat Rev Genet. 13, 77-83 (2012).
  9. Ferrè, F., Colantoni, A., Helmer-Citterich, M. Revealing protein-lncRNA interaction. Briefings in Bioinformatics. , 1-11 (2015).
  10. McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15 (1), 203 (2014).
  11. Lee, Y. S., et al. AU-rich element-binding protein negatively regulates CCAAT enhancer binding protein mRNA stability during long term synaptic plasticity in Aplysia. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15520-15525 (2012).
  12. Hermann, M., Cermak, T., Voytas, D. F., Pelczar, P. Mouse genome engineering using designer nucleases. J Vis Exp. (86), (2014).
  13. Tsai, M. C., et al. Long Noncoding RNA as Modular Scaffold of Histone Modification Complexes. Science. 329 (5992), 689-693 (2010).
  14. Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505, 706-709 (2014).
  15. Li, H., et al. Identification of mRNA binding proteins that regulate the stability of LDL receptor mRNA through AU rich elements. J Lipid Res. 50 (5), 820-831 (2009).
  16. McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
  17. Chu, C., et al. Systematic Discovery of Xist RNA Binding Proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
  18. Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs. Nat Struct Mol Biol. 22 (1), 29-35 (2015).
  19. Zhao, J., et al. Genome-wide identification of Polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).

Tags

Moleküler Biyoloji Sayı 113 RNA pull-down RNA bağlayıcı protein adiposit kodlamayan kodlama

Erratum

Formal Correction: Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture
Posted by JoVE Editors on 08/20/2016. Citeable Link.

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

The author list has been updated from:

Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2

1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School

2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore

*These authors contributed equally

to:

Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2

1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School

2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore

3Division of Bioengineering, School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

*These authors contributed equally

RNA bağlama proteinlerinin tespiti ile<em&gt; İn Vitro</emAdiposit Kültür&gt; RNA pull-down
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bai, Q., Bai, Z., Xu, S., Sun, L.… More

Bai, Q., Bai, Z., Xu, S., Sun, L. Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture. J. Vis. Exp. (113), e54207, doi:10.3791/54207 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter