Abstract
유사 분열은 유기체의 성장과 분화에 중요합니다. 이 과정은 매우 동적이며 작은 시간 프레임에 적절한 염색질 응축, 미세 소관 - 동원체 부착, 염색체 분리 및 세포질 분열을 수행하는 이벤트를 주문할 필요합니다. 섬세한 과정에서 오류가 출생 결함과 암을 포함하여 인간의 질병이 발생할 수 있습니다. 인간 유사 분열 질환 상태를 조사 전통적인 접근법들은 인간의 질병을 연구 할 때 천연 생리 유리한 개발 / 조직 특정 콘텍스트 부족한 세포 배양 시스템에 의존한다. 이 프로토콜은 고해상도, 척추 시스템에서 염색체 역학 제브라 피쉬으로 시각화하는 방법을 제공함으로써 많은 장애물을 극복한다. 이 프로토콜 세부 사항을 포함 분열하는 세포의 동적 이미지를 획득하는 데 사용할 수있는 방법 것 : 시험 관내 전사, 제브라 피쉬 번식 / 수집, 배아 삽입하고, 시간 경과 영상을. 최적화 및 modif이 프로토콜의 ications도 탐구한다. H2A.F / Z-EGFP를 사용하여 mCherry-CAAX (라벨 세포막) mRNA를 주입 배아, AB 야생형, auroraB의 hi1045 및 돌연변이 제브라 피쉬가 가시화 esco2의 hi2865의 유사 분열 (염색질 레이블). 제브라 피쉬의 고해상도 라이브 영상은 하나가 통계적으로 유사 분열의 결함 및 유사 분열 진행의 타이밍을 정량화하기 위해 여러 유사 분열을 관찰 할 수 있습니다. 또한, 잘못된 (즉, congression 결함, 염색체 missegregation 등) 유사 분열 과정 부적절한 염색체 결과 (즉, 염색체, 배수성, 소핵 등)을 정의 질적 측면 관찰 관찰된다. 상기 분석은 조직 분화 / 현상의 관찰에 적용 돌연변이 제브라 약리 제제의 사용 의무가 될 수있다. 유사 분열에 결함이 암과 발달 장애에 의지 크게 이끌어 방법의 시각화질병의 발병 기전에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다.
Introduction
유사 분열은 살아있는 유기체의 성장, 분화 및 재생을위한 중요한 세포 과정에 필수적이다. 정확한 준비와 계면에서 DNA의 복제하면, 셀 분할 할 준비가 끝났다. 유사 분열, 의향의 첫 단계는 사이클린 B /는 Cdk1의 활성화에 의해 개시된다. 의향은 염색체에 염색질 물질의 응축을 특징으로한다. 핵 봉투 고장 의향 및 prometaphase 사이의 전환에서 발생한다. prometaphase에서, 중심체는 스핀들 형성을위한 핵 센터는 동원체 첨부 파일의 검색 미세 소관을 확장하면서 반대 극으로 이주하기 시작합니다. 부착시, 전환은 미세 소관의 첨부 파일 - 종료하고 장력은 중기 판 (1)을 구성하는 염색체의 방향. 모든 염색체가 올바르게 연결된 경우, 스핀들 조립 검사 점은 만족 함께 자매 염색 분체를 들고 cohesin 반지가 절단되고, 미세 소관은 동생을 끌어 단축anaphase (핵분열 말기), 3 중 반대 극에 염색 분체. 마지막 단계는 telophase, 두 개의 새로운 핵 주위의 핵 봉투의 세포와 개혁의 신장을 포함한다. 세포질 분열는 두 개의 새로운 딸 세포 4-6의 세포질을 분리하여 분할 프로세스를 완료합니다. 키 유사 분열 경로 (즉, 스핀들 조립 검사 점, 중심체 복제, 자매 염색 분체의 응집, 등.)의 변경은 중기 체포, 염색체의 missegregation 및 게놈 불안정 7-10 발생할 수 있습니다. 궁극적으로, 경로 제어 유사 분열에 결함이 발달 장애 및 암, 유사 분열의 필요로 시각화 및 라이브, 척추, 다세포 유기체 10-16에서의 결함의 원인이 될 수 있습니다.
제브라 피쉬 배아 인해 투명한 조직, 미세 주입의 용이성, 빠른 발전에 라이브 영상을위한 훌륭한 모델 생물의 역할을한다. 제브라 피쉬를 사용하여,이 원고의 전반적인 목표는이다라이브 5D 분열 (17) (도 1C)의 (차원 X, Y, Z, 시간 및 파장) 이미징하는 방법을 설명한다. 다른 유사 분열 경로에 결함이있는 돌연변이 제브라 피쉬의 사용은 이러한 결함의 결과를 보여줍니다. 이 프로토콜의 경우, 오로라 B와 Esco2 돌연변이는 이러한 결함을 설명하기 위해 선택되었다. 오로라 B는 스핀들 형성 및 미세 소관의 부착에 관여하는 염색체 승객 복잡 (CPC)의 일부인 키나제이다. 또한 세포질 분열 18,19 분열 고랑 형성을 위해 필요하다. 제브라 피쉬에서 오로라 B 결핍은 밭고랑 유도, 세포질 분열과 염색체 분리 (20)의 결함으로 이어집니다. Esco2 반면에, 자매 염색 분체의 응집 21,22 필수 인 아세틸이다. 그것은 이렇게 중기-anaphase (핵분열 말기) 천이 23 적절한 염색체 분리를 보장하기 cohesin 안정화 링 SMC3 부에 cohesin을 아세틸 레이트. 제브라 피쉬의 Esco2의 손실으로 Ch 리드romosome missegregation, 조기 자매 염색 분체 분리, 게놈의 불안정성 및 p53의 종속 및 독립적 인 세포 사멸 (24, 25). 인해 가용성 auroraB의 hi1045 및 esco2의 hi2865 돌연변이 제브라 25-27이 기술을 설명하기 위해 사용될 것이다 (이하 aurB m / m 및 m 개의 esco2 / m 각각이라 함).
형광 태그 셀 기계와 커플 링 공 초점 현미경은 유사 분열 25,28,29 동안 크로 마틴과 세포막 역학을 시각화하는 연구자 수있었습니다. 형광 태그가 히스톤은 역사적으로 염색질을 시각화하는 데 사용되었다. 히스톤은 염색체 (30)를 구성하는 뉴 클레오 구조에 대한 책임이 있습니다 네 가지 쌍 (H2A, H2B, H3 및 H4)로 구성된 핵 단백질이다. H2B는 틀림없이 형광 단백질을 가장 많이 사용되는 히스톤 동안마우스와 세포 배양, 히스톤 2A의 사용, 가족 Z (H2A.F / Z)는 제브라 피쉬 (31, 32)에 사용하기 위해 잘 입증하고있다. 콘 카나 발린 A와 카제인 키나제 1-γ는 예를 들어, 세포막에 지역화 및 이전 성게 초파리 (33, 34)의 세포막을 시각화 효과적인 것으로 나타났다. 다른 연구는 CAAX 형광 표지 된 단백질이 세포막 라벨 것을 도시 제브라 31에 성공했다. CAAX는 farnesyltransferases 및 geranylgeranyltransferases로 번역 후 수정 효소에 의해 인식되는 주제이다. 이 효소에 의해 변형 단백질 따라서 세포막 (35) 라벨, 멤브레인 관련되는 원인.
때문에 제브라 피쉬에서 사용하기 전에,이 프로토콜은 염색질과 세포막에 라벨을 H2A.F / Z와 CAAX를 사용하기로 결정했습니다. 이 방법의 응용 프로그램은 각각의 염색체를 관찰하는 연구자가 개별 세포 수준에서 유사 분열을 모니터링 할 수 있습니다역학뿐만 아니라, 동시에 조직 분화 및 발달에 영향을 미칠 수있는 여러 세포 분열을 모니터링한다. 이 문서는 개별 세포 수준에서 유사 분열시 염색체 분리의 역학 이미징에 초점을 맞출 것이다. 이 논문 내에서 여러 분열 분열 관찰 분할 시간을 계산하고, 유사 분열 표현형을 해독 할 수있는 능력은 도시되고 논의 될 것이다. 이러한 매개 변수를 사용하여 생리적으로 관련된 데이터가 수집 될 수 있고, 유사 분열 결함의 영향을 여러 질환 상태에 적용 하였다.
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Protocol
1. 시험 관내 전사
- 효소 (31)를 소화을 NotI 제한에 의해 PCS2-H2A.F / Z-EGFP 및 / 또는 PCS2-mCherry-CAAX 벡터를 선형화. 시험 관내 전사 키트에서 RNA를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라, 각각의 템플릿으로부터 5 'mRNA의 캡 제품을 생성한다.
- 정제 키트를 사용하여 캡핑 된 mRNA의 정제. 제조업체의 지침을 따르십시오. 의 RNase가없는 H 2 O로 용출
- 분광 광도계를 사용하여 260 nm에서 흡광도에 의해 RNA의 농도를 결정한다. (OD 260 X 희석 × 40 μg의 / ㎖).
- 각각 H2A.F / Z-EGFP 및 mCherry-CAAX의 RNase없는 H 2 O에 대한 μL / 100 NG에 RNA를 희석 RNA의 농도가 너무 낮은 경우, 형광이 감소 또는 부재한다. 밝은 샘플은 광독성과 광표백을 통해 우려를 감소합니다. 한편, 너무 많은 RNA는 독성 및 / 또는 표적 효과를 일으킬 수있다.
참고 : 나머지 저장-80 ° C의 냉동고에서 정제의 mRNA.
2. Zebrafish의 사육, 배아의 수집 및 mRNA의 주입 36-38
- 두 개의 영역으로 탱크를 분리 제브라 피쉬 시설에 사용되는 양식 시스템 물 각각의 사육 탱크를 채우기 위해 장벽 사육 탱크를 조립합니다.
- 사육 전날 밤, 불의의 번식을 방지하기 위해 다른면에 배리어의 일측 두 개의 암컷 어류 수컷을 배치하기 위해.
- 다음 날, 얼음에 이전에 제조 된 mRNA의 혼합물을 해동. 신선한 양식 시스템 물 사육 탱크에 물을 교체하고 장벽을 제거합니다. 장벽이 가져온 후 즉시, 28.5 ° C로 사출 금형을 따뜻하게하고 미세 주입을위한 장비를 설정합니다.
참고 : 사출 금형에 대한 자세한 내용은 라흐 (36)을 참조하십시오. - 차 여과기를 사용하여 15 분, E와 깨끗한 100 × 15mm 페트리 접시에 계란을 씻어 - 계란마다 10 수집3 블루 (5 mM의 염화나트륨, 0.17 밀리미터의 KCl, 0.33 mM의 CaCl2를, 0.33 mM의 황산, 10 -5 % 메틸렌 블루). E3은 푸른 곰팡이 성장을 방지하고, 물고기 유충 적절한 발전을 위해 사용된다. 결합 및 배아 컬렉션에 대한 자세한 내용은 라흐 36 Porazinkski (37)을 참조하십시오.
- 삽입 한 셀은 가온 사출 금형에서 배아를 단계적 배아 (도 1a)의 목적하는 양으로 난황에 RNA를 주입. 자연 배아 죽음과 실험에 필요한 것보다 15 % 더 많은 배아에서 배아 주사를 수행하여 미 수정 배아를 차지한다. 제브라 피쉬 배아의 미세 주입에 대한 자세한 내용은 라흐 36 Porazinkski (37)을 참조하십시오.
주 : mRNA를 처음으로 사용하기 위해서는 종래 5D 촬상을 수행하는 (최대 5 DPF없이 총 발달 결함으로 정의)의 형광과 생존에 대한 최적 투여 량을 결정하기 위해 용량 - 곡선 분석을 수행한다. 150-200 NG / μL수정란 내로 주입 따라서는 최종 농도를위한 좋은 출발점이 종종 최적 농도이다. - 조심스럽게 수정 된 9 "유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 금형에서 주입 된 배아를 추출합니다. 피펫을 수정하려면,이 공을 형성 할 때까지 분젠 버너를 사용하여 끝을 용융.
- 28.5 ° C 배양기에서 100 × 15mm 페트리 E3 블루에서 요리와 집에서 주입 된 배아를 놓습니다.
- 포스트 분사 여섯 시간은 플레이트에서 죽은 또는 미 수정 배아를 제거하고 깨끗한 E3 블루를 추가합니다. 28.5 ° C에서 하우스 배아.
3. 준비 및 이미징에 대한 라이브 Zebrafish의 태아의 포함 (그림 1B)
- 두 시간 이미징 전에 형광 해부 현미경을 사용하여 GFP에 대한 주입 된 배아를 화면. E3 블루와 새로운 100 × 15mm 페트리 접시에 밝은 녹색 GFP 발현 배아를 놓습니다.
- 아가 E3 블루 100 ml의 낮은 용융 1g을 첨가하여 1 % 저 용융 아가 로스의 스톡 용액을 끓여. 아가로 오스를 사용한 후 알루미늄 호일로 플라스크를 커버한다. 원액 한 달까지 유용 남아있다.
- 분취 액을 17 X 100mm 배양 관 내로 용융 아가 3 ㎖. 사용할 준비가 될 때까지 42 ° C의 물을 욕조에 문화 튜브를 배치하여 아가 로스를 따뜻하게 유지합니다. 제브라 피쉬 배아 (36) 마취 탈 이온수에 15 mM의 Tricaine 솔루션을 준비합니다.
주 : 이전 시점의 영상을 원하는 경우, 한천의 농도가 0.3 %로 낮은 39으로 감소 될 수있다. - 15 mM의 Tricaine, 상영 배아, 낮은 용융 아가로 오스, E3 블루, 및 해부 광학 현미경에 35mm 유리 커버 슬립 바닥 배양 접시를 가져옵니다. 조심스럽게 # 5 핀셋으로 배아의 융모막을 제거합니다. 세 개의 배아에 대해이 작업을 수행합니다.
- 별도의 용기에 dechorionated 배아를 마취 할 수 놓습니다. 커버 슬립 바닥 접시의 뚜껑은 주로 이러한 목적으로 사용된다. 전송 피펫을 사용하여, 세 방울을 추가 (약 150 μL)나까지 배아 충분히 마취 된 (커버 슬립 바닥 접시의 뚜껑을 사용하는 경우) 5 ml의 E3 블루의 접시에 15 mM의 Tricaine의. 1 % 용융 아가로 오스 튜브에 15 mM의 Tricaine 솔루션 - (200 ㎕를 약 150) 또한, 3 ~ 4 방울을 추가합니다.
- 차단 피펫 팁 1 cm와 P200 피펫을 사용하여; 커버 슬립 바닥 접시에 마취 배아를 전송합니다. Tricaine 솔루션 : 초과 E3 블루를 제거합니다.
- 배아 실수로 서로 가까이 표류하지 않도록하기 위해 별도의 각 드롭을 유지, 배아를 통해 Tricaine 솔루션 : 낮은 용융 아가로 오스 10 ㎕의 - 천천히 다섯을 추가합니다.
경고 : 아가로 오스가 너무 따뜻 경우에는 배아를 손상시킬 수 있습니다. 42 °의 C이다에 좋은 온도는 한천을 유지합니다. - 21 G 1 ½ 바늘을 사용하여 부드럽게 원하는 위치로 오스에서 배아의 방향. 시간 경과 이미징을위한 거꾸로 현미경을 사용하는 경우, possib로 커버 슬립에 가까운 관심 (ROI)의 영역의 방향르.
주 : 일반 목적 꼬리 영역 인해 비교적 얇은 조직 (도 1a)에 배향하고 명료 용이성을 제공한다. 이러한 노른자 및 핀 폴드를 둘러싸는 상피층 등 기타 조직, 28, 29을 이용할 수있다. 이 조직은 그러나이 지역은 불과 몇 세포층 두께이며, 좋은 선명도를 제공합니다. 이 프로토콜의 목적을 위해, 가능한 한 많은 세포 분열을 취득 꼬리 영역은 이미지에 유익하다. - 한천의 부분 응고에 대한 몇 분을 허용합니다. 그 응고를 테스트하기 위해 한천의 작은 조각 떨어져 휴식 바늘을 사용합니다. 한천의 조각을 드롭에서 멀리 당겨 할 수있는 경우, 다음 단계로 진행합니다.
- 낮은 용융 한천이 포함 된 배아를 통해 돔을 형성하는 전체 커버 슬립을 커버. 한천은 공 초점 영상 (그림 1A)의 요리를 이동하기 전에 응고하도록 허용합니다.
- 한천 응고 공정 (약 10 분 소요) 동안, 3 ㎖ O 준비(약 250 μL) 15 mM의 Tricaine의 다섯 방울과 F E3 블루 솔루션은 영상 중에 포함 된 배아 위에 배치합니다.
라이브 Zebrafish의 배아 40, 41의 4 5D 공 촛점 이미징
참고 : 다른 공 초점 시스템을 사용하여 5D 영상을 수행하는 방법에 대한 자세한 내용은 아리가 40 오브라이언 (41)을 참조하십시오. Z-간격, Z-스택, Z-깊이, 시간 간격 및 5D의 정의는 그림 1C를 참조하십시오.
- 이미징 소프트웨어를 열고 60X NA 1.4 대물 렌즈로 현미경을 설정합니다. 대물 렌즈에 침지 기름을 적용하고 현미경 무대에 슬라이드 홀더에 배양 접시를 놓습니다. 축 제어기를 사용하여, 대물 렌즈를 상기 관심 배아 센터와 배양 접시에 맞게 상승 대물 렌즈를 가져온다.
- 눈 조각 아이콘을 클릭하고 현미경에 GFP 필터로 전환합니다. 투자 수익 (ROI)에 초점을 맞 춥니 다. O를 coverslip에 가장 가까운 조직에 초점을 것입니다최적의 촬상 결과 ffer.
- 연동을 제거합니다. (소프트웨어에서 사전 설정된 파장)에 GFP 및 mCherry 채널을 선택하고 정상에 옵션을 평균 라인을 설정합니다.
- 사용 "보기 / 취득 컨트롤 / A1 스캔 영역"은 A1 스캔 영역 도구를 엽니 명령.
- 스캔을 시작합니다. 스캔 영역이 가능한 제브라만큼 충전되도록 축 제어기를 이용하여 태아의 위치. 레이저 출력은이 점에서 최적으로 할 필요가 없다. 불필요한 광표백을 피하기 위해 레이저 파워를 낮 춥니 다.
- ND 취득 제어판을 열고 "보기 / 취득 컨트롤 / ND 취득"명령을 사용하십시오.
- Z 축 스택 매개 변수를 설정 스캔을 시작합니다. 세포가 더 이상 볼 수 있습니다 위치로 Z-스택 세포에 초점이없는 경우에 상한과 하한을 설정합니다. 촬상 영역으로 확장 할 수있다 성장 및 세포 이동을 위해 샘플 위에 3 ㎛의 공간 허용한다. 이 프로에 도시 된 도면의 Z 스택로토콜은 배아의 꼬리에 40 ㎛의 Z-깊이 덮여있다.
- 2 μm의에 Z-간격 스텝 크기를 설정합니다. 평균 셀 직경 10 ㎛의이며; 따라서, 2㎛는 촬상 데이터 다섯 간격은 각각의 셀에 대해 분석되도록 생성된다.
참고를 취득 할 수있는 화상의 깊이는 Z 간격에 의존한다. Z 해결 가능한 (Z-큰 깊이)와 같은 유사 분열을 겪고 많은 세포로서 이미지를 위하여 Z 차원의 전체 깊이를 얻기 위해 희생된다. Z 깊이 (Z-작은 깊이)를 희생하는 동안 그 역으로, 사실, 스텝 사이즈를 감소시킴으로써, Z 해상도가 얻어진다. - 화상 레이저 파워, HV을 조정 레벨 오프셋. 실험이 프로토콜에서 설명 들어, 다음의 레이저 파워, HV를 사용하여 GFP 채널에 각각 상응하는 레벨로 설정된 레벨을 오프셋 (5), (120) - - 2 (140), 및 -11에 -9. mCherry 채널 들어, 다음 레이저 파워, HV를 사용하고, 각 레벨을 오프셋 3-6, 120-140, 및 -3-8. 매개 변수가 설정되면, 샘플의 광독성 및 광표백 될 수 있습니다 불필요한 레이저 노출을 방지하기 위해 스캔을 종료합니다.
- 2 번 라인의 평균 아이콘을 선택합니다. "평균 4 배 라인은"크게 스캔 시간을 증가하는 동안 "아무 평균"는 거친 이미지를 생성합니다. 배 선 평균의 사용은 이미지 품질과 빠른 스캔 시간 최고의 제공합니다.
- 실험에 필요한 적절한 시간 간격 및 시간 지속 기간을 선택한다. 야생형 구분 내용을 2 시간 2 분의 시간 간격 (도 1,도 2,도 3a 및도 3b에서 사용) 분열 기간을 결정하기위한 최선이다. 이상 30 분 동안 스핀들 조립 검사 점을 활성화 부문도 3c에 설명 된대로 형광을 유지하기 위해 네 시간 다섯 분 간격으로 더 적합하다.
- "파일 저장"상자를 선택하고이 획득되고 자동으로 파일을 저장할 파일 이름을 지정합니다. 모든 파 더블 체크rameters 올바르게 설정하고 "실행을 시작합니다"충돌한다.
- 인수가 완료되면, 세 차원 형식의 파일을 볼 볼륨 임계 값 아이콘을 클릭합니다.
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Representative Results
그림 2는 AB 야생형 제브라 피쉬 테일의 넓은 필드 뷰를 사용하여 많은 세포 분열을 관찰 할 수있는 능력을 보여줍니다. 일곱 개 이상의 유사 분열 세포는 14 분의 시간 프레임 (동영상 1)에 몇 군데 있습니다. 두 시간 시간 코스 내에서 40 개 이상의 유사 분열 이벤트가 포착되었다. 평균적으로 50 분할 세포는 AB에서 관찰하고 AUR의 B m / m 배아 (그림 2B) 30 분열하는 세포. 묘화 셀의 수 (도 2C)을 산출 하였다 묘화 세포 유사 분열 세포 수의 비율을 차지한다. 이 데이터는 이미지화되는 AUR의 B m / m 배아 (그림 2B)하지만 세포의 적은 숫자 유사 분열을 겪고 세포의 낮은 숫자가없는 것이 좋습니다. 이와 같은 이벤트의 통계적으로 유의 한 번호를 취득 할 수있는 능력은 통계 전력에 도움이됩니다.
그림 3은 유사 분열 기간을 정량화 포함하려면이 기술을 확장. 시간 경과 세션이 획득되면, 각각의 셀은 크게 공구 (도 3A, B)를 사용하여 적절한 해상도로 분열에 필요한 시간에 대해 분석 할 수있다. 유사 분열 지속 시간은 많은 시간 간격이 하나의 세포 분열을 차지 방법을 계산하여 수동으로 계산된다. 시간 간격의 수는 각 Z 스택 사이의 시간 간격에 의해 승산된다. 예를 들어,도 3c에, 분할은 12 시간 간격을 가져 갔고, 각각의 Z-스택 사이의 시간 간격은 2 분이었다. 따라서,이 세포의 분열 시간은 24 분이었다. 평균 AB 야생형 분할 시간은 25 분으로 aurB 분 / m에 대한 58 분 (도 3b). aurB의 m에서 보듯 장기간 분할 시간 / m 스핀들 어셈블리 검사 인해 잘못된 용 kine에 만족되지 않았 음을 암시tochore 첨부 1, 2. 야생 형 배아 확대 상기 자세히 살펴보면, 각각의 유사 분열 단계 (그림 3C, 영화 2) 구별 될 수있다. 또한, 유사 분열 결함은 유사 분열 체포를 포함하고 소핵 (그림 3D, 동영상 3)의 이핵 세포 및 후속 형성의 결과로 세포질 분열에 실패한 aurB m / m 배아에서 관찰 할 수있다. 유사 분열 결함을 보여주는 분석에 확대 된이 그림 (b)에서 취득한 증가 분할 시간을 지원합니다.
다른 다양한 유사 분열 결함과 그림 4에서 살펴 봅니다 발생할 수있는 세포의 운명 다양한; esco2 + / m 및 esco2 m / m 배아에서 보여 주었다. esco2 + / m 배아에서 잘못된 염색체의 움직임이 포착되고 congression 결함으로 정의 할 수 있습니다에스. 부적절한 미세 소관 첨부 파일이 이루어질 때 Congression 결함이 발생합니다. 이 결함은 염색체의 실패가 중기 판으로 이주하게됩니다. 중기 판으로 congressed하지 않은 분 20 및 46에서 특히 식별 한 쌍의 자매 염색 분체는, 첫째, 최소 14 anaphase (핵분열 말기) 발병이 중기 판뿐만 아니라 오른쪽에있는 한 쌍의 자매 염색 분체에 정렬 자매 염색 분체를 분리 관찰 될 수있다 이러한 분리 자매 염색 분체가 핵 (T = 50,도 4a, 영화 4) 외부 고립 상태를 유지로서 또한 분 (50)에서 관찰 가능한 소핵 형성이 관찰된다. 도 4b에서, 다극 부문 (동영상 5)를 시각화한다. 다중 극 부문은 종종 중심체 증폭으로 인해 발생하지만, 다른 수단 (42)을 통해 발생할 수 있습니다. 도 4c에서, esco2의 m / m 셀은 초기에 조기 자매 염색 분체 해부를 보여줍니다이온 및 스핀들 회전 9,43,44. 이 패널에서 입증 다른 세포의 운명은 merotelic 첨부 파일 45, 46 해결되지 않은있는에 anaphase (핵분열 말기) 다리입니다. anaphase (핵분열 말기) 다리는 처음 1 분 62에서 볼 수있는 염색질은 세포가 세포질 분열을 겪고하기 위해 조기에 decondense 동안 나타납니다. 세포질 분열이 발생하는 바와 같이, 절단 밭고랑은 이탈이 발생하는 등의 다리 anaphase (핵분열 말기) (도 4C, 영화 6)을 형성하는 재료 염색질 당겨 상기 decondensed 염색체 상에 충돌하고. 세포 운명을 정량화하기 위해, 여기에 도시되지 않았지만, 모든 프레임마다의 유사 분열 분열 그들이 나타내는 세포 운명의 종류를 기록한다. 기록 구획의 총수가 각각 운명에 셀의 수를 분할하고 세포의 운명 비율을 계산 (100)에 의해 곱.
그림 1 : 프로토콜 도면 개요. (에이) (B) 배아 매립 공정의 개략도. 주입 된 배아는 dechorionated 및 마취해야합니다. 배아는 커버 슬립 바닥 접시에 전송 과잉 E3 블루 제거한다. 낮은 용융 한천은 각 배아를 다루는 별도의 돔을 만드는 데 사용됩니다. 꼬리가 coverslip에 가장 가까운 수 있도록 배아의 방향. 전체 커버 슬립을 포함 한천 추가하기 전에 두 분을 기다립니다. 한천 이미지로 이동하기 전에 응고 될 때까지 기다립니다. (C) 도식 도면을 조건 프로토콜과 토론에 사용되는 Z-간격, Z-스택, Z-깊이, 시간 간격, 지속 시간 및 5D를 정의 할 수 있습니다. Z-간격 현미경은 Z 스택을 만드는 깊은 샘플로 이동함에 따라 각각의 이미지 사이의 거리로 정의된다. Z-스택은 통해 촬영 한 이미지의 전부입니다정의 된 Z-간격으로 샘플. A ~ Z 스택에서 이동 거리가 Z-깊이를 정의합니다. 시간 간격은 하나의 Z-스택 및 시간 경과 화상을 생성하는 다음 Z 스택 사이의 시간의 양이다. 지속 시간은 이미지에 사용되는 총 시간이다. 5D는 치수로 정의 X, Y, Z, 시간 및 형광 방출. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 타임 랩스 영상은 라이브 Zebrafish의 배아에서 여러 유사 분열 이벤트를 캡처합니다. (A)는 AB 야생형의 축소 실험에서 시간 경과 스틸, 다수의 유사 분열 이벤트를 보여주는 24 HPF의 제브라 피쉬. 별표는 유사 분열에 칠 세포를 향해 가리 킵니다. t는 분 경과 시간 =. 스케일 바 = 5 μm의. (B) 유사 분열 가전의 수24 HPF에서 AB와 aurB 분의 / m에 제브라 피쉬의 꼬리에서 관찰 LLS. ± 성을 의미한다. dev에., n은 3 배아 / 유전자형. (C) AB와 aurB m / 세포의 총 수에 따라 유사 분열 세포의 비율은 24 HPF에서 제브라 피쉬의 꼬리를 해요. ± 성을 의미한다. dev에., n은 3 배아 / 유전자형. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 개별 세포 분석 캡처 각각의 유사 분열 단계와 유사 분열 시간. (A) AB 야생형의 다양한보기 필드에서 선택된 셀 (24)의 HPF 지브라 피쉬 배아는도 2a에 도시. (B) 구분 시간이 AB 관찰하고 aurB m / m 세포와 핵 봉투 BRE를 추론 계산두 개의 새로운 딸 세포의 형성 세포의 응축 된 염색질의 첫 번째 관찰에서 akdown (NEB). N = 3 배아 / 유전자형, N = AB 66 사단, N = aurB m의 / m에 29 사단, *** p 값이 <0.001. (C) AB 야생형 세포 유사 분열을 통해 위상 진행을 시각화립니다 . t = 분. 스케일 바 = 5 μm의. (D) aurB m / m 세포는 세포질 분열 오류 및 소핵 형성의 결과 유사 분열 체포를 포함 유사 분열을 통해 유사 분열 진행을 시각적으로 잘립니다. 화살표는 소핵을 향해 가리 킵니다. t는 분 경과 시간 =. 스케일 바 = 5 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4.단일 셀 라이브 영상은 유사 분열 돌연변이의 염색체 분리와 분할과 관련된 여러 유사 분열 결함을 캡처 제브라 피쉬. (A) A는 esco2 + / m 배아에서 congression 결함을 겪고 셀의 이미지를 잘립니다. 얇은 화살표는 중기 판에 다시 당겨 왼쪽 염색체를 모니터링합니다. 두꺼운 화살표는 중기 판에 철수 및 소핵을 형성하는 추론되지 오른쪽 염색체를 모니터링합니다. 이중 화살표는 anaphase (핵분열 말기) 발병에 있지 의회 않았다 오른쪽 염색체의 분리를 보여줍니다. 세트는 의회에 실패 염색체의 전망을 확대 표시합니다. 세트는 자른와 밝기가 더 나은 시각화를 위해 강화되었다. CAAX 형광보다 쉽게 염색체 시각화 제거 하였다. 스케일 바 = 5 μm의. (B) A는 esco2에서 다극 부문 결과 유사 분열 체포를 겪고 셀의 이미지를 자른 + / m 배아. 스케일 바 = 5 μm의. 실 같은 괄호에 의해 언급 된 두 핵 사이에 당겨 볼 anaphase (핵분열 말기) 다리 형성의 결과로 셀 겪고 응집력 피로의 (C) 자른 이미지입니다. 스케일 바 = 5 μm의. t 분 경과 = 시간입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
1. 여러 세포 분열이 주입 된 야생 형 제브라 피쉬 배아의 넓은 관점에서 시각화 할 수 있습니다 영화 (오른쪽 다운로드 클릭).
유사 분열의 영화 2 페이즈가 쉽게 야생형 제브라 피쉬 배아에 가시화 될 수있다 (R ight 다운로드 클릭). 핵 봉투 고장은 중기 판을 형성하기 위해 자매 염색 분체의 congression 향해 핵 진행의 불규칙한 모양으로 추정된다 . 정확한 분리가 발생하고, 두 개의 새로운 딸세포를 산출한다.
의 영화 3. 라이브 영상 aurB 미터 / 분 배아는 염색체 미스 밝혀egregation, 세포질 분열을 실패하고, 소핵 형성은 (오른쪽 다운로드 클릭). 핵 봉투 고장은 염색체가 분열을 연장 축에 회전 적절한 중기 판을 형성하고, 진행 할 수없는 반대 극에 산란 핵의 불규칙한 모양으로 추정된다 셀의 시간. 세포질 분열는 4N 셀과 다수의 소핵의 결과로 발생하지 않습니다.
영화 4. Congression 결함이 관찰된다 esco2 + / m 배아 (오른쪽 다운로드 클릭). 핵 봉투 고장은 핵의 불규칙한 모양으로 추정된다. 중기 판을 형성 한 후, 몇 INDI개 별 염색체 양쪽으로 흩어. 오른쪽에있는 염색체가 중기 판의 외부에 남아 있고, anaphase (핵분열 말기)의 시작에서 자매 염색 분체 분리 볼 수있는 동안 왼쪽으로 해제 한 각각의 염색체는 결국 중기 판에 다시 당겨진다. 세포는 장기간 분할 시간 그러나 잠재적 인 소핵 형성 궁극적 인 분할을 나타낸다.
영화 5. 멀티 극성 부문은 esco2 + / m 배아에서 관찰된다 (오른쪽 다운로드 클릭). 핵 봉투 고장은 핵의 불규칙한 모양에서 유추 한 후 염색체는 Y 자형 indicativ를 형성하기 위해 병합된다3 스핀들 극의 전자. 세포는 오랜 시간 분할을 나타내고 있지만, 궁극적으로 3 딸세포로 분할한다.
영화 6. 염색 분체 분리, anaphase (핵분열 말기) 브리지 형성이 esco2의 m / m에 배아에서 관찰되는 조기 자매 (오른쪽 다운로드 클릭). 핵 봉투 고장은 염색체가를 형성 할 수없는 셀에 걸쳐 산란 후 핵의 불규칙한 모양으로 추정되며, 적절한 중기 판. 염색질은 이전 세포질 분열과 세포 분열로 decondenses 두 셀 사이의 anaphase (핵분열 말기) 다리를 만듭니다.
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Discussion
이 방법의 사용은 하나가 생체 내에서 한 번에 의존하는 방식으로 두 개의 새로운 세포를 형성하는 핵 봉투 고장, 미세 소관 - 동원체 첨부하여 중기 판의 형성 및 자매 염색 분체의 분리를 유추 할 수 있습니다. 세포가 천연 생리에 묘화되기 때문에 제브라 유사 분열 관찰하는 능력은 조직 형광 단백질을 사용하기 위해, 그들은 비교적 빠른 개발 및 저속 촬상 허용하는 투명 고정 샘플 및 세포 배양 시스템에 비해 이점이있다 취득 할 수있다. 이 프로토콜에 대한 성인 제브라 피쉬의 사용으로 인해 피부 나 눈없는 두꺼운 조직으로 인해 취득 할 수 제한된 Z-깊이로 제한됩니다. H2A.F / Z-EGFP와 mCherry-CAAX 발현 트랜스 제닉 동물이 다른 돌연변이 제브라으로 mRNA의 주사 동일한 목적은 범용성 및 편리를 위해 사용될 수 있지만 유전 교배보다 유리하다. 상황에서 유사 분열 분석이고삼일 게시물 수정 (DPF) 이상 배아 필요, 형질 전환 동물로 인해이 급속하게 발전 유기체에서 RNA의 반감기에 필요하다.
유사 분열을 시각화 다른 형광 단백질이 프로토콜 의무가 있습니다. 예를 들어, H2B-GFP의 mRNA는 염색질에 대한 / Z-EGFP를 H2A.F의 대안이며, 유사한 표시를 제공합니다. 이 기술에 사용될 수있는 다른 형광 태그 단백질은 각각 핵 봉투, 중심 소체, 플러스 엔드 미세 소관, 동원체와 미세 소관의 라이브에-배아 이미징 허용 POM121, centrin, Eb1은, Hec1 및 EMTB 포함 32,47-51.
이 프로토콜은 양질의 결과를 달성하기 위해 실행해야합니다 몇 가지 주요 이미징 단계가 있습니다 : 1) 밝은 형광 가능한 독성을 생성하는 mRNA의 품질과 농도를 최적화해야합니다. 더 형광 적은 레이저 노광 따라서, 이하 photoblea로 이어질 것칭과 광독성. 2) 배아는 완전히 마취 및 한천에서 보안해야합니다. 사소한 움직임은 결과를 변경하고 실험을 망칠 수 있습니다. 배아의 단계는 몇 군데하고자 위해 3) 한천 농도가 적절해야합니다. HPF (24)에 추가로, 1 % 저 용융 아가 로스가 적합하다. 영상 12 HPF에서 또는 이전 버전, 0.3 % 아가로 오스 솔루션 (39)를 사용해야합니다. 4) 배아의 ROI가 가능한 커버 슬립에 가깝게해야한다. 이 단계는 꼬리를 이미징 하나를 제한하지 않습니다. 눈, 피부, 지느러미 지역, 노른자, 그리고 지느러미 배는이 프로토콜을 사용할 수있는 다른 영역의 예입니다.
시간은 이미지 수정 배아 나 조직에서이 프로토콜을 구분하는 정의하는 요소이다. Z 축 스택, Z-간격, 시간 경과 간격 및 시간 경과 기간을 설정하면, 마음에 실험 (그림 1C)의 컨텍스트를 유지하는 것이 중요합니다. 야생 형 세포 분열은 일반적으로 24 HPF에서 약 25 분 동안 지속됩니다. 일에서인스턴스이며,이 시간 동안 2 분 시간 간격으로 Z 스택에서 조직의 40 μm의를 커버하는 2 μm의의 Z-간격은 효과가 입증되었습니다. 또한, 결함이있는 유사 분열과 배아에서는, 유사 분열 체포 세포는 가장 가능성이 존재한다 획기적으로 세포 분열 시간을 증가시킨다. 복수의 전체 분할을 획득하기 위해, 지속 시간이 4 시간을 2 시간에서, 즉, 증가되어야한다. 더 긴 획득 시간보다 레이저 파워에 샘플을 노출시켜 광표백 및 광독성의 위험을 증가시킬 것이다. 이 경우, 각 Z 스택 간의 시간 간격이 증가되어야한다. 동적 염색체 움직임은 Z-스택 사이의 시간 간격을 증가시킴으로써 희생되지만, 지속 시간이 얻어진다. 위에 두 시간을 지속 할 수 세포 분열을 이미징 할 때 필요하다.
이 직접 논의되지 않았지만,이 프로토콜은보다 정확하게 개인 염색체 MO를 시각화하기 위해 Z 평면에서 더 높은 해상도의 이미지를 얻기 위해 최적화 될 수있다vements. 예를 들어,도 4a에서 두 missegregated 염색체 관찰된다. (두꺼운 화살표로 언급) 오른쪽에있는 염색체는 처음에 밝고 초점하지만 지난 몇 프레임에 어두워집니다. 2 μm의의 Z-간격으로, uncongressed 염색체는 Z-간격 사이에 빠진다. 캡처 분 움직임 단일 염색체 이벤트는 Z 평면에서의 해상도를 증가시킴으로써 달성 될 수있다. 이렇게하려면 A1 스캔 영역 도구를 사용하여 개별 셀을 확대. Z 축 스택 매개 변수를 설정할 때, 작은 Z-간격 거리를 사용합니다. 1 ㎛ - 권장되는 범위는 0.5입니다. 또한, 각 Z 스택 사이의 시간 간격의 감소는 두 분 30 초에, 즉, 각각의 시간 프레임 간의 부드러운 전환을 생성한다 - 1 분. 이미징 이러한 유형의 한 가지주의가 달성 될 수있는 제한된 Z-깊이이다. 인해 작은 Z 간격 시간 간격보다 작은 조직 시간 내에 레이저에 노출 될 것이다. 이, SM을 극복하기 위해ALLER 지속 시간이 사용될 수있다; 그러나 이것은 연구자가 분열을 캡처하고 싶은 시간에 또한 의존한다.
이러한 수정에 도움이 될 수 있습니다 비유는 아코디언 등의 Z-스택을 생각하는 것입니다. 벨로우즈 각각의 플리츠 사이의 거리는 Z 간격이고 Z-깊이 아코디언의 길이에 의해 표시된다. 하나 (Z 심도를 증가) 아코디언 뻗어 같이 샘플 더 레이저 노광이 발생하지 것 인 경우에, 벨로우즈 (Z 간격)의 플리츠 사이의 거리도 증가한다. 역은 아코디언 계약과 같은 점에서 사실은 Z-깊이는 감소한다. 벨로우즈 계약의 주름뿐만 아니라 Z 간격의 감소에 대응. 이 비유 고정 실제 샘플에 적용될 수있다. 시간은 수학 식에 추가 될 때 복잡성이 프로토콜에서 증가된다. 아코디언 확장 또는 아코디언 계약 수있는 시간의 한정된 양이있다. 이 represen시간 간격 TS. 커버하기 위해 더 많은 거리 (Z-깊이)의 시간 간격이 증가한다. 물론, 더 많은 음악을 듣기 위해, 하나는이 프로토콜의 이용 시간 (지속 시간)보다 긴 시간 동안 청취해야 이상의 세포 분열을 목격하기 위해서, 지속 시간이 증가한다. 명심하기위한 합성 요소입니다 재생되는 더 많은 음악, 더 피곤 아코디언. 이것은 최종 치수 형광 유사하다. 샘플이 주어진다 이상의 레이저 노광, 더 광표백 및 광독성 (피로)은 문제가된다.
요약하면,이 프로토콜은 다른 분석에 적용 라이브 제브라 배아 유사 분열 시각화하는 방법을 자세히 설명; 1) 분할 수 2) 분할 시간 3) 분할 운명, 4) 높은 해상도 염색질 역학. 역학을 중심 소체하는 미세 소관 - 동원체 첨부 파일에 이르기까지 유사 분열 구성 요소를 시각화에 대한 여러 가능성을 적용 할 수있다. 의 기능을 겸비한제브라 피쉬의 게놈 편집의 최근 발전과 생체 내 이미징 유사 분열은 쉽게 척추 동물 유기체 25,26,52-56 인간의 질병을 모델링하기 위해 유사 분열의 다양한 측면에 돌연변이를 생성 할 것입니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCS2 vectors | Gift from K. Kwan | For plasmid of interest | |
| NotI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3189S | For restriction digest of plasmid |
| mMessage SP6 kit | Life Technologies | AM1340 | For in vitro transcription |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | For purifying mRNA |
| 100 x 15 mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | For housing embryos |
| microinjection mold | homemade | For holding embryos during microinjection | |
| Agarose II | Amresco | 0815-25G | For embedding embryos |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521-10G | For anesthetizing embryos |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M7506 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Methylene Blue Hydrate | Sigma-Aldrich | MB1 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| 100 mm culture tube | Fisher Scientific | 50-819-812 | For melted agar |
| 35 mm glass coverslip bottom culture dish | MatTek Corp | P35G-0-20-C | No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos |
| #5 tweezers | Dumont | 72701-D | For dechorionating embryos |
| 21 G 1 1/2 gauge needle | Becton Dickinson | 305167 | For positioning embryos in agar |
| Dissecting microscope | Nikon AZ100 | For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do | |
| Confocal microscope | Nikon A1+ | For time-lapse imaging | |
| Confocal software | NIS Elements AR 4.13.00 | For image acquisition and processing |
References
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