Abstract
有丝分裂为有机体的生长和分化至关重要。这个过程是高度动态的，需要有序的事件来完成适当的染色质凝聚，微管连接着丝粒，染色体分离和胞质分裂在小时间框架。在微妙的过程中的错误可能导致人类疾病，包括出生缺陷和癌症。传统的方法研究人类疾病的有丝分裂状态往往依赖于细胞培养系统，研究人类疾病时，缺乏自然的生理和发育/组织特异性环境有利。该协议提供了一种可视化，高分辨率，在脊椎动物系统染色体动态，斑马鱼克服许多障碍。该协议将详细可用于获得分裂的细胞，其包括的动态图像的方法： 在体外转录，斑马鱼养殖/收集，胚胎嵌入，和延时成像。优化和改性的该协议的ications进行了探讨。使用H2A.F / Z-EGFP（标签染色质）和mCherry-CAAX（标签细胞膜）的mRNA注射的胚胎，有丝分裂在AB野生型，auroraB hi1045 和 esco2 hi2865突变斑马鱼被可视化。在斑马鱼高分辨率实时成像允许一个观察多个核分裂进行统计量化有丝分裂的缺陷和有丝分裂进程的时机。此外，定义不当的有丝分裂过程（ 即，板集合缺陷，染色体missegregation 等 ）和不适当的染色体的结果（ 即，非整倍体，多倍体，微核等 ）质量方面观察被观察。该测定可用于组织分化/发展的观察，是适合于使用突变斑马鱼和药理学试剂的。在有丝分裂的缺陷如何导致癌症和发育障碍将极大地可视化提高疾病的发病机理的理解。
Introduction
有丝分裂为生长，分化和再生在活生物体中的关键的细胞过程是必不可少的。在准确的准备和在间DNA的复制，使细胞被起动来划分。有丝分裂，前期，第一阶段是由细胞周期蛋白B / CDK1的活化启动。前期的特征在于染色材料的缩合到染色体。核膜破裂发生在前期和前中期之间的过渡。在早中期，中心体，主轴形成成核中心，开始迁移到对立的两极，而在寻找着丝点附件延伸的微管。一旦附件转换到最终的微管附着和张力定位形成中期板1染色体。如果所有染色体正确连接时，纺锤体装配检验点满足，黏着环抱着姐妹染色单体一起被切开，微管缩短拉妹妹染色单体到对立的两极后期2,3时。最后阶段，末期，涉及围绕两个新的核核膜的细胞和改革的延伸。胞质分裂完成通过分离两个新的子细胞4-6的细胞质分裂过程。关键有丝分裂途径（ 即纺锤体装配检验点，中心体复制，姐妹染色单体凝聚力等 ）的改变可能会导致中期逮捕，染色体missegregation和基因组不稳定性7-10。最终，在通路控制有丝分裂的缺陷会导致发育障碍和癌症，有丝分裂的迫使可视化和其在现场，脊椎动物，多细胞生物体10-16缺陷。
斑马鱼的胚胎作为实时成像一个伟大的模式生物，由于透明组织，易于注射的，快速发展。使用斑马鱼，这份手稿的总体目标是描述的活5D有丝分裂17（ 图1C）的（尺寸的X，Y，Z，时间和波长）成像的方法。利用斑马鱼突变体在不同有丝分裂的途径有缺陷的论证这种缺陷的结果。对于这个协议，极光B和Esco2突变体被选择来说明这些缺陷。极光B是一种激酶是参与纺锤体形成和微管附着的染色体乘客复合物（CPC）的一部分。它也需要在胞质18,19分裂沟的形成。在斑马鱼中，极光B缺乏导致皱纹的诱导，细胞分裂和染色体分离20的缺陷。 Esco2，另一方面，是一种乙酰这对姐妹染色单体凝聚力21,22是必不可少的。它乙酰化上从而稳定黏结，以确保正确的染色体分离的中期-后期过渡23环的SMC3部黏着。在斑马鱼Esco2的丧失导致为chromosome missegregation，过早姐妹染色单体分离，基因组不稳定和p53依赖性和独立的凋亡24,25。由于可用性，auroraB hi1045 和 esco2 hi2865突变斑马鱼（以下简称为aurB M / M和esco2 米/分 ，分别地）将被用来说明此技术25-27。
用荧光标记的细胞的机械耦合共焦显微镜使研究人员有丝分裂25,28,29中可视化染色和细胞膜动力学。荧光标记的组蛋白在历史上被用于可视化的染色质。组蛋白是四种不同的对（H2A，H2B，H3和H4）是负责该构成染色体30中的核小体结构组成的核蛋白质。尽管H2B可以说是在荧光蛋白中最常用的组蛋白小鼠和细胞培养，用组蛋白2A的，家庭Z（H2A.F / Z）已在斑马鱼31,32使用证明很好。伴刀豆球蛋白A和酪蛋白激酶1-γ，例如，定位于细胞膜和先前已显示有效的可视化细胞膜在海胆和果蝇33,34。其它研究已经表明，CAAX荧光标记蛋白标记的细胞膜并成功地斑马鱼31。 CAAX是受翻译后修饰的酶如farnesyltransferases和geranylgeranyltransferases识别的基序。由这些酶修饰导致蛋白质成为膜相关，从而标记的细胞膜35。
由于在斑马鱼的先前使用，该协议选择使用H2A.F / Z和CAAX标记染色质和细胞膜。这种方法的应用将允许研究者在单个细胞水平监测的有丝分裂，观察个人染色体动力学，以及同时监测可能影响组织的分化和发育的多个细胞分裂。本文将着眼于在单个单元格级别的有丝分裂过程中染色体成像分离的动态。在这个手稿，观察几个有丝分裂，分裂计算时间和破译的有丝分裂表型的能力进行说明和讨论。通过使用这些参数，生理学相关的数据可以被收集并施加到受有丝分裂的缺陷数的疾病状态。
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Protocol
1. 体外转录
- 线性化PCS2-H2A.F / Z-EGFP和/或PCS2-mCherry-CAAX载体通过的NotI限制性内切酶消化31。 体外转录试剂盒使用RNA，产生从每个模板5'加帽mRNA产物，根据制造商的协议。
- 净化用纯化试剂盒的皑皑的mRNA。按照制造商的说明。用无RNase H 2 O洗脱
- 确定在使用分光光度计260nm处吸光度的RNA的浓度。 （OD 260×稀释×40微克/毫升）。
- 稀释的RNA至100毫微克/微升的每个H2A.F / Z-EGFP和mCherry-CAAX无RNA酶的H 2 O如果RNA浓度过低，荧光会被减少或不存在。光明的样本将逐渐减少光毒性和光漂白的关注。另一方面，过多的RNA可能是有毒的和/或引起脱靶效应。
注：存储剩余纯化的mRNA在-80℃的冰箱中。
2.斑马鱼繁育，胚胎收集，和mRNA注射36-38
- 组装养殖坦克的障碍，坦克分成两个区域，并填写在斑马鱼设施所用养殖系统中的水每一个养殖池。
- 为了防止过早配种，将两个雄鱼的屏障的一侧，两名女鱼放在另一边的夜滋生了。
- 第二天，在冰上解冻预先制备的mRNA混合物中。用新鲜的水产养殖系统中的水替换养殖箱水和消除障碍。的障碍被拉到后，立即温热注射模具至28.5℃，并设置在设备的显微注射。
注：有关注塑模具的信息，请参考格拉赫36。 - 收集鸡蛋每10 - 用滤茶15分钟，冲洗鸡蛋放到一个干净的100×15毫米的培养皿有E3蓝（5毫米氯化钠，0.17毫米氯化钾，0.33毫米氯化钙2，0.33mm的硫酸镁 ，10 -5％亚甲蓝）。 E3蓝用于防止真菌生长和确保仔鱼的适当发展。有关配套和胚胎收集更多信息，请参阅格拉赫36和37 Porazinkski。
- 嵌入单细胞期胚在温热注塑模具和注入RNA进入蛋黄中的胚胎（ 图1A）的所需量。账户自然胚胎死亡和未受精的胚胎通过在15％以上的胚胎比实验所需进行胚胎注射。有关斑马鱼的胚胎显微注射的更多详细信息，请参考格拉赫36和37 Porazinkski。
注：对于第一次使用的mRNA，进行剂量曲线分析，以确定荧光和活力（定义为无毛发育缺陷最多5 DPF）执行5D成像之前的最佳剂量。 150 - 200纳克/微升注入胚胎往往是最佳浓度，因此它是为最终浓度的良好的起点。 - 仔细提取采用改良9“玻璃巴斯德吸管模具注入胚胎。要修改吸管，熔体使用本生灯，直到它形成了一个球结束。
- 将注射胚胎在E3蓝100×15毫米的培养皿和房屋在28.5℃培养箱。
- 六小时后注射，从平板除去任何死亡或未受精的胚胎，并添加干净E3蓝。房子胚胎在28.5℃。
3.制备及成像活斑马鱼胚胎嵌入（图1B）
- 成像前两小时，屏幕采用了荧光解剖显微镜对GFP注入胚胎。将鲜绿色的绿色荧光蛋白表达的胚胎在一个新的100×15毫米培养皿E3蓝。
- 通过加入1g低熔点的琼脂糖至100毫升的E3蓝煮沸1％低熔点琼脂糖的原液。使用琼脂糖后，用铝箔覆盖的烧瓶中。原液保持为长达一个月有用。
- 等分试样将3ml熔化的琼脂成17×100毫米的培养管中。通过将培养管在42℃水浴，直到准备使用保持琼脂糖温暖。制备在去离子水中的15mM的三卡因溶液来麻醉斑马鱼胚胎36。
注意：如果在较早的时间点成像是期望的，琼脂的浓度可以降低低到0.3％39。 - 把15毫三卡因，筛选胚胎，低熔点琼脂糖，E3蓝，和35毫米的玻璃盖玻片底培养皿到解剖光学显微镜。仔细＃5镊子取出胚胎的绒毛。做到这一点的三个胚胎。
- 放置在一个单独的容器中的dechorionated胚胎被麻醉。盖玻片底培养皿的盖通常用于此目的。用移液管，加三滴（约150微升）15毫米三卡因到5ml E3蓝盘（如果使用盖玻片底部盘的盖子），或直到胚胎已被充分麻醉。此外，加3-4滴 - 15毫米三卡因溶液（约150 200微升）到1％琼脂糖融化管。
- 使用1厘米切断了枪头的P200移液器;在麻醉的胚胎转移到盖玻片底培养皿。删除多余的E3蓝：三卡因溶液。
- 慢慢加入5 - 10微升低熔点琼脂糖的：三卡因溶液在胚胎中，保持每个液滴分开，保证了胚胎不小心漂移彼此接近。
警告：如果琼脂糖太热，会损坏胚胎。一个良好的温度维持在琼脂为42℃。 - 使用21g的1个半针，轻轻定向在琼脂糖到所需位置的胚胎。当使用时间推移成像倒置显微镜，东方感兴趣区域（ROI）尽量靠近盖玻片作为possib地区勒。
注意：对于一般用途，尾部区域提供易于取向和清晰度由于相对薄组织（ 图1A）。其他组织，如围绕蛋黄和鳍褶皱上皮细胞层，可以使用28,29。这些组织提供了极大的清晰度，但是这些地区只有少数细胞层厚。对于这个协议的目的，是形象有利于获得尽可能多的细胞分裂尽可能尾部区域。 - 允许琼脂局部凝固几分钟。使用针掰开一小块琼脂，以测试其固化。当一块琼脂可以从下拉被拉远，进行到下一个步骤。
- 覆盖低熔琼脂形成了嵌入式胚胎圆顶整个盖玻片。允许琼脂到移动的菜对于共焦成像（ 图1A）之前固化。
- 在琼脂凝固过程（大约需要10分钟），制备3-毫升邻同（约250微升）的15mM三卡因五滴˚FE3蓝溶液到在成像期间被放置在嵌入胚胎。
活斑马鱼胚胎40,41 4. 5D聚焦成像
注：请参阅有贺40和41奥布莱恩关于如何使用其他共聚焦系统来执行5D影像细节。对于Z-间隔，Z堆叠，Z深度，时间间隔，和5D定义，请参见图1C。
- 打开成像软件并设置显微镜60X 1.4 NA物镜。适用浸油物镜，并放置在显微镜舞台上的滑动架的培养皿。使用轴控制器，居中的物镜上述感兴趣的胚胎，并把物镜向上满足培养皿。
- 点击目镜图标并切换到显微镜上的GFP过滤器。专注于投资回报率。着眼于组织最接近盖玻片便邻FFER最佳的成像效果。
- 拆下互锁。选择GFP和mCherry通道（软件预先设定的波长）并设置行均选择正常。
- 使用“查看/采集控制/ A1扫描区域”命令打开A1扫描区域的工具。
- 开始扫描。使用轴控制器，定位胚胎使得扫描区域填充有尽可能多的斑马鱼尽可能的。激光功率并不需要在这一点上最佳的。降低激光功率，以避免不必要的光漂白。
- 使用“查看/采集控制/ ND收购”命令打开ND采集控制面板。
- 开始扫描设置Z-栈参数。设置Z-堆栈上限至细胞，其中未聚焦和下限，其中细胞不再可见。允许一个3微米空间中的采样生长和细胞运动之上，其可以扩展到成像领域。的Z堆叠对该亲所示的附图母育酚在胚胎尾覆盖40μm的Z深度。
- 的Z区间的步长设置为2微米。平均来说，一个细胞的直径为10微米;因此2微米会产生对每个小区进行分析成像数据五个间隔。
注：可获取的图像的深度取决于在Z间隔。 Z轴分辨率牺牲来获得在Z尺度整体深度以图像为许多细胞有丝分裂经历尽可能（大Z深度）。逆是真实的，在通过减小步长，Z轴分辨率的不断积累，而Z向深度处死（小Z深度）。 - 调整图像的激光功率，HV，和偏移水平。对于这个协议证明实验中，使用下面的激光功率，高压和偏移，分别设置在相应的水平，为GFP通道电平; 2 - 5 120 - 140，和-9至-11。对于mCherry通道，使用下面的激光功率，高压和失调的水平，分别为; 3 - 6，120 - 140，和-3至-8。一旦参数被设定，关闭扫描，以防止不必要的激光曝光可能导致样品的光毒性和漂白。
- 选择2倍线平均图标。 “不平均”产生颗粒感的图像，而“4倍平均线”极大地提高了扫描时间。 2X线平均的使用提供最佳的图像质量和最快的扫描时间。
- 选择所需的实验适当的时间间隔和持续时间。对于野生型师，2小时两分钟的时间间隔是最佳的，用于确定有丝分裂的持续时间（在图1，图2，图3A和3B中）。该激活纺锤体装配检验点的时间超过30分钟，司更适合于四小时间隔五分钟，以便如在图3C中展示了以保持荧光。
- 勾选“保存到文件”框并命名文件自动保存文件作为被收购它。仔细检查所有的PArameters设置正确，然后点击“开始→运行”。
- 收购完成后，要查看三维格式的文件，点击量门槛图标。
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Representative Results
图2显示，观察使用AB野生型斑马鱼尾巴的宽视场多细胞分裂的能力。超过七有丝分裂细胞成像在14分钟的时间内（ 电影1）。在两个小时的时间，当然，超过40的有丝分裂事件被抓获。平均来说，在AB观察50分裂的细胞，并在AUR B M /米胚（ 图2B）30分裂的细胞。考虑到成像单元的数量，有丝分裂的细胞，以成像的计算（ 图2C）的细胞数的比率。这个数据表明，不存在正被成像的低级数量的细胞通过有丝分裂中的AUR B M /米胚（ 图2B），但细胞数量较少去的。获取的事件，如此的统计学显著号码的能力将在统计功率帮助。
图3上这一技术扩展到包括定量的有丝分裂期间。一旦一个时间推移会话获得的，单个单元可以分析通过使用缩放工具（ 图3A，B）在有丝分裂花费足够的分辨率的时间。有丝分裂的持续时间是通过计算多少时间间隔如何占据一个细胞分裂人工计算。时间间隔的数目，然后由每一Z堆叠之间的时间间隔相乘。例如，在图3C中 ，分割拿起12的时间间隔及每一Z堆叠之间的时间间隔为2分钟。因此，划分时间该单元为24分钟。平均AB野生型分裂时间为25分钟，为aurB 米/分 58分钟（ 图3B）。如见于aurB 微米的延长分裂时间/米表明主轴组件检查点还没有被满足由于错误的显像管tochore附件1,2。以在野生型胚胎放大细看，每个核分裂相可以区分（ 图3C， 电影2）。此外，有丝分裂的缺陷可以在aurB 米/分胚，其中包括有丝分裂停滞和失败的胞质导致微核（ 图3D， 电影3）的双核细胞和随后的形成中观察到。这显示出有丝分裂的缺陷分析支持放大图3B收购增加的划分时间。
其他各种不同的有丝分裂的缺陷，并且可能遇到在图4中进行了探索细胞命运;中演示了esco2 + / M和esco2 米/分的胚胎。在一个esco2 + /米胚，错误染色体运动被捕获并可以定义为板集合缺陷秒。当不当微管附件是由发生板集合缺陷。这些缺陷会导致染色体未能朝向中期板迁移。配对姐妹染色单体，在分20和46尤其可识别的，而没有朝着中期板congressed可以在分钟14.后期发作分离在中期板以及一对姐妹染色单体向右对准的姐妹染色单体被首次观察到，在50分钟的观察。此外，由于这些分隔姐妹染色单体保持核（T = 50， 图4A，电影4）外界隔离观察可能的微核形成。在图4B中 ，一个多极分裂被可视化（ 电影5）。多极部门经常会出现由于中心体扩增，而是通过其他手段42可能发生。在图4C中 ，一个esco2 M / M细胞最初演示过早姐妹染色单体分隔符离子和主轴旋转9,43,44。在此面板中显示出的另一个细胞的命运是后期桥在merotelic附件是悬而未决45,46。后期桥可以第一次看到在62分钟的染色质过早decondense而细胞正处于细胞分裂。作为胞质分裂发生时，卵裂沟照射在解聚染色体和作为脱落时，拉染色质材料以形成后期桥（ 图4C，电影6）。虽然这里没有示出，为了量化所述蜂窝命运，记录在每个帧中所有的有丝分裂和细胞命运的它们表现出的类型。通过记录区划的总数除以细胞的数目在每个命运和乘以100来计算细胞命运百分比。
图1：协议图纸大纲。 （一个） 。（B）胚胎植入过程的示意图。在注射胚胎必须dechorionated和麻醉。然后胚转移至盖玻片底盘和过量的E3蓝被除去。低熔点琼脂用于创建单独的圆顶覆盖每个胚。定向胚胎所以尾部最接近盖玻片。加入琼脂覆盖整个盖玻片前等待两分钟。等到琼脂移动到图像之前固化。（C）的示意图定义的术语被在协议和讨论中使用的Z-间隔，Z堆叠，Z深度，时间间隔，持续时间和5D。 Z-间隔被定义为作为显微镜移动深入样品以创建Z堆叠的每个图像之间的距离。 Z堆叠是全部通过一个拍摄的图像的样品在限定的Z-间隔。在一个Z堆栈行进的距离限定的Z深度。时间间隔是一个时间Z堆栈和下Z堆栈来创建一个隔时图像之间的量。持续时间是时间的用于图像的总量。 5D定义为尺寸X，Y，Z，时间和荧光发射。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. 时间推移成像捕捉在现场斑马鱼胚胎多有丝分裂活动。 （A）从缩小实验时间推移剧照在AB野生型，24 HPF斑马鱼显示多个有丝分裂事件。星号指出致力于实现七项细胞的有丝分裂。 T =以分钟经过的时间。比例尺=5μm以下。（B）中的有丝分裂的CE数在24高倍视野中AB和aurB M / M斑马鱼的尾巴观察LLS。平均值±ST。的开发者，中，n = 3个胚/基因型。（C）的每在AB和aurB 米/细胞总数的有丝分裂的细胞的比例在24高倍视野中号斑马鱼尾巴。平均值±ST。开发，N = 3个胚胎/基因型。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3. 单个细胞分析捕捉每一个有丝分裂期和有丝分裂的持续时间。 （一）从AB野生型的宽视场中选择的单元格， 如图2A所示24 HPF斑马鱼胚胎。 （二）事业部的时间观察AB和aurB M / M 细胞和推断核膜冰川计算akdown（NEB）在缩合染色质在细胞中首先观察到形成了两个新的子细胞。 n = 3的胚胎/基因型，每组66分割为AB，每组为aurB 米/分 29师，*** p值<0.001。（℃）AB的野生型细胞被裁剪可视化通过有丝分裂的阶段级数。 T =分钟。比例尺=5μm的（D）aurB 米/分 细胞被裁剪可视化，通过有丝分裂，其中包括导致胞质分裂失败和微核形成有丝分裂逮捕有丝分裂进程。箭头指向朝微核。 T =以分钟经过的时间。比例尺= 5微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4。单细胞实时成像捕获与染色体分离并司在有丝分裂的突变相关的多个缺陷的有丝分裂 斑马鱼。 （A）进行裁剪缺陷板集合在esco2 + / M胚胎细胞的图像。细箭头监视被拉回到中期板左侧染色体。粗箭头监视不被拉回到中期板和推断以形成微核的权利染色体。双箭头表明，在后期发作没有国会权利染色体的分离。插图显示放大的意见未能国会染色体。插图进行裁剪和亮度，增强了更好的可视化。辗转CAAX荧光更容易地可视化染色体。比例尺= 5微米。（B）裁剪细胞的图像进行有丝分裂逮捕，结果在一个多极师在esco2 + /米胚。比例尺=5μm以下。（C）裁剪导致由线状由托架注意到两个原子核之间拉看出后期桥形成的小区进行凝聚疲劳的图像。比例尺=5μm以下。 T =时间已过分钟。 请点击此处查看该图的放大版本。
电影1。多细胞分裂可以在注射野生型斑马鱼胚胎的宽视野可视化 （右键点击下载）。
电影2.有丝分裂的阶段可以方便地在一个野生型斑马鱼胚胎被可视化 （R 飞行点击下载）。核膜破裂是由核和前进朝向姐妹染色单体板集合的不规则外形推断以形成中期板。发生准确分离，并产生两个新的子细胞。
电影3.实时成像 aurB M / M 胚胎染色体揭示小姐egregation，失败的胞质分裂和微核形成（右键点击下载）。核膜破裂是由原子核的不规则形状推断，染色体分散到相反的两极无法形成正确的中期板，并着手对轴旋转延伸师细胞的时间。胞质中不会发生导致4N细胞和多个微核。
电影4.板集合缺陷在观察 esco2 + /米 胚 （右键点击下载）。核膜破裂是由原子核的不规则形状推断。中期板形成后，几个因迪维杜阿尔染色体分散到两边。而染色体向右保持中期板的外侧，可以看到在后期发作分离姐妹染色单体一个个体染色体到左边最终被拉回到中期板。该电池具有长期分裂的时间，但与潜在的微核形成最终的分歧。
电影5. 多极分裂是在 esco2 + / M 胚胎 观察 （右点击下载）。核膜破裂是由核的不规则外形推断然后染色体合并，以形成Y形indicativ3主轴两极即该电池具有较长时间的划分，但最终分成3子细胞。
电影6. 过早姐妹染色单体分离和后期桥形成在 esco2 M / M 胚胎 中观察到 （右点击下载）。核膜破裂是由核的不规则外形推断然后染色体分散在整个细胞无法形成适当的中期板。染色质decondenses胞质分裂之前和作为细胞分裂，产生两个小区之间的后期桥梁。
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Discussion
该方法的使用允许人们推断核膜破裂，通过微管的着丝点的附件形成中期板的，和姐妹染色单体的分离，以形成在体内和一个时间依赖性两个新的细胞。在斑马鱼中观察到的有丝分裂的能力是在固定的样品和细胞培养系统有利的，因为细胞在自然生理被成像，组织是透明其允许要使用的荧光蛋白质，他们开发比较快，和延时成像可以获取。成年斑马鱼的这个协议的使用是由于可能因被收购到是不是眼睛或皮肤较厚组织有限的Z深度的限制。而可用于同样的目的，通用性和便于与mRNA注射到不同的突变体斑马鱼表达H2A.F / Z-EGFP和mCherry-CAAX的转基因动物是在遗传杂交有利的。在情况下有丝分裂分析在三天后受精（dpf）的或更高的胚胎需要，转基因动物是必要的，因为在这一迅速发展生物体RNA的半衰期。
可视化的有丝分裂的其他荧光蛋白适合进行此协议。例如，H2B-GFP mRNA的是H2A.F / Z-EGFP为染色质的替代，并提供了类似的标记。可以在本技术中使用的其它荧光标记的蛋白包括POM121，中心蛋白，EB1，Hec1和EMTB这将分别允许核膜，中心粒，加结束微管，动粒，和微管的现场中胚成像， 32,47-51。
该协议具有必须执行，以实现高质量的结果几个关键的成像步骤：1）确保优化mRNA的质量和浓度，产生明亮的荧光和无毒性越好。越荧光会导致更少的激光曝光，因此，photoblea少清光毒性和。 2）胚胎必须完全麻醉并在琼脂安全。轻微的动作会改变结果，并可能毁掉实验。 3）对胚胎的阶段所需的要成像的琼脂浓度必须适当。在24高倍视野，并进一步，1％低熔琼脂糖是合适的。如果成像在12 HPF或更早，0.3％的琼脂糖溶液应使用39。 4）在胚胎的投资回报率应尽可能接近盖玻片越好。这个步骤不限制之一成像的尾部。对眼睛，皮肤，背区，蛋黄，和长须鲸倍是可以使用该协议其他领域的例子。
时间是一个分隔成像固定胚胎或组织该协议的决定性因素。当设置Z堆叠，Z-间隔，延时间隔，和延时的持续时间，它要记住的实验中（ 图1C）的情况下是重要的。野生型细胞分裂通常在24 HPF持续约25分钟。在日是例如，覆盖40微米的Z堆叠组织的，具有两小时两分钟的时间间隔为2微米的Z-间隔已证明是有效的。此外，与有缺陷的有丝分裂的胚胎，将细胞在有丝分裂停滞将最有可能存在，显着提高细胞分裂次数。获得多个完整分部，持续时间应增加， 即从2小时至4小时。较长的采集时间会暴露样品更多的激光功率和增加漂白和光毒性的风险。在这种情况下，各Z堆叠之间的时间间隔应该增加。动态染色体运动将通过增加的Z堆叠之间的时间间隔被牺牲，但持续时间被获得。该成像可能会持续两个多小时的细胞分裂时，这是必要的。
虽然它不直接讨论的，该协议可被优化以获得在Z平面的较高清晰度图像更准确地可视个体染色体莫vements。例如，在图4A 2 missegregated染色体中观察到。染色体向右（粗箭头表示）最初是光明和焦点，但在过去的几帧变暗。用2微米的Z区间，所述uncongressed染色体落入在Z间隔之间。捕捉细微的动作和奇异染色体事件可以通过增加在Z平面上的分辨率来实现。要做到这一点，放大使用A1扫描区域工具单个单元格。当设置的Z-Stack参数，使用较小的Z-间隔距离。推荐的范围是0.5 - 1微米。此外，降低每个Z堆栈之间的时间间隔将创建更平滑的过渡每个时间帧之间， 即从两个分钟至30秒- 1分钟。一个警告这种类型的成像的是有限的Z深度可以达到的。由于较小的Z-间隔和时间间隔，多个组织将暴露在较小的时间帧中的激光器。为了克服这个，SM阿列尔持续时间都可以使用;然而，这也依赖于研究者希望多久捕获分裂。
可能与这些更改帮助比喻是想一个Z堆栈作为手风琴。该波纹管的每个褶皱之间的距离为Z间隔及Z深度由手风琴的长度来表示。在这样的情况：人们会不希望累积更多的激光照射到样品，如手风琴延伸（增加了Z深度），波纹管（Z-间隔）的褶之间的距离必须增加。逆是在如手风琴合同真，Z深度减小。波纹管合同的褶，以及，对应于在Z-间隔的减少。这种类比可以应用于固定的和活的样品。当时间被添加到方程复杂在此协议增加。有时间的手风琴可以扩展或收缩手风琴有限的。这represenTS的时间间隔。为了覆盖更多的距离（Z深度）的时间间隔必须增加。同时，为了听到更多的音乐，你必须听时间（持续时间）较长量在该协议中的条款，以见证更多的细胞分裂，持续时间必须增加。要记住一个复利因素是，被打的更多的音乐，越累的手风琴。这类似于最终尺寸，荧光。的多个激光曝光给出样品，越漂白和光毒性（疲劳）成为一个问题。
总之，这个协议详细可视化有丝分裂在适用于不同的分析活斑马鱼胚胎的方法; 1）划分数量2）划分时间3）分工的命运和4）高分辨率的染色质动态。用于可视化的有丝分裂成分从微管的着丝点附件中心粒动力学多种可能性可以适用。相结合的能力在与在斑马鱼的基因组编辑的最新进展体内显像有丝分裂将可以很容易地产生在有丝分裂的各个方面的突变体人类疾病在脊椎动物生物体25,26,52-56建模。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCS2 vectors | Gift from K. Kwan | For plasmid of interest | |
| NotI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3189S | For restriction digest of plasmid |
| mMessage SP6 kit | Life Technologies | AM1340 | For in vitro transcription |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | For purifying mRNA |
| 100 x 15 mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | For housing embryos |
| microinjection mold | homemade | For holding embryos during microinjection | |
| Agarose II | Amresco | 0815-25G | For embedding embryos |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521-10G | For anesthetizing embryos |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M7506 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Methylene Blue Hydrate | Sigma-Aldrich | MB1 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| 100 mm culture tube | Fisher Scientific | 50-819-812 | For melted agar |
| 35 mm glass coverslip bottom culture dish | MatTek Corp | P35G-0-20-C | No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos |
| #5 tweezers | Dumont | 72701-D | For dechorionating embryos |
| 21 G 1 1/2 gauge needle | Becton Dickinson | 305167 | For positioning embryos in agar |
| Dissecting microscope | Nikon AZ100 | For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do | |
| Confocal microscope | Nikon A1+ | For time-lapse imaging | |
| Confocal software | NIS Elements AR 4.13.00 | For image acquisition and processing |
References
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