Abstract
La mitosis es fundamental para el crecimiento y la diferenciación del organismo. El proceso es altamente dinámico y requiere ordenó eventos para llevar a cabo la condensación de la cromatina adecuada, la unión a microtúbulos del cinetocoro, la segregación de cromosomas, y la citocinesis en un marco de tiempo pequeño. Los errores en el delicado proceso puede dar lugar a enfermedades humanas, incluyendo defectos congénitos y cáncer. Los enfoques tradicionales que investigan estados de enfermedad mitótico humanos a menudo se basan en los sistemas de cultivo de células, que carecen de la fisiología natural y contexto de desarrollo / específico de tejido ventajoso en el estudio de enfermedades humanas. Este protocolo supera muchos obstáculos proporcionando una manera de visualizar, con alta resolución, dinámica de los cromosomas en un sistema de vertebrados, el pez cebra. Este protocolo se detallará un enfoque que puede ser utilizado para obtener imágenes dinámicas de células en división, que incluyen: la transcripción in vitro, la cría de pez cebra / recepción, la incrustación de embriones, y la imagen de lapso de tiempo. Optimización y modificaciones de este protocolo también se exploran. Usando H2A.F / Z-EGFP (etiquetas de la cromatina) y mCherry-CAAX (etiquetas de membrana celular) embriones de ARNm de inyección, la mitosis en AB de tipo salvaje, hi1045 auroraB, y hi2865 ESCO2 se visualiza pez cebra mutante. Alta resolución de imágenes en vivo en el pez cebra permite observar mitosis múltiples para cuantificar estadísticamente defectos mitótico y el momento de la progresión mitótico. Además, se observó la observación de aspectos cualitativos que definen los procesos indebidos mitótico (es decir, defectos congression, missegregation de cromosomas, etc.) y los resultados cromosómicas inadecuada (es decir, la aneuploidía, poliploidía, micronúcleos, etc.). Este ensayo se puede aplicar a la observación de tejido diferenciación / desarrollo y es susceptible al uso del pez cebra mutante y agentes farmacológicos. La visualización de cómo los defectos en la mitosis conducen al cáncer y los trastornos del desarrollo será de granmejorar la comprensión de la patogénesis de la enfermedad.
Introduction
La mitosis es un proceso celular esencial crítica para el crecimiento, la diferenciación y la regeneración en un organismo vivo. Tras la preparación exacta y la replicación del ADN en la interfase, la célula se prepara para dividirse. La primera fase de la mitosis, la profase, se inicia por la activación de la ciclina B / Cdk1. Profase se caracteriza por la condensación de material de cromatina en los cromosomas. rotura de la envuelta nuclear se produce en la transición entre la profase y prometaphase. En prometaphase, los centrosomas, el centro de nucleación para la formación del huso, comienzan a migrar hacia los polos opuestos mientras extiende los microtúbulos en busca de la unión cinetocoro. Tras la unión, las conversiones hasta final de microtúbulos en el apego y las fuerzas de tensión se orientan los cromosomas que forman una placa de la metafase 1. Si todos los cromosomas están conectados correctamente, el puesto de control conjunto del husillo se satisface, anillos cohesinas que llevan a cabo las cromátidas hermanas juntas se escinden, y los microtúbulos acortar para tirar de la hermanacromátidas hacia los polos opuestos durante la anafase 2,3. La fase final, la telofase, implica el alargamiento de la célula y la reforma de la envoltura nuclear alrededor de los dos nuevos núcleos. La citocinesis completa el proceso de división separando el citoplasma de las dos nuevas células hijas 4-6. La alteración de las principales vías de la mitosis (es decir, punto de control de ensamblaje del huso, la duplicación del centrosoma, cromátida hermana de cohesión, etc.) Puede resultar en la detención de la metafase, missegregation de cromosomas, y la inestabilidad genómica 7-10. En última instancia, los defectos en las vías de mitosis control pueden causar trastornos del desarrollo y el cáncer, que requiere la visualización de la mitosis y de sus defectos en una, vertebrado, organismo multicelular vivo 10-16.
embriones de pez cebra sirven como un gran organismo modelo para la formación de imágenes en vivo debido al tejido transparente, facilidad de microinyección, y el desarrollo rápido. El uso de pez cebra, el objetivo general de este manuscrito esdescriben un método de 5D en vivo (dimensiones X, Y, Z, el tiempo y longitud de onda) de formación de imágenes de mitosis 17 (Figura 1C). El uso de pez cebra mutante defectuoso en diferentes vías mitóticas demostrar la consecuencia de tales defectos. Para este protocolo, Aurora B y ESCO2 mutantes fueron elegidos para ilustrar estos defectos. Aurora B es una quinasa que es parte del complejo de cromosoma de pasajeros (CPC) que participan en la formación del huso y la unión de los microtúbulos. También se requiere para la formación de división surco en la citocinesis 18,19. En el pez cebra, la deficiencia de Aurora B conduce a defectos en la inducción surco, la citocinesis, y la segregación de los cromosomas 20. ESCO2, por otro lado, es una acetiltransferasa que es esencial para la cohesión de cromátidas hermanas 21,22. Se acetila cohesinas en la porción del anillo SMC3 estabilizando así cohesinas para asegurar correcta segregación cromosómica en la metafase-anafase transición 23. La pérdida de ESCO2 en el pez cebra lleva a chmissegregation romosome, hermana prematura separación de cromátidas, la inestabilidad genómica, y dependiente de p53 y la apoptosis independiente 24,25. Debido a la disponibilidad, hi1045 auroraB, y hi2865 ESCO2 pez cebra mutante (en lo sucesivo, aurB m / my ESCO2 m / m, respectivamente) se utilizará para ilustrar esta técnica 25-27.
Acoplamiento microscopía confocal con maquinaria de la célula fluorescente-tagged ha permitido a los investigadores visualizar dinámica de la cromatina y la membrana celular durante la mitosis 25,28,29. histonas-fluorescentes etiquetadas históricamente se han utilizado para visualizar la cromatina. Las histonas son proteínas nucleares compuestas de cuatro pares diferentes (H2A, H2B, H3, y H4) que son responsables de la estructura del nucleosoma que compone los cromosomas 30. Mientras H2B es sin duda el más utilizado para la histona proteínas fluorescentes enel ratón y el cultivo celular, el uso de la histona 2A, Z Familia (H2A.F / Z) ha demostrado también para su uso en el pez cebra 31,32. Concanavalina A y la caseína quinasa 1-gamma por ejemplo, localizar a la membrana celular y se han demostrado eficaces en la visualización de la membrana celular en erizos de mar y Drosophila 33,34. Otros estudios han demostrado que la proteína fluorescente de etiquetado CAAX etiquetas de la membrana celular y tuvo éxito en el pez cebra 31. CAAX es un motivo que es reconocido por las enzimas de modificación post-traduccionales tales como farnesyltransferases y geranylgeranyltransferases. Las modificaciones de estas enzimas causan las proteínas a ser asociada a la membrana, por lo tanto etiquetar la membrana celular 35.
Debido a la utilización anterior en el pez cebra, este protocolo eligió utilizar H2A.F / Z y CAAX para etiquetar la cromatina y la membrana celular. La aplicación de este método permitirá que el investigador para supervisar la mitosis en el nivel de célula individual para observar cromosoma individuodinámicas, como se monitorean así como simultáneamente múltiples divisiones celulares que pueden impactar en la diferenciación de tejidos y el desarrollo. Este artículo se centrará en la formación de imágenes de la dinámica de la segregación de cromosomas durante la mitosis en el nivel de células individuales. Dentro de este manuscrito, la capacidad de observar varias divisiones mitóticas, calcular el tiempo de división, y descifrar los fenotipos mitóticas se ilustra y se describe. Mediante el uso de estos parámetros, fisiológicamente relevantes de datos pueden ser recogidos y aplicados a varios estados de enfermedad afectados por defectos mitótico.
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Protocol
1. Transcripción in vitro
- Linealizar pCS2-H2A.F / vectores pCS2-mCherry-CAAX Z-EGFP y / o por la restricción NotI digestión con enzimas de 31. El uso de un ARN en el kit de transcripción in vitro, generar 5 'de ARNm de productos tapados de cada plantilla, según el protocolo del fabricante.
- Se purificó el ARNm cubrieron usando un kit de purificación. Siga las instrucciones del fabricante. Eluir con RNasa libre de H 2 O.
- Determinar la concentración de ARN por absorbancia a 260 nm usando un espectrofotómetro. (OD 260 x dilución x 40 g / ml).
- Se diluye la ARN a 100 ng / l para cada H H2A.F / Z-EGFP y mCherry-CAAX con RNasa libre de 2 O. Si la concentración de ARN es demasiado baja, la fluorescencia se verá disminuida o ausente. muestras más brillantes van a disminuir las preocupaciones sobre la fototoxicidad y photobleaching. Por otro lado, el exceso de RNA puede ser tóxico y / o causar efectos fuera de destino.
Nota: Guarde el restantemRNA purificado en -80 ° C congelador.
2. cría de pez cebra, recogida de embriones, y el ARNm de inyección 36-38
- Montar tanques de cría con una barrera para separar el depósito en dos regiones y llenar cada tanque de cría con agua sistema de acuicultura utilizados en las instalaciones de pez cebra.
- Con el fin de prevenir la reproducción prematura, colocar dos peces machos en un lado de la barrera y dos peces hembra en el otro lado de la noche antes de criar.
- Al día siguiente, la mezcla se descongele ARNm preparado previamente en hielo. Reemplazar el agua en los tanques de cría con agua sistema de acuicultura fresco y eliminar las barreras. Inmediatamente después de que las barreras se tira, calentar un molde de inyección de 28,5 ° C y configurar el equipo para la microinyección.
Nota: Para obtener información sobre los moldes de inyección, por favor refiérase a Gerlach 36. - Recoger los huevos cada 10 - 15 min usando un colador de té y enjuagar los huevos en un lugar limpio 100 x 15 mm placa de Petri con E3 azul (5 mM NaCl, KCl 0,17 mM, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4, 10 -5% azul de metileno). E3 azul se utiliza para prevenir el crecimiento de hongos y asegurar el desarrollo adecuado de las larvas de peces. Para obtener más información sobre el apareamiento y la recogida de embriones, consulte Gerlach 36 y 37 Porazinkski.
- Insertar una célula puesta en escena embriones en un molde de inyección calentado e inyectar el ARN en la yema de huevo en la cantidad deseada de embriones (Figura 1A). Cuenta de muerte embrionaria natural y embriones fertilizados mediante la realización de inyecciones embrionarias, el 15% más embriones de los necesarios para el experimento. Para detalles adicionales sobre la microinyección de embriones de pez cebra, por favor refiérase a Gerlach 36 y 37 Porazinkski.
NOTA: Para el primer uso del ARNm, realizar un análisis de dosis-curva para determinar la dosis óptima para la fluorescencia y la viabilidad (definida como ausencia de defectos en el desarrollo brutos de hasta 5 dpf) antes de la realización de imágenes 5D. 150-200 ng / linyecta en embriones es a menudo la concentración óptima, por lo tanto es un buen punto de partida para la concentración final. - extraer cuidadosamente los embriones inyectados desde el molde utilizando un 9 "pipeta Pasteur de vidrio modificado. Para modificar la pipeta, fundir el extremo usando un mechero Bunsen hasta que se forme una bola.
- Colocar los embriones inyectados en una placa de Petri de 100 x 15 mm en el E3 azul y la casa en una incubadora a 28,5 °.
- Seis horas después de la inyección, eliminar cualquier embriones muertos o no fecundados de las placas y añadir limpia E3 azul. La casa de los embriones a 28,5 ° C.
3. Preparación e incrustación de embriones de pez cebra en vivo de la Imagen (Figura 1B)
- Dos horas antes de exponer, defender los embriones inyectados para GFP usando un microscopio de disección fluorescente. Lugar luminoso embriones que expresan GFP verdes en un nuevo 100 x 15 mm placa de Petri con E3 azul.
- Hervir una solución madre de 1% de agarosa de baja fusión mediante la adición de 1 g de baja fusión de agarosa a 100 ml de azul E3. Después de usar la agarosa, cubrir el matraz con papel de aluminio. La solución madre sigue siendo útil para un máximo de un mes.
- Alícuota 3 ml del agar derretido en un tubo de cultivo de 17 x 100 mm. Mantener caliente el agarosa al colocar el tubo de cultivo en un baño de agua a 42 ° hasta que esté listo para su uso. Preparar una solución de 15 mM tricaína en agua desionizada para anestesiar a los embriones de pez cebra 36.
NOTA: Si se desea formación de imágenes en los puntos de tiempo anteriores, la concentración de agar se puede disminuir tan bajo como 0,3% 39. - Llevar el Tricaína 15 mM, embriones seleccionados, agarosa de bajo punto de fusión en, E3 azul, y un cubreobjetos de vidrio cultivo de fondo placa de 35 mm a un microscopio de luz disección. Retirar con cuidado corion del embrión con # 5 pinzas. Haga esto por tres embriones.
- Colocan los embriones dechorionated en un recipiente separado para ser anestesiados. La tapa de la placa cubreobjetos parte inferior se utiliza a menudo para este propósito. Usando una pipeta de transferencia, añadir tres gotas (aproximadamente 150 l)Tricaína de 15 mM para el plato de 5 ml E3 azul (si se utiliza la tapa de la placa inferior cubreobjetos) o hasta que los embriones han sido suficientemente anestesiado. Además, añadir 3-4 gotas (aproximadamente 150 a 200 l) de solución 15 mM tricaína al tubo de agarosa fundida al 1%.
- Con una pipeta P200 con 1 cm de la punta de la pipeta de corte; transferir los embriones anestesiados al plato cubreobjetos de fondo. Eliminar cualquier exceso de E3 azul: solución Tricaína.
- Añadir lentamente 5 - 10 l de agarosa bajo punto de fusión: solución tricaína en los embriones, manteniendo cada gota separada para asegurar que los embriones no accidentalmente la deriva cerca uno del otro.
Advertencia: Si la agarosa es demasiado caliente, se puede dañar el embrión. Una buena temperatura para mantener el agar a es 42 ° C. - Utilizando una aguja de 1 ½ 21 G, orientar suavemente el embrión en la agarosa a la posición deseada. Cuando se utiliza un microscopio invertido para obtener imágenes de lapso de tiempo, orientar la región de interés (ROI) tan cerca del cubreobjetos como possibLe.
Nota: Para propósitos generales, la región de la cola ofrece facilidad de orientación y claridad debido al tejido relativamente delgada (Figura 1A). Otros tejidos, tales como la capa epitelial que rodea a los pliegues de la yema y de la aleta, se pueden utilizar 28,29. Estos tejidos ofrecen una gran claridad, sin embargo, estas regiones son sólo unas pocas capas de células de espesor. Para los fines de este protocolo, es beneficioso para la imagen de la región de la cola de adquirir como de muchas divisiones celulares como sea posible. - Deje pasar unos minutos para la solidificación parcial del agar. Utilice la aguja para romper un pequeño trozo de agar para probar su solidificación. Cuando una pieza de agar se separó de la caída, proceder al siguiente paso.
- Cubrir todo el cubreobjetos con la formación de agar de fusión bajo una cúpula sobre los embriones embebidos. Dejar que el agar se solidifique antes de mover el plato para formación de imágenes confocal (Figura 1A).
- Durante el proceso de solidificación agar (tarda aproximadamente 10 min), preparar 3 ml of solución E3 azul con cinco gotas de (250 l aproximadamente) Tricaína 15 mM a ser colocado sobre los embriones incorporados durante la exploración.
4. 5D Imagen confocal de embriones de pez cebra en vivo 40,41
NOTA: Ver Ariga 40 y O'Brien 41 para obtener detalles sobre cómo realizar imágenes 5D utilizando otros sistemas confocal. Para Z-intervalo, pila Z, Z-profundidad, intervalo de tiempo, y las definiciones 5D véase la Figura 1C.
- Abra el software de imagen y establecer el microscopio 60X ND 1.4 lente objetivo. Aplicar aceite de inmersión de la lente del objetivo y coloque la placa de cultivo en el soporte de diapositivas sobre la platina del microscopio. Utilizando el controlador de eje, centrar el embrión de interés por encima de la lente objetivo y llevar la lente del objetivo hacia arriba para cubrir la placa de cultivo.
- Haga clic en el icono del ocular y cambiar el filtro de GFP en el microscopio. Centrarse en el retorno de la inversión. Centrándose en el tejido más cercano a la cubreobjetos se offer los mejores resultados de imagen.
- Retire el enclavamiento. Seleccionar los canales de GFP y mCherry (longitudes de onda preestablecidas en el software) y establecer la línea de opciones a la normalidad promedio.
- Use "Controles Vista / Adquisición / A1 área de escaneado" comando para abrir la herramienta A1 área de escaneado.
- Empezar a escanear. Utilizando el eje controlador, coloque el embrión de manera que el área de escaneado se llena con la mayor cantidad de pez cebra como sea posible. La potencia del láser no tiene que ser óptima en este punto. Bajar la potencia del láser para evitar photobleaching innecesaria.
- Utilice la opción "Controles Vista / Adquisición / adquisición ND" comando para abrir el panel de control de adquisición de ND.
- Iniciar la exploración para establecer los parámetros Z-stack. Establecer el límite superior de Z-pila para que las células no están en foco y el límite inferior a la que las células ya no son visibles. Permitir un espacio 3 m por encima de la muestra para el crecimiento y el movimiento celular, que puede expandirse en el campo de la imagen. El Z-pila para las cifras que se muestran en este proProtocolo cubrió una Z-profundidad de 40 m en la cola del embrión.
- Ajuste el tamaño de paso-Z intervalo de 2 micras. En promedio, una célula es 10 m de diámetro; por lo tanto, 2 micras producirá cinco intervalos de datos de imagen para ser analizados para cada celda.
NOTA: La profundidad de la imagen que puede ser adquirida depende del intervalo Z. Resolución Z se sacrificó para ganar profundidad total en la dimensión Z con el fin de imagen tantas células en mitosis como sea posible (Z gran profundidad). El inverso es cierto, en el que, al disminuir el tamaño de paso, la resolución Z se gana, mientras que la profundidad Z se sacrifica (pequeña Z-profundidad). - Ajustar la potencia de imagen por láser, HV, y compensar los niveles. Para los experimentos demostraron en este protocolo, utilice la siguiente potencia del láser, HV, y compensar los niveles establecidos en los planos correspondientes, respectivamente, para el canal de GFP; 2-5, 120-140, y -9 a -11. Para el canal mCherry, utilice la siguiente potencia del láser, HV, y compensar los niveles, respectivamente; 3-6, 120-140, y -3 a-8. Una vez establecidos los parámetros, apague el escáner láser para evitar la exposición innecesaria que puede causar fototoxicidad y photobleaching de la muestra.
- Seleccione el icono de promedio línea de 2x. "No promediado" produce una imagen granulada, mientras que "la línea 4x promedio" aumenta drásticamente el tiempo de exploración. Utilización de promedios línea 2x proporciona la mejor calidad de imagen y menor tiempo de exploración.
- Seleccione la duración del intervalo de tiempo y el tiempo apropiado necesario para el experimento. Por divisiones de tipo salvaje, los intervalos de tiempo de dos minutos durante 2 horas es lo mejor para la determinación de la duración mitótico (utilizado en las figuras 1, 2, 3A y 3B). Divisiones que activan el punto de control de ensamblaje del huso durante más de 30 min son más adecuados para intervalos de cinco minutos durante cuatro horas con el fin de preservar la fluorescencia como se ha demostrado en la Figura 3C.
- Marque la casilla "guardar en el archivo" y el nombre del archivo para guardar automáticamente el archivo, ya que se está adquiriendo. Vuelva a comprobar todos los paparáme- se establecen correctamente y pulsa "Iniciar la ejecución".
- Después de la adquisición se haya completado, para ver el archivo en un formato tridimensional, haga clic en el icono del umbral de volumen.
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Representative Results
La Figura 2 demuestra la capacidad de observar muchas divisiones celulares utilizando un campo de visión amplia de un tipo salvaje de cola de pez cebra AB. Más de siete células mitóticas se crean imágenes en un marco de tiempo de 14 min (Película 1). Dentro del transcurso de tiempo de dos horas, se capturaron más de 40 eventos de la mitosis. En promedio, se observaron 50 células en división en el AB y 30 células que se dividen en aur B m / m embriones (Figura 2B). Para tener en cuenta el número de células fotografiado, la proporción de células mitóticas con el número de células de la imagen impresa se calcula (Figura 2C). Estos datos sugieren que no hay un menor número de células que pasan por la mitosis en las aur B m / m embriones (Figura 2B), pero un menor número de células se toman las radiografías. La capacidad para adquirir un número estadísticamente significativo de eventos tales como esto ayudará en el poder estadístico.
Figura 3 se amplía en esta técnica para incluir la cuantificación de la duración mitótico. Una vez que se adquiere una sesión de lapso de tiempo, una celda individual puede ser analizada por el tiempo pasado en la mitosis con la resolución adecuada con la función de zoom (Figura 3A, B). duración mitótico se calcula contando manualmente el número de intervalos de tiempo ocupan una división celular. El número de intervalos de tiempo se multiplica por el intervalo de tiempo entre cada Z-pila. Por ejemplo, en la figura 3C, la división llevó hasta 12 intervalos de tiempo y el intervalo de tiempo entre cada pila Z fue de 2 min. Por lo tanto, el tiempo de división para esta célula fue de 24 min. El tiempo medio de AB de tipo salvaje división es de 25 min y 58 min para aurB m / m (Figura 3B). Una división de tiempo prolongado como se ve en la aurB m / m sugiere que la asamblea de control de huso no ha sido satisfecha debido a vacas erróneaadjuntos tochore 1,2. Echando un vistazo más de cerca el zoom en embriones de tipo salvaje, cada fase mitótica puede ser distinguido (Figura 3C, Película 2). Además, los defectos mitóticos se pueden observar en el m / m embrión aurB que incluyen detención de la mitosis y citocinesis no resulta en una célula binucleada y posterior formación de un micronúcleo (Figura 3D, Película 3). Esta enfocado en el análisis que muestra defectos mitóticos apoya el aumento del tiempo de la división adquirida en la figura 3B.
Varios otros defectos mitóticos diversa y destinos de células que se pueden encontrar son explorados en la figura 4; demostrado en el ESCO2 + / my ESCO2 m / m embriones. En una ESCO2 + / m embrión, cromosoma movimientos erróneos se capturan y se pueden definir como defecto congressions. congression defectos se producen cuando se hacen adjuntos microtúbulos indebidos. Estos defectos provocan el fracaso de los cromosomas de migrar hacia la placa de metafase. cromátidas hermanas pareadas, en particular identificables en el min 20 y 46, que no han congressed hacia la placa de metafase pueden ser observados por primera vez en el min 14. La anafase inicio separa las cromátidas hermanas alineados en la placa de la metafase, así como los pares de cromátidas hermanas a la derecha, observó en el minuto 50. Además, se observa la formación de micronúcleos posible ya que estas cromátidas hermanas separadas permanecen aislados fuera del núcleo (T = 50, figura 4A, Película 4). En la figura 4B, una división multipolar se visualiza (Película 5). Divisiones multipolares ocurren a menudo debido a la amplificación del centrosoma, pero pueden ocurrir a través de otros medios 42. En la Figura 4C, un m / m celular ESCO2 demuestra inicialmente hermana prematura de cromátidas separatrotación de iones y el husillo 9,43,44. Otro destino de la célula se demuestra en este panel es un puente de la anafase adjuntos en los que no se han resuelto merotelic 45,46. El puente de la anafase puede ser visto por primera vez en el minuto 62. La cromatina aparece prematuramente descondensan mientras la célula está experimentando la citocinesis. Como se produce la citocinesis, el surco de segmentación incide en los cromosomas decondensed y, como ocurre abscisión, tira del material de la cromatina para formar un puente anafase (Figura 4C, Película 6). Aunque no se muestra aquí, con el fin de cuantificar los destinos celulares, registrar todas las divisiones mitóticas en cada cuadro y el tipo de destino de las células que exhiben. Dividir el número de células en cada destino por el número total de divisiones grabadas y se multiplica por 100 para calcular el porcentaje del destino celular.
Figura 1: Esquema del Protocolo de dibujos. (UN) (B) Representación esquemática del proceso de incrustación de embriones. Los embriones inyectados se deben dechorionated y anestesiados. Los embriones se transfieren luego a la placa de cubreobjetos de fondo y se retira el exceso de E3 azul. agar bajo punto de fusión se utiliza para crear cúpulas separadas que cubren cada embrión. Orientar los embriones por lo que la cola es más cercano a la cubreobjetos. Espere dos minutos antes de añadir el agar que cubre todo el cubreobjetos. Espere hasta que el agar se solidifica antes de pasar a la imagen. (C) Dibujo esquemático para definir los términos Z-intervalo, pila Z, Z-profundidad, intervalo de tiempo, tiempo de duración y 5D que se utilizan en el protocolo y la discusión. Z-intervalo se define como la distancia entre cada imagen como el microscopio se mueve más en la muestra para crear un Z-pila. Z-pila es todas las imágenes tomadas a través de unamuestra en el Z-intervalo definido. La distancia recorrida en una pila Z define el Z-profundidad. intervalo de tiempo es la cantidad de tiempo entre una pila Z y la siguiente pila Z para crear una imagen de lapso de tiempo. la duración del tiempo es la cantidad total de tiempo utilizado para la imagen. 5D se define como las dimensiones X, Y, Z, la hora y la emisión fluorescente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. time-lapse de captura múltiples eventos mitóticas en un embrión de pez cebra en vivo. (A) alambiques con lapso de tiempo de un experimento enfocado a cabo en una de tipo salvaje AB, 24 HPF pez cebra que muestra múltiples eventos de la mitosis. Los asteriscos señalan hacia siete células en la mitosis. t = tiempo transcurrido en min. Barra de escala = 5 micras. (B) El número de ce mitóticoLLS observados en AB y aurB m / m colas de pez cebra en 24 HPF. La media ± st. prog., n = 3 embriones / genotipo. (C) La relación de células mitóticas por el número total de células en AB y aurB m / m colas de pez cebra en 24 HPF. La media ± st. prog., n = 3 embriones / genotipo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Análisis de la célula individual Captura Cada fase mitótica y duración mitótico. (A) Una célula seleccionado de la vista de campo amplio de AB de tipo salvaje, 24 hpf pez cebra embrión muestra en la Figura 2A. (B) por división de tiempo se observa para AB y aurB m / m y calculada a partir de células inferir bre envoltura nuclearakdown (NEB) en la primera observación de la cromatina condensada en una célula a la formación de dos nuevas células hijas. n = 3 embriones / genotipo, n = 66 divisiones de AB, n = 29 divisiones para aurB m / m, *** p-valor <0,001. (C) AB célula de tipo natural se recorta para visualizar la progresión de la fase través de la mitosis . t = min. Barra de escala = 5 micras. (D) aurB m / m celular se recorta para visualizar la progresión mitótico través de la mitosis que incluye detención de la mitosis dando lugar a fallo citocinesis y la formación de micronúcleos. Las flechas apuntan hacia la micronúcleos. t = tiempo transcurrido en min. Barra de escala = 5 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4.Única de células vivas de imagen Captura mitótico defectos múltiples asociados con la segregación cromosómica y división en mitótico mutante El pez cebra. (A) Imagen de una célula de someterse a defectos congression en un ESCO2 + / m embrión Un recortada. La flecha fina supervisa el cromosoma izquierda que se tira de nuevo en la placa de la metafase. La flecha gruesa supervisa el cromosoma derecho que no está recogido en la placa de metafase e infirió para formar un micronúcleo. La doble flecha muestra la separación de los cromosomas derecho que no hizo congreso de inicio anafase. El recuadro muestra amplían las vistas de los cromosomas que fallaron en el congreso. Inserciones fueron cosechadas y el brillo mejorados para una mejor visualización. CAAX fluorescencia se eliminó para visualizar los cromosomas con más facilidad. Barra de escala = 5 m. (B) Imagen de una célula A recortada de someterse a la detención mitótica que resulta en una división multipolar en un ESCO2 + / M embrión. Barra de escala = 5 micras. (C) Una imagen recortada de una célula de someterse a la fatiga de cohesión que resulta en la formación de puentes anafase visto por la filiforme tirando entre los dos núcleos observados por los soportes. Barra de escala = 5 micras. t = tiempo transcurrido en min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
1. Película múltiples divisiones celulares pueden ser visualizados en una amplia vista de un embrión de pez cebra con inyección de tipo salvaje (clic derecho para descargar).
Película 2. Fases de la mitosis pueden ser fácilmente visualizados en un embrión de pez cebra de tipo salvaje (r vuelo clic para descargar). Rotura de la envuelta nuclear se infiere por la aparición irregular del núcleo y avanza hacia congression de las cromátidas hermanas para formar una placa de metafase . la segregación precisa se produce y se obtienen dos nuevas células hijas.
3. Película de imágenes en vivo del aurB m / m embrión revela la señorita cromosomaegregation, no citocinesis, y la formación de micronúcleos (clic derecho para descargar). rotura de la envuelta nuclear se infiere por la aparición irregular del núcleo, los cromosomas se dispersan hacia los polos opuestos que no pueden formar una placa de metafase adecuada, y proceder a girar sobre el eje que se extiende la división tiempo de la célula. La citocinesis no se produce resulta en una célula 4 N y múltiples micronúcleos.
Se observan defectos de la película 4. congression en un ESCO2 + / m embrión (clic derecho para descargar). Rotura de la envuelta nuclear se infiere por la aparición irregular del núcleo. Después de que se forma la placa de la metafase, unos pocos indicromosomas indivi- dispersan a uno y otro lado. Uno de los cromosomas individuales a la izquierda es finalmente recogido en la placa de metafase mientras que el cromosoma de la derecha se queda fuera de la placa de la metafase y se puede ver la separación de cromátidas hermanas en el inicio de la anafase. La célula presenta una división de tiempo prolongado, pero se divide en última instancia con la posible formación de micronúcleos.
5. Película división multi-polar se observó en un ESCO2 + / m embrión (clic derecho para descargar). Rotura de la envuelta nuclear se infiere por la aparición irregular del núcleo y luego cromosomas se unen para formar un indicativ en forma de Ye de polos 3-husillos. La célula presenta una división de tiempo prolongado, pero en última instancia, se divide en 3 células hijas.
6. Película hermana prematura separación de cromátidas y la formación de puentes anafase se observan en un archivo / m embrión ESCO2 m (clic derecho para descargar). Rotura de la envuelta nuclear se infiere por la aparición irregular del núcleo y luego cromosomas se dispersan por toda la célula incapaz de formar una placa de la metafase adecuada. La cromatina decondenses antes de la citocinesis y como la célula se divide, crea un puente anafase entre las dos células.
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Discussion
El uso de este método permite inferir ruptura nuclear sobre, formación de una placa de la metafase por adjuntos microtúbulos del cinetocoro, y segregación de las cromátidas hermanas para formar dos nuevas células en vivo y de una manera dependiente del tiempo. La capacidad de observar la mitosis en el pez cebra es ventajoso sobre muestras fijadas y sistemas de cultivo celular, porque las células están siendo fotografiado en la fisiología natural, el tejido es transparente, que permite para las proteínas fluorescentes para ser utilizados, se desarrollan relativamente rápido, y la imagen de lapso de tiempo pueden ser adquiridos. Uso del pez cebra adulto para este protocolo está restringido debido a la limitada profundidad Z que pueden ser adquiridos por el tejido más grueso que no es la piel o los ojos. Mientras que los animales transgénicos que expresan H2A.F / Z-EGFP y mCherry-CAAX podrían ser utilizados para el mismo propósito, la versatilidad y facilidad de las inyecciones de ARNm en diferentes pez cebra mutante es ventajoso sobre los cruces genéticos. En situaciones en las que el análisis es mitóticorequerido en tres días después de la fertilización (dpf) o embriones posteriores, serían necesarios animales transgénicos debido a la vida media de ARN en este organismo de rápido desarrollo.
Otras proteínas fluorescentes para la visualización de la mitosis son susceptibles de este protocolo. Por ejemplo, H2B-GFP mRNA es una alternativa a H2A.F / Z-EGFP para la cromatina, y proporciona etiquetado similar. Otras proteínas fluorescentes etiquetado que se pueden utilizar en esta técnica incluyen POM121, centrin, Eb1, Hec1, y EMTB lo que permitiría en vivo de formación de imágenes in-embrión de los microtúbulos envoltura nuclear, centríolos, además de gama, cinetocoro, y los microtúbulos, respectivamente 32,47-51.
Este protocolo tiene varias etapas de formación de imágenes clave que deben ser ejecutadas para lograr resultados de calidad: 1) Asegúrese de que para optimizar la calidad y la concentración de ARNm para producir la fluorescencia más brillante y sin toxicidad posible. Cuanto más fluorescencia conducirá a una menor exposición al láser y por lo tanto, menos photobleaChing y fototoxicidad. 2) El embrión debe estar completamente anestesiado y seguro en el agar. movimientos menores alterarán los resultados y podría arruinar el experimento. 3) La concentración de agar debe ser apropiado para desea ser fotografiado la etapa de embrión. A las 24 HPF y, además, el 1% de agarosa de bajo punto de fusión es adecuado. Si las imágenes a las 12 HPF o más temprano, una solución de agarosa al 0,3% se debe utilizar 39. 4) La ROI en el embrión debe ser lo más cerca del cubreobjetos como sea posible. Este paso no se limita a un solo imágenes de la cola. Los ojos, la piel, la región dorsal, la yema, y el pliegue de aleta son ejemplos de otras áreas que pueden utilizar este protocolo.
El tiempo es el factor determinante que separa este protocolo a partir de embriones o tejidos de imagen fija. Al configurar la pila Z, Z-intervalo, intervalo de lapso de tiempo, y la duración de lapso de tiempo, es importante tener en cuenta el contexto del experimento (Figura 1C). Una división de las células de tipo salvaje por lo general tiene una duración aproximada de 25 min a 24 HPF. en THEs ejemplo, un intervalo de Z-2 micras que cubre 40 micras de tejido en una pila Z, con un intervalo de tiempo de dos minutos durante dos horas ha demostrado ser eficaz. Además, en los embriones con mitosis defectuoso, las células en una detención mitótica más probable es que presente, aumentando drásticamente los tiempos de la división celular. Para adquirir múltiples divisiones completas, la duración de tiempo se debe aumentar, es decir, de 2 hr a 4 hr. Un tiempo de adquisición más largo expondrá la muestra a más potencia del láser y aumentar el riesgo de photobleaching y fototoxicidad. En este caso, el intervalo de tiempo entre cada Z-pila debe ser aumentado. el cromosoma movimientos dinámicos serán sacrificados al aumentar el intervalo de tiempo entre Z-pilas, pero se gana tiempo de duración. Esto es necesario cuando se generan imágenes divisiones celulares que pueden durar más de dos horas.
A pesar de que no fue discutido directamente, este protocolo se puede optimizar para obtener una imagen de mayor resolución en el plano Z para visualizar con mayor precisión el cromosoma mo individuovimientos. Por ejemplo, en la figura 4A se observan dos cromosomas missegregated. El cromosoma hacia la derecha (indicada por la flecha gruesa) es inicialmente luminoso y en foco, pero se atenúa en los últimos fotogramas. Con un intervalo de Z-2 micras, el cromosoma uncongressed cae entre el Z-intervalo. La captura de los movimientos de hora y los eventos de cromosomas singulares se pueden lograr mediante el aumento de la resolución en el plano Z. Para ello, hacer zoom en una celda individual con la función A1 área de escaneado. Al configurar los parámetros de la pila de Z, utilizar una menor distancia Z-intervalo. Un rango recomendado es de 0,5 - 1 micra. Además, disminuyendo el intervalo de tiempo entre cada pila Z creará transiciones más suaves entre cada marco de tiempo, es decir, a partir de dos min a 30 seg - 1 min. Una advertencia de este tipo de imágenes es el Z-profundidad limitada que se puede alcanzar. Debido al intervalo de Z-intervalo y de tiempo más pequeño, más tejido se expone a los rayos láser en un marco de tiempo más pequeña. Para superar esto, smAller duración de tiempo puede ser utilizado; sin embargo, esto depende también del tiempo que el investigador desea capturar divisiones.
Una analogía que puede ayudar con estas modificaciones es pensar en una pila Z como un acordeón. La distancia entre cada pliegue del fuelle es el Z-intervalo y el Z-profundidad está representada por la longitud de la acordeón. En un caso en que uno no desea acumular más la exposición al láser a la muestra, como los tramos de acordeón (aumenta la profundidad Z), la distancia entre los pliegues del fuelle (Z-intervalo) debe aumentar también. El inverso es cierto en que a medida que los contratos de acordeón, el Z-profundidad disminuye. Los pliegues del fuelle contrato, así, que corresponde a una disminución de la Z-intervalo. Esta analogía se puede aplicar a muestras fijadas y en vivo. La complejidad se incrementa en este protocolo cuando se añade tiempo a la ecuación. Hay una cantidad limitada de tiempo que el acordeonista puede extender o contraer el acordeón. este represents el intervalo de tiempo. Con el fin de cubrir más distancia (Z-profundidad) el intervalo de tiempo debe aumentar. Además, con el fin de escuchar más música, uno debe escuchar para que una mayor cantidad de tiempo (tiempo de duración) En términos de este protocolo, con el fin de presenciar más divisiones celulares, el tiempo de duración debe aumentar. Un factor agravante a tener en cuenta es que cuanto más música que se toca, más cansado del acordeonista. Esto es análogo a la dimensión final, de fluorescencia. La exposición más láser se da la muestra, más photobleaching y fototoxicidad (cansancio) se convierte en un problema.
En resumen, este protocolo detalla un método para visualizar la mitosis en una embrión de pez cebra en vivo aplicable a diferentes análisis; 1) número de la división 2) por división de tiempo 3) el destino división y 4) dinámica de la cromatina de alta resolución. Múltiples posibilidades para la visualización de los componentes de la mitosis que van desde los archivos adjuntos a los microtúbulos del cinetocoro a CENTRIOLAR dinámicas se pueden aplicar. La combinación de la capacidad dela mitosis imágenes in vivo con los recientes avances en la edición del genoma en el pez cebra hará que sea más fácil de generar mutantes en diversos aspectos de la mitosis para modelar enfermedades humanas en un organismo vertebrado 25,26,52-56.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCS2 vectors | Gift from K. Kwan | For plasmid of interest | |
| NotI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3189S | For restriction digest of plasmid |
| mMessage SP6 kit | Life Technologies | AM1340 | For in vitro transcription |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | For purifying mRNA |
| 100 x 15 mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | For housing embryos |
| microinjection mold | homemade | For holding embryos during microinjection | |
| Agarose II | Amresco | 0815-25G | For embedding embryos |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521-10G | For anesthetizing embryos |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M7506 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Methylene Blue Hydrate | Sigma-Aldrich | MB1 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| 100 mm culture tube | Fisher Scientific | 50-819-812 | For melted agar |
| 35 mm glass coverslip bottom culture dish | MatTek Corp | P35G-0-20-C | No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos |
| #5 tweezers | Dumont | 72701-D | For dechorionating embryos |
| 21 G 1 1/2 gauge needle | Becton Dickinson | 305167 | For positioning embryos in agar |
| Dissecting microscope | Nikon AZ100 | For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do | |
| Confocal microscope | Nikon A1+ | For time-lapse imaging | |
| Confocal software | NIS Elements AR 4.13.00 | For image acquisition and processing |
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