Abstract
バフ尾のマルハナバチ蜂のようなジェネラリスト花粉媒介、 セイヨウオオマルハナバチは 、彼らは植物の開花から集める花の蜜に栄養素や毒素の両方が発生しました。ごく少数の研究では、食品中の毒素に向かってミツバチの味覚応答を記載しており、これらの実験は、拘束ミツバチ上の口吻拡張応答を主に使用してきました。ここでは、新しい行動アッセイは栄養素や毒素に、個々の労働者マルハナバチを自由に移動の送り応答を測定するために提示されています。このアッセイは、各熊蜂が摂取溶液の量を測定し、食品中の味物質が摂食行動の微細構造にどのように影響するかを識別します。
ソリューションは、以前に2-4時間飢餓状態にされた個々のマルハナバチにマイクロキャピラリーチューブに提示されています。動作は、デジタルビデオで撮影されます。摂食行動の微細構造を連続的proboの位置を採点することによって分析されますイベントロギングソフトウェアを使用してビデオ録画からSCIS（口器）。吻の位置は、3つの異なる行動のカテゴリによって定義される：（1）吻状部が拡張され、溶液と接触し、（2）吻が拡張されているが、溶液（3）吻状部に接触してヘッドの下に収納されていません。さらに、溶液から離れて後退吻の速度も推定されています。
溶液の容量が消費本アッセイでは、摂食発作の数、送り発作の持続時間と最初の接触後の吻の後退速度がphagostimulatoryまたは試験化合物の抑止活性を評価するために使用されます。
この新しい味アッセイは、研究者が蜜で見つかった化合物は、ミツバチの摂食行動にどのように影響するかを測定するために、また、受粉生物学者、毒物学者や熊蜂の味覚系を研究neuroethologistsに有用であろうことができます。
Introduction
植物花粉媒介の相互作用は複雑です。花粉媒介者は食料として蜜や花粉を得るために花を訪問します。今度は、花粉媒介者は、植物で有性生殖を促進します。この関係は、主に共生ですが、花の蜜や花粉は時々毒素または他の植物化合物1-5を含んでいます これは花粉媒介に害を与えることができます。蜜や花粉におけるこのような化合物の存在のための生態学的な根拠は、すべての設定では明確ではありません。この分野における一つの未解決の問題は、ミツバチなどの花粉媒介が毒素を含む蜜と花を検出し、回避することができる方法です。
熊蜂の種、 セイヨウオオマルハナバチ （リンネ、1758）は、毒素6を含有するもの産蜜を含む多くの植物種の花を訪れジェネラリスト授粉です。マルハナバチで24時間二選択アッセイ7毒素の高濃度を含有するかかるソリューションを回避することが示されています。このアッセイTiedeken ら食物消費を7は 、ミツバチが溶液中苦味化合物を検出することができることを明らかにしました。しかし、このアッセイはまた、この時間間隔8-10にわたって摂食行動に影響を及ぼす可能性があり、このような倦怠感などの後処理食物摂取プロセスから味を区別することができませんでした。
ミツバチは、化合物11-13を検出するために彼らのアンテナ、口器とtarsusの複数形の味覚感覚器を有しています。口先の伸展反射（PER）実験は、ハーネス内の個々の蜂を拘束してから送り反射14-17を生成するためにハチの触角感覚器を刺激することを含みます。ミツバチは、個々のハーネスに拘束した後、化合物18,19を味わうする能力のアッセイとして送り反射を生成するように刺激することができます。その他は、毒素9,20にアンテナや口器の感度を研究するためにPERアッセイを変更しました。しかし、ハチを利用する時の応力にさらされます。これがどのように影響を与える可能性が彼らは、化合物21に応答します。
ここでは、新しいアッセイは9とミツバチ（ ミツバチ ）とマルハナバチに対して毒性10（ マルハナバチをスクロースおよびキニーネ、以前に抑止力であると報告されているアルカロイドにマルハナバチを自由に移動の行動味の応答を評価することが記載されていますマルハナバチ ）7、22。キニーネは、植物の蜜で発見されていないが、このアルカロイドは、多くの場合、ハチ7,9,12,13,22における行動や生理学的研究における嫌悪刺激として使用されています。この方法は、試験溶液との最初の口吻の接触の間に大きな解像度でマルハナバチ」口器をビデオ録画することを含みます。具体的には、摂食応答の微細構造は、連続的に2分間隔で動作を採点することによって検査されます。消費された溶液の量は、給餌期間中に測定されるので、食べる食物の量の微細構造と相関させることができます摂食行動。また吻後退の速度が能動的回避の指標として測定されるので、事前摂食検出。
Protocol
1.コロニー、飢餓時代からミツバチをキャプチャ
注：ここで説明する実験は、 セイヨウオオマルハナバチのオーダックスとニューカッスル大学、英国で行われました。複数の（2-3）、商業的に購入したコロニーは、治療ごとに使用しました。コロニーは、実験室条件一定の暗闇の中で（25±2℃、28±2％RH）でのベンチ上で維持されており、ミツバチ収集花粉や糖溶液自由摂取させました。
- 終了すると、捕獲されたことが1ハチのためだけに十分な長さの植民地に門を開いた後、穴のあいたプラスチック製の栓でプラスチックバイアル（7センチ、2.8センチメートル内径）を使用して、個々の労働者マルハナバチを収集します。
- 実験の前に、個別にプラスチックバイアルに2-4時間、すべてのマルハナバチを餓死し、完全な暗闇の中で、室温で保管してください。
2.ホールディングチューブ、Hにミツバチを転送abituationフェーズ
- 飢餓期間の後、保持管にプラスチックバイアルから直接熊蜂を転送します。溶融により内部の固定;：先端に掘削さ4ミリメートルの穴とスチールメッシュ（高さ30ミリメートル8ミリメートルベース）の作品で、;：保持管は、修正された15ミリリットルの遠心分離管（直径17ミリメートル119ミリメートル長）であり、加熱された解剖スチール針とチューブのプラスチック。
- 歯科用ワックスとポリスチレンホルダーにマルハナバチを含む保持管を修正しました。保持管の両側に段ボールの2作品を修正します。これは実験に干渉する可能性がある視覚刺激からミツバチを保護することです。
- 5センチメートル保持管の先端の上にデジタル顕微鏡カメラを配置し、互換性のあるノートパソコンにカメラを接続します。
- 少なくとも保持筒先端の最初の18 mmは、ビデオフレーム内にあるように保持管を調整します。実験の前に、3分間の馴化期間を開始します。
3。事前テストフェーズ：スクロースのドロップを提示
- ショ糖溶液（〜3.5μlを、脱イオン水に溶解し500mMのスクロース）の液滴を含むメスアダプタにシリンジを接続します。吻の延長をやる気にさせる保持管の先端部の内部のショ糖を提示します。
- ショ糖液滴を消費するために5分まで熊蜂を与えます。液滴が消費されない場合は、実験からマルハナバチを削除します。
- 馴化期間後に録画を開始します。本研究では、吻活性は、26.7フレーム/秒-1 25X倍率とで記録しました。
4.テストフェーズ：テストソリューションを提示します
- 試験溶液に100μlのマイクロキャピラリーチューブを埋めます。シリコンチューブ（6センチの長さ、内径1ミリメートル）の作品にそれを接続し、マイクロマニピュレーターにそれを修正。
- 別のシリコンチューブにオスアダプタを介してチューブを接続します（6センチの長さ、内径4ミリメートル）、WHIchがピペットの電球として機能します。
- 5〜10ミリメートル離れて保持管の先端からマイクロキャピラリーチューブを置きます。静かにマイクロキャピラリーチューブの先端の供給溶液を維持するためのチューブを絞ります。
- 熊蜂はショ糖液滴を消費した後、すぐに500mMのスクロース溶液を含む注射器を取り外します。
- 2分間の試験フェーズを開始するとき熊蜂の口吻接点マイクロキャピラリーチューブ内の溶液。
- 、可能な蒸発を制御スクロース又は水との2の追加のマイクロキャピラリーチューブを記入し、テスト段階中のように正確にそれを操作します。
- 各試験の前と後の食料消費（ 図4A）の量を測定するために600dpiでスキャナを使用して、マイクロキャピラリーチューブ内の液体のレベルをスキャンします。
5.画像の解析
- ImageJの（バージョン1.48）、画像PROCを用いて溶液の消費量を決定しますソフトウェアをディエッサー。
- 画像ファイルをアップロードした画像（〜400％）に拡大します。基準縮尺を設定するには、直線ツールを選択し、マイクロキャピラリー管の両端の間に線を引きます。その後、「設定スケール ''を分析する」を選択します。入力「既知の距離」と「長さの単位」の下で、対応するユニットの下でチューブの長さの合計。
- 再び直線ツールを選択し、液面の両端の間に線を引きます。その後、「メジャー ''を分析する」を選択します。結果ウィンドウでは、液体の長さは、「長さ」列の下に与えられています。
- 式を用いて溶液の消費量を計算します。
どこ
微小管の長さであり、そして
そして
微小管の長さであり、そして
そして6.ビデオ分析
- イベントロギングソフトウェアを使用して、各動画の2分のテスト段階摂食行動スコア（ 材料表を参照してください）。
- まず、摂食行動（ すなわち要素）レコーディングソフトウェアの行動のクラスメニューのを定義します。以下のように摂食行動は、次のとおりです。 、吻が延びており、マイクロキャピラリーチューブ内の溶液と接触していない（3）（2）を吻/非接触テングはマイクロキャピラリーチューブ内の溶液と接触して延びており、（1）/接点を口先ありません口吻は収納：口吻が延長されるのではなく、頭（4）視力のうち下収納：熊蜂は、ビデオフレームの外にあります。
- 各動作を設定プロパティメニューの「状態」と「相互に排他的」などと2分間隔の連続録音を行います。より精度のためにスローモーションモード（2倍遅い）で動画を再生します。
- モーショントラッキング・映像ソフトを使用して（ここに示されているビデオ録画で37.5ミリ秒で区切られた）2つの連続するフレーム間の最初の接触後の試験溶液から吻後退の速度を測定（ 材料表を参照してください）。
- 動画ファイルをアップロードし、口先最初に接触ソリューションのフレームに進んでください。
- 基準縮尺を設定するには、ラインツールを選択して、ビデオフレーム内のマイクロキャピラリーチューブの幅に線を引きます。右の行にクリックして、「メジャーをキャリブレーション」を選択します。入力毛細管の幅と対応するユニット。
- 「座標系の原点」、次に「イメージ」を選択します。新しいウィンドウで吻の先端をクリックして選択します9; '適用します。
- 手の移動ツールを選択し、右側のビデオフレームに吻の先端をクリックして、「トラックパス」を選択します。次のフレームに移動し、吻の先端に追跡点を再調整します。
- 右側の追跡点をクリックし、「設定」を選択します。 「完全パス」を選択し、測定の下にある「スピード」を選択します。選択して「適用」。スピードが表示されます。
Representative Results
新規なアッセイは、1 Mのショ糖、1 Mショ糖溶液を加えた1mMのキニーネ単独脱イオン水に送り応答を試験するために使用されます。各処置に即時給電応答は、試験溶液、摂食発作の頻度および2分間のテスト段階中に第1の接触の後に離れて、試験溶液から後退吻の速度で吻接触の持続時間を定量することにより決定されます。消費された溶液の体積は、試験段階の後に測定されます。本研究では、フランス人らによる以前の研究に基づいて、5秒の試合基準間隔（ 図1、 補足ファイルを参照してください）を選択しました。抑止力に応答して、 ショウジョウバエにより口吻の後退動作を特徴づけるために5秒のしきい値を使用する25化合物25。したがって、我々は、拡張口吻と溶液との間の連絡先として送り試合を定義されていませんtは5秒以上の接点の不在によって中断します。
スクロースおよび単独の脱イオン水、ショ糖液にキニーネを加えると比較して明らかに彼らは嫌悪物質（ ビデオ図1）を検出した場合、彼らは急速に離れて移動するようマルハナバチによって摂食を阻止します。
この実験では、治療は、テスト段階中吻コンタクトの累積持続時間に有意な影響有する（対数変換データのANOVAを、F 2,31 = 41、p <0.001）。キニーネを含むショ糖との接触時間の累積持続時間が大幅に単独で、スクロース（P <0.001）にではなく、単独で、脱イオン水（P = 0.219）（ 図2）と比較して低減されます。同様に、治療は、対数変換データ、F上のANOVA（送り発作の累積期間に大きな影響を与えます
C 2分布と比較：P = 0.450）。 ;ショ糖を加えたキニーネのための1.10秒、純水用0.80秒、ANOVAにスクロース2.67秒：治療の効果は、最初の触角の接点との間の待ち時間や試験溶液と口吻（中央値の最初の接点に発見されないん対数変換データ、F 2,13 = 0.620、P = 0.550）。 66.7％;スクロースプラスキニーネ：また、試験溶液を味わうために口先を拡張マルハナバチの割合は、スクロース（トリートメントにわたって一定のままで50.0％、イオン交換水：52.2パーセント;二項GLM、C 2分布に比べて乖離度の変化：P = 0.840）。これらの結果を総合すると、アンテナはこのアッセイ中の毒素の検出にマイナーな役割を果たしていることを示唆しています。
別の実験では、長い2分以上の時間にわたってハチをテストする必要があるか否かを調べます。 2分の試験時間と10分の試験期間：ミツバチによって消費される食物の量は、1 Mスクロースまたは2の条件で1 Mショ糖溶液中での1 mMのキニーネでテストされています。両方の処理については、総食物消費量は、試験期間の違いはありません。また、有意な相互作用が試験期間と治療（N = 6の間に発生していない-ログ変換されたデータに13、ANOVA;処置の効果を：F 1,31 = 54.8、P <0.001;試験期間の効果：F 1,31 = 0、P = 0.979;相互作用の効果：F = 0.1、P = 0.457）。要約すると、2分間の試験期間は、マルハナバチこのアッセイにおいて毒性または忌避物質の抑止効果によって消費された食物の合計量に対する溶液の効果を評価するのに十分です。従って、食物消費を測定し、摂食行動を分析することにより、アッセイ中に摂食の微細構造に総食物消費を相関させることが可能です。
図1：摂食アッセイの最初の2分の間にテングザルコンタクト間のレイテンシ期間 1 Mショ糖溶液、1 Mショ糖+ 1 mMのキニーネ溶液および水で各テング接触を分離する時間の遅延期間の密度プロット。 13、10および11ミツバチからの累積データは、それぞれ表されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 </ P>
図2： テングザルの接触持続時間摂食アッセイの最初の2分の間に 1 Mショ糖、1 Mショ糖+ 1 mMのキニーネや水を食べマルハナバチによってテング接触持続時間の密度プロット。サンプルサイズは、図1のように、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：1 Mスクロースに摂食マルハナバチのテングザル活動、1 Mスクロース+ 1 mMのキニーネまたは水 （A）テスト段階（B）の間に供給発作の累積期間送り発作および（C）の周波数スピード。吻の再の最初の接触後の牽引。レタリングは有意差を示す：異なる文字での治療は、P <0.05を示しています。ボックスプロットは、中央値（黒棒）、四分位範囲の1.5内でまだ最低と最高のデータポイント（ウィスカー）と外れ値（円）を表します。サンプルサイズは、図1のように、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：マルハナバチによってキニーネsupresses送りテストフェーズ前後の1 Mスクロースまたは（黒線で示される）1 Mスクロースに加えて1 mMのキニーネ溶液のレベルを示すマイクロキャピラリーチューブの（A）スキャンした画像。それぞれ。 （B）1 Mショ糖の消費、1 Mスクロースに加えて、1mMのキニーネまたは脱イオン水テストフェーズの後マルハナバチによるだけでは。レタリングは有意差を示す：異なる文字での治療は、P <0.001を示します。ボックスプロットは、中央値（黒棒）、四分位範囲の1.5内でまだ最低と最高のデータポイント（ウィスカー）と外れ値（円）を表します。サンプルサイズは、図1のように、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ビデオ図1：（A）に向かってテングザル活動のビデオレコーディング1 Mスクロース 、（B） 1 Mスクロースプラス1 mMのキニーネ及び（C）テストフェイズD / 54233 / Video_figure_1C_Water.m4v "ターゲット=" _ブランク」>脱イオン水。
Discussion
この小説の行動アッセイでは、キニーネはバフ尾のマルハナバチ蜂の供給を阻止することが示されています。水と減少テングの接触時間と給電試合周波数やキニーネが混入ショ糖溶液は、非栄養または潜在的に有毒なソリューションの更なる送りを開始する拒否としてここに解釈されます。キニーネは、それらが消費する溶液の体積を減少させる1 Mショ糖溶液、マルハナバチないだけに追加されると、それらはまた、このように口器と毒素を含む溶液との接触時間を減少させる、高速吻状部を後退させます。一緒に、これらの結果は、すでに以前にミツバチ9で識別されるキニーネが、熊蜂の口器に味覚受容体細胞によって認識されることを示唆しています。キニーネは、マラリア蚊（ ハマダラカ ）23でミツバチ10とノックダウンに倦怠感のような挙動を誘発する昆虫のための毒素です。このアッセイはよくidentificatにつながる可能性マルハナバチで口器に味覚受容体細胞によって認識されているいくつかの抑止力と潜在的に有毒な化合物のイオン。
微小管は試験段階を通じて持続する試験溶液の十分量で充填されることが重要です。マイクロキャピラリーチューブ（ 例えば 70〜80マイクロリットル）の少なくとも周りの四分の三が満たされることをお勧めします。しかし、ケアは完全スキャンの処理中に流出のリスクを軽減するために、マイクロキャピラリーチューブを記入し、実験装置にマイクロキャピラリーチューブを装着しないように注意しなければなりません。実験者は、保持管に液滴を漏れることを回避するように、マルハナバチへの500mMショ糖液滴を提示するときのケアにも注意が必要です。
保持管の先端の4ミリメートルの穴は自然に試験溶液に向かってその口吻を拡張するために大人ワーカーマルハナバチ蜂のための十分な大きさです。しかし、可能性がありますマルハナバチは、彼らのproboscisesを拡張する前に、それらのアンテナで溶液を味わうことができます。 PERは、糖液15とのアンテナを刺激することにより、マルハナバチにおいて誘発することができたので、これは口吻拡張の確率に影響を与える可能性があります。実際には寄生蜂（Trissolcus brochymenae）24やミツバチ13のようなハチの触角は、彼らはキニーネのような糖や毒素を味わうすることができ、味の感覚器が装備されています。その結果、キニーネのような高度な抑止力の化合物を含む溶液との最初の触角の連絡先は、その口吻を拡張するために熊蜂のモチベーションを低下させるため、実験的な成功率に影響を与える可能性があります。試験溶液と触角の接触を制御することはできませんが、本研究では、我々は試験溶液に向けて口吻の延長上に触角接触の任意の有意な効果を見つけることができませんでした。このアッセイでは、すぐ前のテスト段階ワット後にマイクロキャピラリーチューブを設定しますマルハナバチ」のアンテナは、保持チューブ内に残っている鶏は自分のアンテナをもつ試験溶液を味わうマルハナバチの機会を減らすことができます。
モーショントラッキングのビデオソフトウェアを使用して、第1の口先の接触後の試験溶液から離れて口吻の後退を追跡するとき、このアッセイの主な制限が生じます。ビデオ映像は吻の2次元の動きを表示するので、速度計測の与えられた出力は、下または過大評価することができます。しかし、いくつかの変更を加えて、アッセイのこの側面を向上させることができました。
このアッセイは、天然の植物二次代謝産物を含む種々の化合物を含有する溶液に向けて自然摂食応答を観察するために使用することができます。このアッセイと直接送り応答を観察することマルハナバチは、これらの化合物を検出する方法に関する詳細な情報を提供します。これはPER 18,19のような既存の「行かない-noが行く」の方法よりも有利で す、7 2択アッセイオーバー。
同時にいくつかのパラメータを測定することは、化合物の嗜好性をよりよく評価することができます。我々のアッセイの例では、マルハナバチは、水またはキニーネが混入ショ糖ソリューションを消費しません。テングの後退は、糖受容体細胞12,13の応答の変化によって発生する可能性があります。私たちのアッセイは、マルハナバチが水単独よりもショ糖を加えたキニーネのソリューションを接触させた後に速く口吻を撤回することを示しています。これは、キニーネがニューロン9,12,13,25を感知砂糖を阻害することに加えて、ニューロンの別個のセットに影響を与えることを示唆している可能性があります。
私たちのアッセイは、給紙時の行動応答の時間的パターンの分析を可能にします。消費時間と発作の数が測定された同様のプロトコルは、アルがあります準備は栄養と非栄養糖26にショウジョウバエの摂食応答を評価するために実施されて。私たちは、ミツバチが保持管21に自由に動くことができるので、ミツバチは、PERなどの他の方法に比べて我々のアッセイにおける摂食刺激に、より信頼性の高い応答を示すであろうと予測しています。この技術は、栄養素やマルハナバチ、潜在的に他の蜂種を送り込むのメカニズムを照明する毒素のための味覚閾値の徹底的な分析を可能にします。
Disclosures
著者らは、利害の対立を宣言しません。
Acknowledgments
この作品は、リーバーヒューム信託の助成金（RPG-2012から708）とGAWにBBSRCの助成金（BB / M00709X / 1）によって賄われていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bumblebee colonies | Koppert Biological Systems | NATUPOL Beehive | |
| Digital microscopic camera | Dino-lite Europe | AM4815ZT | Dino-Lite Edge |
| 100 μl microcapillary tube | Blaubrand IntraEND | 709144 | |
| 15 ml polypropylene centifuge tube | Fisher Scientific | 11849650 | |
| 1 ml disposable plastic luer slip syringe | BD | 300013 | |
| Dell Latitude 3550 laptop | Dell | Check for compatibility with video software | |
| Canon CanoScan LiDE 120 | Canon | Check for compatibility with the computer/laptop | |
| Observer software version 5.0.25 | Noldus | ||
| Kinovea software version 0.8.15 | Kinovea | ||
| silicone tubing | 6 cm length, 1 mm inside Ø & 6 cm length, 4 mm inside Ø | ||
| Male luer x1/16" standard hose barbed polypropylene adapter | Cole-Parmer | TW-45518-22 | |
| Female luer x 1/16" standard hose barbed polypropylene adapter | Cole-Palmer | TW-45508-12 | |
| Steel mesh | 0.5 mm mesh size | ||
| Sucrose (grade II) | Sigma-Aldrich | S5391 | |
| Quinine hydrochloride dihydrate | Sigma-Aldrich | Q1125 | |
| ImageJ software version 1.48 | ImageJ |
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