Abstract
Generalist pollinatörer som buff-tailed humla, Bombus terrestris, möter både näringsämnen och gifter i blomster nektar de samlar in från blommande växter. Endast ett fåtal studier har beskrivit smak svaren från bin mot gifter i mat, och dessa försök har huvudsakligen använt snabel förlängning svar på återhållsamma honungsbin. Här är en ny beteendeanalys som presenteras för att mäta matnings svaren från fritt rörliga, enskilde arbetstagaren humlor till näringsämnen och gifter. Denna analys mäter mängden lösning intas av varje humlan och identifierar hur tastants i livsmedel påverkar mikrostrukturen hos ätbeteende.
Lösningarna presenteras i en microcapillary rör enskilda humlor som tidigare har svalt för 2-4 timmar. Beteendet fångas på digital video. Finstrukturen av matningsbeteende analyseras genom att kontinuerligt scoring positionen för ProboSCI (mundelar) från videoinspelningar med hjälp av händelseloggning programvara. Positionen för den snabel definieras av tre olika beteendekategorier: (1) snabel utvidgats och i kontakt med lösningen, är (2) snabel förlängas, men inte är i kontakt med lösningen och (3) snabel är stuvat under huvudet. Vidare hastigheten på snabel upprullnings bort från lösningen är också uppskattat.
I föreliggande analys volymen av lösning som konsumeras, antalet utfodring bouts, är varaktigheten av matnings skjutningarna och hastigheten på snabel tillbakadragning efter den första kontakten används för att utvärdera phagostimulatory eller den avskräckande aktiviteten hos de testade föreningarna.
Den nya smaken analys gör det möjligt för forskarna att mäta hur föreningar som finns i nektar påverka ätbeteende av bin och kommer också att vara till nytta för pollinering biologer, toxikologer och neuroethologists studerar humlan smak system.
Introduction
Växt-pollinerande interaktioner är komplexa. Pollinerare besöker blommor för att få nektar och pollen som livsmedel; i sin tur, pollinatörer underlättar sexuell reproduktion i växter. Även om detta förhållande är mestadels mutualistisk, blommor nektar och pollen innehåller ibland toxiner eller andra växtämnen 1-5 som kan skada pollinerare. Den ekologiska grunden för närvaron av sådana föreningar i nektar och pollen är inte klart i alla inställningar. En kvarstående fråga inom detta område är hur pollinerare såsom bin kan upptäcka och undvika blommor med nektar som innehåller toxiner.
Humlan art, mörk jordhumla (Linnaeus, 1758), är en generalist pollinerare som besöker blommorna av många växtarter, inklusive de som producerar nektar innehåller toxiner 6. Humlor har visats undvika att konsumera lösningar innehållande höga koncentrationer av toxiner i en 24 tim två valsanalysen 7. denna analysfödointag beskrivs av et al. Tiedeken 7 visade att bin kan upptäcka bittra föreningar i lösningar. Men denna analys kunde inte skilja smak från post ingestive processer såsom illamående som också kan påverka ätbeteende under detta tidsintervall 8-10.
Bin har smaksensilla på sina antenner, mundelar och tarsi att upptäcka föreningar 11-13. Snabel förlängning reflex (PER) experiment innebär hållande enskilda bin i en sele och sedan stimulera biets antenn sensilla att producera matnings reflex 14-17. Bin kan begränsas i enskilda selar och sedan stimuleras att producera matnings reflex som en analys av deras förmåga att smaka föreningar 18,19. Andra har ändrat per analys för att studera känsligheten hos antenner eller mundelar för gifter 9,20. Men bin utsätts för stress under utnyttja. Detta kan påverka hurde reagerar på föreningar 21.
Här är en ny analys beskrivs att bedöma beteende smak respons fritt rörliga humlor till sackaros och kinin, en alkaloid som tidigare har rapporterats vara avskräckande 9 och giftiga 10 till honungsbin (Apis mellifera) och humlor (Bombus terrestris) 7, 22. Även kinin inte har hittats i växt nektar, denna alkaloid ofta används som en obehaglig stimulans beteendemässiga och fysiologiska studier i bin 7,9,12,13,22. Metoden involverar videoinspelning humlorna 'mundelar vid stor upplösning under den initiala snabel kontakt med testlösningarna. Närmare bestämt är den fina strukturen av matningssvar undersöktes genom att kontinuerligt scoring beteende under en 2 min intervall. Den volym lösning som förbrukas mäts under utfodringsperioden och så mängden mat som äts kan korreleras med mikrostrukturen hosutfodringsbeteende. Även hastigheten med snabel indragnings mäts, som en indikator av en aktiv undvikande, och därför i förväg ingestive detektering.
Protocol
1. Fånga bin från kolonin och svältperiod
Obs: Experiment som beskrivs här utfördes vid Newcastle University, UK med mörk jordhumla audax. Flera (2-3) kommersiellt köpt kolonier användes per behandling. Kolonierna har hållits på en bänk vid laboratorieförhållanden (25 ± 2 ° C och 28 ± 2% RH) i konstant mörker och matades med honungsbiet samlat pollen och sockerlösningar efter behag.
- Samla enskilde arbetstagaren humlor med hjälp av en plastflaska (7 cm lång, 2,8 cm innerdiameter) med en perforerad plastpropp, efter att ha öppnat porten till kolonin precis tillräckligt länge för ett bi för att avsluta och komma i kläm.
- Före experimentet, individuellt svälta alla humlor för 2-4 timmar i plastflaskor och hålla vid rumstemperatur i fullständigt mörker.
2. Överföra Bin i Holding Rör och Habituation fas
- Efter svält period överför en humla direkt från plastflaska i en anläggning rör. Håll röret är en modifierad 15 ml centrifugrör (längd: 119 mm; diameter 17 mm), med en 4 mm hål borras i spetsen och en bit av stålnät (bas: 8 mm; höjd 30 mm) fixerad inuti genom smältning plasten i röret med en uppvärmd dissekera stålnål.
- Fäst fasthållningsröret innehållande humlan på en polystyren hållare med dental vax. Fix två kartongbitar på vardera sidan av fasthållningsröret. Detta är att skydda biet från visuella stimuli som kan störa experimentet.
- Placera en digital mikroskopisk kamera 5 cm ovanför toppen av hållröret och ansluta kameran till en kompatibel dator.
- Justera hållröret så att åtminstone de första 18 mm av fasthållningsröret tips är inom videobilden. Före experimentet, påbörjas den 3 min tillvänjning period.
3.Pre-testfas: Presentera en droppe av sackaros
- Anslut en spruta till en hona adapter innehållande en droppe av sackaroslösning (~ 3,5 | il, 500 mM sackaros löstes i avjoniserat vatten). Presentera sackaros inuti fasthållningsröret spets för att motivera en förlängning av snabel.
- Ge humlan upp till 5 minuter för att konsumera sackaros droppen. Om droppen inte förbrukas, ta humlan från experimentet.
- Börja videoinspelning efter tillvänjningsperiod. I denna studie var snabel som registrerats på 26,7 bilder / sek -1 med en 25X förstoring hastighet.
4. testfas: Presentation av testlösning
- Fyll en 100 | j, l microcapillary röret med testlösningen. Anslut den till en bit silikonslang (6 cm lång, 1 mm innerdiameter) och fixa det till en mikro manipulator.
- Anslut slangen via en hane adapter till en annan silikonslang (6 cm lång, 4 mm innerdiameter), WHIch fungerar som en pipett glödlampa.
- Placera microcapillary röret 5-10 mm bort från fasthållningsröret spets. Tryck försiktigt på slangen för att bibehålla matningslösningen vid spetsen av microcapillary röret.
- Efter humlan förbrukar sackaros droppen omedelbart avlägsna sprutan innehållande 500 mM sackaros lösning.
- Påbörja 2 min testfasen när humlan s snabel kontakter lösningen inuti microcapillary röret.
- För att kontrollera eventuell avdunstning, fylla två ytterligare microcapillary rör med sackaros eller vatten och manipulera det precis som under testfasen.
- Före och efter varje försök skanna vätskenivåerna inuti microcapillary röret med hjälp av en scanner med 600 dpi för att mäta mängden mat som konsumeras (Figur 4A).
5. Bild Analyser
- Fastställa omfattningen av lösningen förbrukningen med ImageJ (version 1.48), en bild procEssing programvara.
- Ladda bildfilen och zooma in bilden (~ 400%). För att ställa in referensskalan, välj den raka linjen verktyget och dra en linje mellan de två ändarna av microcapillary röret. Välj "Analysera" och sedan "Set Scale". Input den totala längden av röret under "känt avstånd" och motsvarande enhet under "Unit med längden".
- Välj den raka linjen verktyget igen och dra en linje mellan de två ändarna av vätskenivån. Välj "Analysera" och sedan "Mät". I resultatfönstret längden på vätskan ges under "Length" kolumnen.
- Beräkna volymen av lösning förbrukningen genom användning av formeln:
var
är längden på microcapillary röret och 
och
är längden på microcapillary röret och 
och 6. Videoanalyser
- Betyg matnings beteenden under 2 min testfasen av varje video med en händelseloggning programvara (se Material tabell).
- Först definierar matnings beteenden (dvs.. Elementen) i beteende klasser menyn i inspelningsprogrammet. Matnings beteenden är som följer: (1) snabel ut / kontakt: snabel förlänger och är i kontakt med lösningen inuti microcapillary röret (2) snabel ut / ingen kontakt: snabel förlänger och är inte i kontakt med lösningen inuti microcapillary röret, (3) snabel stuvade: snabel förlängs inte utan förvaras under huvudet och (4) utom synhåll: humlan är ur videorutan.
- Ställ in varje beteendesom en "stat" och "ömsesidigt uteslutande" i egenskapsmenyn och göra kontinuerliga inspelningar för en 2 min intervall. Replay videor i slow-motion-läge (2 gånger långsammare) för mer precision.
- Mäta hastigheten av snabel dementi från testlösningen efter den första kontakten mellan två på varandra följande ramar (separerade med 37,5 msek i videoinspelningar som visas här) med en rörelsespårning videoprogram (se Material tabell).
- Ladda upp videofilen och hoppa till den bildruta där snabel första kontakt med lösningen.
- För att ställa in referensskalan, välj linjeverktyget och dra en linje på bredden på microcapillary röret i videorutan. Högerklicka på linjen och välj "Kalibrera åtgärd". Input bredden av kapillärröret och motsvarande enhet.
- Välj "Bild" sedan "koordinatsystem ursprung". I det nya fönstret klickar på toppen av snabel och välj9, Apply ".
- Välj handflyttverktyget, högerklicka på toppen av snabel på videorutan och välj "Track Path". Flytta till nästa ram och justera spårningspunkten till spetsen av snabel.
- Högerklicka på spårningspunkten och välj "Configuration". Välj "Complete Path" och välj "Speed" under mätning. Välj "Apply". Hastigheten visas sedan.
Representative Results
Den nya analysen används för att testa svaren utfodring till en M sackaros, 1 M sackaroslösning plus 1 mM kinin och avjoniserat vatten ensam. De omedelbara utfodring svar på varje behandling bestäms genom att kvantifiera varaktighet snabel kontakter med testlösningen, frekvensen för matnings skjutningarna och hastigheten på snabel upprullnings bort från testlösningen efter den första kontakten under 2 min testperiod. Volymen av lösning som förbrukas mäts även efter testfasen. I denna studie har vi valt en släng kriterium intervall på 5 sekunder (Figur 1, se Kompletterande fil) baserat på tidigare arbete av den franska et al. 25 som använde en 5 sek tröskel för att karakterisera snabel indragning beteende genom Drosophila som svar på avskräckande föreningarna 25. Således, definierade vi en matnings skjutningen som en kontakt mellan de utökade snabel och lösningen intet avbruten av en avsaknad av kontakter 5 sek eller mer.
I jämförelse med sackaros och avjoniserat vatten enbart lägga kinin till sackaroslösning avskräcker tydligen matning av humlor eftersom de snabbt kommer att flytta bort om de upptäcker en aversiv substans (Video Figur 1).
I detta experiment, behandlingarna har en betydande inverkan på den sammanlagda längden på snabel kontakter under testfasen (ANOVA på log-transformerade data, F 2,31 = 41, p <0,001). Den kumulativa varaktigheten av kontakttiden med sackaros innehållande kinin reduceras signifikant i jämförelse med sackaros enbart (p <0,001), men inte till avjoniserat vatten ensamt (p = 0,219) (Figur 2). På samma sätt, de behandlingar som har en betydande inverkan på den sammanlagda längden på utfodring anfall (ANOVA på log-transformerade data, F
c två distributions: p = 0,450). Ingen effekt av behandlingarna finns på latensen mellan de första antenn kontakter och provlösningen och de första kontakterna i snabel (median: 2,67 sek för sackaros, 1,10 sek för sackaros plus kinin, 0,80 sek för avjoniserat vatten, ANOVA på log-transformerade data, F 2,13 = 0,620, p = 0,550). Dessutom förblir andelen humlor sträcker snabel att smaka testlösningen konstant över behandlingarna (sackaros: 66,7%, sackaros plus kinin: 50,0%; avjoniserat vatten: 52,2%; binomial GLM, förändringar i avvikande jämfört med c två distributions: p = 0,840). Tillsammans antyder dessa resultat att antennerna spelar en mindre roll i att upptäcka gifter i denna analys.
Ett separat experiment undersöker huruvida det är nödvändigt att testa bin under en tidsperiod som är längre än två minuter. Mängden mat som konsumeras av bin testas med en M sackaros eller 1 mM kinin i 1 M sackaros lösningar i två villkor: a 2 min testperiod och en 10 minuters testperiod. För båda behandlingarna, inte den totala livsmedelskonsumtion skiljer sig inte för testperioder och inga signifikanta interaktioner inträffar mellan testperioden och behandlingen (N = 6-13, ANOVA på logaritmerade data; effekten av behandlingarna: F 1,31 = 54,8, p <0,001; effekten av testperioden: F 1,31 = 0, p = 0,979; effekten av interaktionen: F = 0,1, p = 0,457). I sammanfattning, ett2 min testperioden är tillräcklig för att bedöma effekten av lösningen på den totala mängden av mat som konsumeras av humlor och den avskräckande effekten av toxiska eller repellerande ämnen i denna analys. Genom att mäta livsmedelskonsumtion och analysera ätbeteende, är det möjligt att korrelera den totala livsmedelskonsumtion till den fina strukturen av matning under analysen.
Figur 1: latensperioder mellan snabel kontakter under de första 2 min för utfodring analys Densitet tomter av tids latenstider mellan varje snabel kontakt med en M sackaroslösning, 1 M sackaros + 1 mM kinin lösning och vatten.. De kumulativa data från 13, 10 och 11 bin representeras respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra. </ P>
Figur 2: Proboscis Kontakttiderna under Första 2 min för matnings Assay Densitets plottar av snabel kontakt löptider genom humlor som livnär sig på en M sackaros, 1 M sackaros + 1 mM kinin eller vatten.. Urvalsstorleken som i figur 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Proboscis aktivitet av Bumblebees livnär sig på en M sackaros, 1 M sackaros + 1 mM kinin eller vatten (A) Den sammanlagda längden på utfodring skjutningarna under testfasen (B) frekvensen av utfodring anfall och (C) hastighet. av snabel redragkraft efter första kontakten. Bokstäver indikerar en signifikant skillnad: behandlingar med olika bokstäver indikerar P <0,05. Boxdiagram representerar medianen (svarta staplar), den lägsta och högsta datapunkter fortfarande inom 1,5 av kvartilavståndet (whiskers) och extremvärden (cirklar). Urvalsstorleken som i figur 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Kinin dämpar utfodring av humlorna (A) skannade bilder av microcapillary rören visar nivån på en M sackaros eller en M sackaros plus 1 mM kinin lösning (visas med en svart linje) före och efter testfasen respektive. (B) Konsumtionen av en M sackaros, 1 M sackaros plus 1 mM kinin eller avjoniserat vatten ensam med humlorna efter testfasen. Bokstäver indikerar en signifikant skillnad: behandlingar med olika bokstäver indikerar P <0,001. Boxdiagram representerar medianen (svarta staplar), den lägsta och högsta datapunkter fortfarande inom 1,5 av kvartilavståndet (whiskers) och extremvärden (cirklar). Urvalsstorleken som i figur 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video Figur 1: videoinspelningar av SNABEL aktivitet mot (A) 1 M sackaros , (B) ett M sackaros Plus 1 mM Kinin och (C)d / 54233 / Video_figure_1C_Water.m4v "target =" _ blank "> avjoniserat vatten under testfasen.
Discussion
Med denna nya beteendeanalys är kinin visat att avskräcka matning av buff-tailed humla. Den reducerade snabel kontakttid och utfodring skjutningen ofta vatten eller sackaroslösning spetsad med kinin tolkas här som en vägran att inleda ytterligare livnär sig på icke-näringsmässiga eller potentiellt giftiga lösningar. När kinin sättes till en M sackaroslösning, humlor inte bara minska volymen av lösningen som de konsumerar, de också dra in snabel snabbare, vilket minskar kontakttiden mellan mouthparts och lösningen innehållande ett toxin. Tillsammans antyder dessa resultat att kinin uppfattas av de smakreceptorceller på mouthparts av humlan, såsom redan tidigare identifierats i honungsbiet 9. Kinin är ett toxin för insekter som inducerar sjukdomskänsla liknande beteende i honungsbiet 10 och knockdown i malariamyggan (Anopheles gambiae) 23. Denna analys kan mycket väl leda till att identificatjon av vissa avskräckande och potentiellt giftiga ämnen som uppfattas av smakreceptorceller på mundelar i humlor.
Det är avgörande för microcapillary röret fyllas med en tillräcklig volym av testlösning för att hålla hela testfasen. Det rekommenderas att åtminstone omkring tre fjärdedelar av microcapillary röret (t.ex. 70-80 l) är fylld. Dock bör försiktighet iakttas för att inte helt fylla microcapillary röret för att minska risken för spill under processen med avsökning och fästa microcapillary röret till den experimentella apparaten. Man bör också tas när man presenterar 500 mM sackaros droppe till humlan, så att försöksledaren undviker läcker droppen i hållarcellen.
4 mm hål vid spetsen av fasthållningsröret är tillräckligt stor för en vuxen arbetare humla naturligt utvidga sina snabel mot testlösningen. Det är dock möjligt atthumlor kan smaka lösningen med sina antenner innan utvidga sina proboscises. Detta kan påverka sannolikheten för snabel förlängning som PER kunde framkallas i humlor genom att stimulera deras antenner med en sockerlösning 15. I själva verket antenner Hymenoptera som parasitsteklar (Trissolcus brochymenae) 24 eller honungsbiet 13 är utrustade med smak sensilla, ger dem möjlighet att smaka socker och gifter som kinin. Följaktligen kunde inledande antenn kontakter med lösningar innehållande mycket avskräckande föreningar som kinin också minska motivationen hos en humla att utvidga sin snabel och därmed påverka den experimentella framgång. Även antenn kontakt med testlösningen inte kan kontrolleras, i denna studie vi inte finna någon signifikant effekt av antenn kontakt på snabel förlängning mot testlösningen. I denna analys omedelbart inrätta microcapillary röret efter förtest fas whöna humlorna "antenner är fortfarande inom fasthållningsröret kan minska möjligheten för humlorna att smaka provlösningen med sina antenner.
Den största begränsningen av denna analys uppstår vid spårning snabel dementi från testlösningen efter den första snabel kontakt med den motion tracking videoprogram. Videofilmer visar endast 2D rörelse av snabel, så den givna utsignalen från hastighetsmätningen kan vara under eller över beräknade. Dock med vissa modifieringar, kan denna aspekt av analysen förbättras.
Denna analys kan användas för att observera naturliga matningssvar mot lösningar innehållande olika föreningar inkluderande naturliga förekommande växt sekundära metaboliter. Beaktande av omedelbara utfodring svar med denna analys ger detaljerad information om hur humlor upptäcka dessa föreningar. Detta är fördelaktigt över befintliga "go-no go" metoder som PER 18,19 7 eftersom denna metod ger flera beteendesvarsåtgärder, inklusive livsmedelskonsumtion under en diskret matning skjutningen.
Mätning flera parametrar samtidigt tillåter en bättre utvärdering av smak av en förening. Till exempel i vår analys, undviker humlor konsumerar vatten eller sackaroslösning spetsad med kinin. Indragning av snabel kan orsakas av en förändring i svaren från sockerreceptorceller 12,13. Vår analys visar att humlor dra snabel snabbare efter kontakt med sackaros plus kinin lösning än enbart vatten; Detta kan tyda på att kinin påverkar en distinkt uppsättning av neuroner förutom att hämma socker avkänning nervceller 9,12,13,25.
Vår analys medger analys av den tidsmässiga mönster av beteendereaktioner under utfodring. Ett liknande protokoll där tidsåtgången och antalet anfall mäts har alredo genomförts för att utvärdera matningssvar Drosophila till närings och icke-närande socker 26. Vi förutspår att bina kommer att uppvisa en mer tillförlitlig svar på utfodring stimulantia i vår analys än i andra metoder såsom PER eftersom bina är fria att röra sig i uppehållsröret 21. Denna teknik kommer att möjliggöra en uttömmande analys av de tröskelvärden smak för näringsämnen och gifter för att belysa mekanismerna för utfodring i humlor och eventuellt andra bee arter.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av Leverhulme förtroende bidraget (RPG-2012-708) och en BBSRC bidrag (BB / M00709X / 1) till GAW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bumblebee colonies | Koppert Biological Systems | NATUPOL Beehive | |
| Digital microscopic camera | Dino-lite Europe | AM4815ZT | Dino-Lite Edge |
| 100 μl microcapillary tube | Blaubrand IntraEND | 709144 | |
| 15 ml polypropylene centifuge tube | Fisher Scientific | 11849650 | |
| 1 ml disposable plastic luer slip syringe | BD | 300013 | |
| Dell Latitude 3550 laptop | Dell | Check for compatibility with video software | |
| Canon CanoScan LiDE 120 | Canon | Check for compatibility with the computer/laptop | |
| Observer software version 5.0.25 | Noldus | ||
| Kinovea software version 0.8.15 | Kinovea | ||
| silicone tubing | 6 cm length, 1 mm inside Ø & 6 cm length, 4 mm inside Ø | ||
| Male luer x1/16" standard hose barbed polypropylene adapter | Cole-Parmer | TW-45518-22 | |
| Female luer x 1/16" standard hose barbed polypropylene adapter | Cole-Palmer | TW-45508-12 | |
| Steel mesh | 0.5 mm mesh size | ||
| Sucrose (grade II) | Sigma-Aldrich | S5391 | |
| Quinine hydrochloride dihydrate | Sigma-Aldrich | Q1125 | |
| ImageJ software version 1.48 | ImageJ |
References
- Adler, L. S. The ecological significance of toxic nectar. Oikos. 91, 409-420 (2000).
- Hagler, J. R., Buchmann, S. L. Honey bee (Hymenoptera, Apidae) foraging responses to phenolic-rich nectars. J Kansas Entomol Soc. 66, 223-230 (1993).
- Irwin, R. E., Cook, D., Richardson, L. L., Manson, J. S., Gardner, D. R. Secondary compounds in floral rewards of toxic rangeland plants: Impacts on pollinators. J Agr Food Chem. 62, 7335-7344 (2014).
- Praz, C. J., Mueller, A., Dorn, S. Specialized bees fail to develop on non-host pollen: Do plants chemically protect their pollen. Ecology. 89, 795-804 (2008).
- Baker, H. G., Baker, I. Studies of nectar-constitution and pollinator-plant coevolution. Coevolution of animals and plants. Gilbert, L. E., Raven, P. H. , University of Texas Press. 100-140 (1975).
- Stout, J. C., Parnell, J. A. N., Arroyo, J., Crowe, T. P. Pollination ecology and seed production of Rhododendron ponticum in native and exotic habitats. Biodivers Conserv. 15, 755-777 (2006).
- Tiedeken, E. J., Stout, J. C., Stevenson, P. C., Wright, G. A. Bumblebees are not deterred by ecologically relevant concentrations of nectar toxins. J Exp Biol. 217, 1620-1625 (2014).
- Ayestaran, A., Giurfa, M., de Brito Sanchez, M. G. Toxic but drank: Gustatory aversive compounds induce post-ingestional malaise in harnessed honeybees. Plos One. 5, (2010).
- Wright, G. A., et al. Parallel reinforcement pathways for conditioned food aversions in the honeybee. Curr Biol. 20, 2234-2240 (2010).
- Hurst, V., Stevenson, P. C., Wright, G. A. Toxins induce 'malaise' behaviour in the honeybee (Apis mellifera). J Comp Physiol A. 200, 881-890 (2014).
- Whitehead, A. T., Larsen, J. R. Electrophysiological responses of galeal contact chemoreceptors of Apis mellifera to selected sugars and electrolytes. J Insect Physiol. 22, 1609-1616 (1976).
- de Brito Sanchez, M. G., et al. The tarsal taste of honey bees: behavioral and electrophysiological analyses. Front Behav Neurosci. 8, 25 (2014).
- de Brito Sanchez, M. G., Giurfa, M., Mota, T. R. D., Gauthier, M. Electrophysiological and behavioural characterization of gustatory responses to antennal 'bitter' taste in honeybees. European Journal of Neuroscience. 22, 3161-3170 (2005).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera). J Comp Psychol. 97, 107-119 (1983).
- Laloi, D., et al. Olfactory conditioning of the proboscis extension in bumble bees. Entomol Exp Appl. 90, 123-129 (1999).
- Smith, B. H., Burden, C. M. A proboscis extension response protocol for investigating behavioral plasticity in insects: Application to basic, biomedical, and agricultural Research. J Vis Exp. , (2014).
- Felsenberg, J., Gehring, K. B., Antemann, V., Eisenhardt, D. Behavioural Pharmacology in classical conditioning of the proboscis extension response in honeybees (Apis mellifera). J Vis Exp. , (2011).
- Pankiw, T., Page, R. E. Effect of pheromones, hormones, and handling on sucrose response thresholds of honey bees (Apis mellifera L.). Journal of comparative physiology. A, Neuroethology, sensory, neural, and behavioral physiology. 189, 675-684 (2003).
- Scheiner, R., Page, R. E., Erber, J. Sucrose responsiveness and behavioral plasticity in honey bees (Apis mellifera). Apidologie. 35, 133-142 (2004).
- Kessler, S. C., et al. Bees prefer foods containing neonicotinoid pesticides. Nature. 521, 74-76 (2015).
- Mommaerts, V., Wackers, F., Smagghe, G. Assessment of gustatory responses to different sugars in harnessed and free-moving bumblebee workers (Bombus terrestris). Chem Senses. 38, 399-407 (2013).
- Chittka, L., Dyer, A. G., Bock, F., Dornhaus, A. Psychophysics: Bees trade off foraging speed for accuracy. Nature. 424, 388 (2003).
- Kessler, S., González, J., Vlimant, M., Glauser, G., Guerin, P. M. Quinine and artesunate inhibit feeding in the African malaria mosquito Anopheles gambiae: the role of gustatory organs within the mouthparts. Physiol Entomol. 39, 172-182 (2014).
- Iacovone, A., Salerno, G., French, A. S., Conti, E., Marion-Poll, F. Antennal gustatory perception and behavioural responses in Trissolcus brochymenae females. J Insect Physiol. 78, 15-25 (2015).
- French, A. S., et al. Dual mechanism for bitter avoidance in Drosophila. J. Neurosci. 35, 3990-4004 (2015).
- LeDue, E., Chen, Y. -C., Jung, A. Y., Dahanukar, A., Gordon, M. D. Pharyngeal sense organs drive robust sugar consumption in Drosophila. Nat. Commun. 6, 6667 (2015).
