Abstract
Generalist Bestäuber wie die buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, stoßen beide Nährstoffe und Giftstoffe in der Blumennektar sie von blühenden Pflanzen zu sammeln. Nur wenige Studien haben die geschmackliche Reaktionen der Bienen zu Toxine in Lebensmitteln beschrieben, und diese Versuche haben in erster Linie die Rüssel Verlängerung Antwort auf verhaltene Honigbienen verwendet. Hier wird ein neuer Verhaltenstest wird zur Messung der Fütterung Antworten von frei bewegenden, einzelne Arbeiter Hummeln auf Nährstoffe und Giftstoffe vorgestellt. Dieser Test misst die Menge der Lösung von jedem bumble bee aufgenommen und zeigt auf, wie tastants in der Nahrung die Mikrostruktur des Fressverhalten beeinflussen.
Die Lösungen werden in einem Mikrokapillarröhre auf einzelne Hummel dargestellt, die für 2-4 Stunden vorher ausgehungert wurden. Das Verhalten wird auf digitalen Video aufgenommen. Die Feinstruktur des Fütterungsverhaltens wird durch kontinuierliches Einkerben der Position des probo analysiertscis (Mundwerkzeuge) von Videoaufzeichnungen Ereignisprotokollierung Software. Die Position des Rüssels von drei verschiedenen Verhaltenskategorien definiert ist: (1) Rüssel ausgefahren und in Kontakt mit der Lösung, (2) Rüssel verlängert, aber nicht in Kontakt mit der Lösung und (3) Rüssel unter dem Kopf verstaut. Weiterhin wird die Geschwindigkeit der Rüssel aus der Lösung Zurückziehen entfernt wird ebenfalls geschätzt.
In dem vorliegenden Test der Lösung das Volumen die Anzahl der Fütterung Anfälle wird die Dauer der Fütterungs Anfälle und die Geschwindigkeit des Rüssels Retraktion nach dem ersten Kontakt verbraucht wird, verwendet, um die phagostimulatory oder die abschreckende Wirkung der getesteten Verbindungen zu bewerten.
Dieser neue Geschmackstest wird den Forschern ermöglichen, zu messen, wie Verbindungen in Nektar das Fressverhalten der Bienen beeinflussen gefunden und wird auch auf die Bestäubung Biologen, Toxikologen und Neuroethologen nützlich sein, die Hummel Geschmack System zu studieren.
Introduction
Plant-Bestäuber-Wechselwirkungen sind komplex. Bestäuber besuchen Blüten Nektar und Pollen als Nahrung zu erhalten; wiederum Bestäuber erleichtern sexuelle Fortpflanzung bei Pflanzen. Während diese Beziehung meist mutualistic ist, Blütennektar und Pollen manchmal Giftstoffe enthalten oder andere Pflanzenstoffe 1-5 die Bestäuber schädigen können. Die ökologische Gründe für das Vorhandensein solcher Verbindungen in Nektar und Pollen ist in allen Einstellungen nicht klar. Eine noch offene Frage in diesem Bereich ist, wie Bestäubern wie Bienen erkennen und vermeiden Blumen mit Nektar enthält Giftstoffe.
Die Hummelarten, Bombus terrestris (Linnaeus, 1758), ist ein Generalist Bestäuber, die die Blüten vieler Pflanzenarten , darunter diejenigen , die Herstellung Nektar besucht enthält Giftstoffe 6. Hummeln wurden in einer 24 - Stunden - zwei-Wahl - Test 7 aufwendige Lösungen , die hohe Konzentrationen von Giftstoffen zu vermeiden gezeigt. Dieser Testder Verzehr von Lebensmitteln von Tiedeken et al. 7 gezeigt , dass Bienen Bitterstoffe in Lösungen erkennen kann. Jedoch war dieser Assay nicht in der Lage Geschmack von post-Ingestiv Prozessen zu unterscheiden , wie Unwohlsein , das auch Fressverhalten über diesem Zeitintervall 8-10 beeinflussen könnten.
Bienen besitzen Geschmacks- sensilla auf ihren Antennen, Mundwerkzeuge und tarsi Verbindungen nachzuweisen 13.11. Der Rüssel - Streckreflex (PER) Experimente beinhalten Zurückhalten einzelner Bienen in einem Gurtzeug und dann der Biene antennal sensilla stimulieren die Fütterung 14-17 Reflex zu erzeugen. Bienen können in einzelnen Geschirre zurückgehalten werden und dann stimuliert die Verfütterung Reflex als Test ihrer Fähigkeit , Verbindungen zu schmecken 18,19 zu erzeugen. Andere haben die pro Assay modifiziert 9,20 die Empfindlichkeit der Antennen oder Mundwerkzeuge , um Giftstoffe zu untersuchen. Allerdings werden die Bienen auf Stress ausgesetzt während nutzbar zu machen. Dies könnte Einfluss darauf, wiesie reagieren 21 auf Verbindungen.
Hier wird ein neuer Test wird beschrieben , um die Verhaltensgeschmacksreaktion von frei beweglichen Hummeln zu Saccharose und Chinin zu beurteilen, ein Alkaloid , das bereits berichtet wurde als Abschreckungsmittel 9 und giftig 10 bis Honigbienen (Apis mellifera) und Hummeln (Bombus terrestris) 7, 22. Obwohl Chinin nicht in Pflanzennektar gefunden worden ist , wird das Alkaloid oft als aversiven Reiz in verhaltensmäßigen und physiologischen Studien in Bienen verwendet 7,9,12,13,22. Das Verfahren beinhaltet das Video der Hummeln "Mundwerkzeuge in großer Auflösung während der anfänglichen Rüssel Kontakt mit den Testlösungen aufnehmen. Insbesondere wird die Feinstruktur des Zuführungs Reaktion kontinuierlich geprüft Verhalten über einen 2 min Intervall erziehlt. Das Volumen der Lösung verbraucht wird, während der Fütterungsperiode gemessen und so die Menge der aufgenommenen Nahrung kann mit der Mikrostruktur von korreliert werdendas Fressverhalten. Auch die Geschwindigkeit des Rüssels Retraktion gemessen wird, als ein Indikator eines aktiven Vermeidungs und daher vorge Ingestiv Detektion.
Protocol
1. Erfassen von Bienen aus der Kolonie und der Hungerperiode
Hinweis: hier beschriebenen Experimente wurden an der Universität Newcastle, Großbritannien mit Bombus terrestris audax ausgeführt. Multiple (2-3) wurden im Handel erworben Kolonien pro Behandlung verwendet. Die Kolonien wurden auf einer Bank im Laborbedingungen gehalten (25 ± 2 ° C und 28 ± 2% RH) in konstanter Dunkelheit und wurden mit Honigbiene gesammelte Pollen und Zuckerlösungen ad libitum gefüttert.
- Sammeln Sie einzelne Arbeiter Hummeln ein Plastikfläschchen mit (7 cm lang, 2,8 cm Innendurchmesser) mit einem perforierten Kunststoff-Stopfen, nachdem das Tor für eine Biene gerade lang genug, um die Kolonie geöffnet zu haben, um zu beenden und gefangen werden.
- Vor dem Experiment, verhungern individuell alle Hummeln für 2-4 Stunden in den Plastikflaschen und bei Raumtemperatur in völliger Dunkelheit zu halten.
2. Übertragung Bienen in die Halterohre und der Habituation Phase
- Nach der Hungerperiode übertragen Eine Hummel direkt aus dem Kunststoffröhrchen in ein Halterohr. Das Halterohr ist eine modifizierte 15-ml-Zentrifugenrohr (Länge: 119 mm, Durchmesser 17 mm), mit einem 4-mm-Loch an der Spitze und ein Stück Stahlnetz (Basis: 8 mm, Höhe 30 mm) gebohrt durch Schmelzen im Inneren fixiert der Kunststoff des Rohres mit einem beheizten Sezieren Stahlnadel.
- Befestigen Sie das Halterohr die Hummel auf einen Polystyrolhalter mit Dentalwachs enthält. Fix zwei Stücke Pappe auf jeder Seite des Halterohrs. Dies ist die Biene von visuellen Reizen zu schützen, die mit dem Experiment stören könnten.
- Positionieren Sie eine digitale mikroskopische Kamera 5 cm oberhalb der Spitze des Halterohrs und schließen Sie die Kamera an einen kompatiblen Laptop.
- Stellen Sie die Halterohr, so dass zumindest die ersten 18 mm des Halterohrspitze innerhalb des Videorahmens ist. Vor dem Experiment, beginnen die 3 min Gewöhnungsperiode.
3.Pre-Test Phase: Geben Sie einen Tropfen Sucrose
- Eine Spritze mit einem weiblichen Adapter ein Tröpfchen von Saccharose-Lösung (~ 3,5 & mgr; l, 500 mM Saccharose in entmineralisiertem Wasser gelöst) enthält. Präsentieren Sie die Saccharose innerhalb der Halterohrspitze die Verlängerung des Rüssels zu motivieren.
- Geben Sie die Hummel bis zu 5 min, um die Saccharose Tröpfchen zu konsumieren. Wenn die Tröpfchen nicht verbraucht wird, entfernen Sie die Hummel aus dem Experiment.
- Beginnen Videoaufzeichnung nach der Eingewöhnungszeit. In dieser Studie wurde die Rüssel Aktivität bei 26,7 Bilder / s aufgezeichnet -1 mit einer Vergrößerungsrate 25X.
4. Testphase: Präsentation der Testlösung
- Füllen Sie ein 100 ul Mikrokapillarröhre mit der Testlösung. Schließen Sie es an einem Stück Silikonschlauch (6 cm Länge, 1 mm Innendurchmesser) und befestigen Sie es an einem Mikromanipulator.
- Den Schlauch über einen Stecker-Adapter zu einem anderen Silikonschlauch (6 cm Länge, 4 mm Innendurchmesser), which fungiert als Pipettenküvette.
- Positionieren Sie den Mikrokapillarröhre 5-10 mm entfernt von dem Halterohr Spitze. Sie vorsichtig den Schlauch drücken die Zulauflösung an der Spitze des Mikrokapillarröhre zu halten.
- Nachdem die Hummel die Saccharose Tröpfchen verbraucht, entfernen Sie sofort die Spritze, die die 500 mM Saccharose-Lösung enthält.
- Beginnen Sie die 2 min Testphase, wenn die Hummel den Rüssel in Kontakt mit der Lösung im Inneren des Mikrokapillarröhre.
- Zur Steuerung für mögliche Verdunstung, füllen zwei zusätzliche Mikrokapillarröhrchen mit Saccharose oder Wasser und manipulieren, um sie genau so, wie in der Testphase.
- Vor und nach jedem Versuch scannen , um die Flüssigkeitsspiegel im Inneren des Mikrokapillarröhre einen Scanner mit 600 dpi unter Verwendung der Menge der Nahrung zu messen verbraucht (4A).
5. Bildanalysen
- Bestimmen Sie die Lösungsvolumen Verbrauch mit ImageJ (Version 1.48), ein Bild procEssing Software.
- Laden Sie die Bilddatei und Zoomen in das Bild (~ 400%). Um die Referenzskala eingestellt, wählen Sie die gerade Linie Werkzeug und eine Linie zwischen den beiden Enden des Mikrokapillarröhre ziehen. Wählen Sie "Analysieren" dann die 'Set-Skala'. Geben Sie die Gesamtlänge des Rohres unter "Bekannte Abstand 'und der entsprechenden Einheit unter" Längeneinheit ".
- Wählen Sie die gerade Linie Werkzeug wieder und eine Linie zwischen den beiden Enden des Flüssigkeitsspiegels ziehen. Wählen Sie "Analysieren" dann "Maßnahme". Im Fenster Ergebnisse die Länge der Flüssigkeit wird unter der "Länge" Säule gegeben.
- Berechnen des Volumens der Lösung Verbrauch unter Verwendung der Formel:
woher
ist die Länge des Mikrokapillarröhre und 
und
ist die Länge des Mikrokapillarröhre und 
und 6. Videoanalysen
- Ergebnis der Fütterung Verhalten während der 2 min Testphase für jedes Video eine Ereignisprotokollierung Software (siehe Materialien Tabelle).
- Zunächst definieren die Fütterungsverhalten (dh. Die Elemente) in der Verhaltensklassen Menü der Aufnahmesoftware. Die Fütterungsverhalten sind wie folgt: (1) Rüssel out / Kontakt: der Rüssel erstreckt und in Kontakt mit der Lösung im Inneren der Mikrokapillare Rohr (2) Rüssel out / kein Kontakt: der Rüssel erstreckt und nicht in Kontakt mit der Lösung im Inneren der Mikrokapillare Rohr, (3) Rüssel verstaut: der Rüssel nicht verlängert wird, sondern unter dem Kopf verstaut und (4) aus den Augen: die hummel aus dem Video-Frame ist.
- Stellen Sie jedes Verhaltenals "Staat" und "sich gegenseitig ausschließen" im Eigenschaften-Menü und kontinuierliche Aufnahmen für ein 2-Minuten-Intervall zu machen. Replay die Videos in Slow-Motion-Modus (2-mal langsamer) für mehr Präzision.
- Messen der Geschwindigkeit des Rüssels Retraktion aus der Testlösung nach dem ersten Kontakt zwischen zwei aufeinanderfolgenden Rahmen (getrennt durch 37,5 msec in den Videoaufnahmen gezeigt) eine Bewegungsverfolgungsvideosoftware (siehe Materialien Table).
- Laden Sie die Video-Datei und fahren Sie mit dem Rahmen, wo die Rüssel ersten Kontakte die Lösung.
- Um die Referenzskala setzen, wählen Sie das Linienwerkzeug und ziehen Sie eine Linie auf die Breite des Mikrokapillarröhre in dem Videoframe. Rechtsklick auf die Linie und wählen Sie "Kalibrieren Maßnahme". Eingangs die Breite des Kapillarrohrs und der entsprechenden Einheit.
- Wählen Sie 'Bild' und dann 'Koordinatensystem Ursprung ". Auf dem neuen Fenster auf der Spitze des Rüssels klicken und wählen Sie9; Anwenden ".
- Wählen Sie das Hand Verschieben-Werkzeug, klicken Sie rechts auf der Spitze des Rüssels auf dem Video-Frame und wählen Sie "Track Path". Gehen Sie zum nächsten Bild und neu einzustellen, um die Spitze des Rüssels den Tracking-Punkt.
- Rechtsklick auf den Spurpunkt und wählen Sie "Konfiguration". Wählen Sie "Vollständiger Pfad" und wählen Sie "Speed" unter Messung. Wählen Sie "Übernehmen". Die Geschwindigkeit wird dann angezeigt.
Representative Results
Der neuartige Test wird verwendet, um 1 M Sucrose, um die Fütterung Antworten zu testen, 1 M Saccharose-Lösung plus 1 mM Chinin und entsalztem Wasser allein. Die direkten Verfütterung Antworten auf jede Behandlung werden durch Quantifizieren der Dauer des Rüssels Kontakte mit der Testlösung, die Frequenz der Zuführung Anfälle und der Geschwindigkeit des Rüssels Zurückziehen von der Testlösung nach dem ersten Kontakt während der 2 min Testphase bestimmt. Das Volumen der Lösung verbraucht wird, auch nach der Testphase gemessen. In dieser Studie haben wir einen Kampf Kriterium Intervall von 5 Sekunden (Abbildung 1, siehe Zusatz Datei) , basierend auf früheren Arbeiten von Französisch et al gewählt. 25 , die eine 5 sec Schwelle verwendet , um den Rüssel Abfahrverhalten von Drosophila charakterisieren als Reaktion auf abschreckende Verbindungen 25. So definiert man einen Futter Kampf als Kontakt zwischen den verlängerten Rüssel und der Lösung nichtt durch ein Fehlen von Kontakten von 5 sec oder mehr unterbrochen wird.
Im Vergleich zu Saccharose und entsalztem Wasser allein, Chinin zu Saccharoselösung Zugabe schreckt offenbar Fütterung von Hummeln , da sie rasch weg bewegen wird , wenn sie einen aversiven Stoff (Video Abbildung 1) zu erkennen.
In diesem Versuch haben die Behandlungen einen signifikanten Effekt auf die Gesamtzeit des Rüssels Kontakte während der Testphase (ANOVA auf die log-transformierten Daten, F 2,31 = 41, p <0.001). Die kumulative Dauer der Kontaktzeit mit Saccharose enthaltenden Chinin signifikant reduziert im Vergleich allein (p <0,001) zu Saccharose , aber nicht zu deionisiertem Wasser allein (p = 0,219) (Abbildung 2). Ähnlich haben die Behandlungen einen signifikanten Effekt auf die Gesamtzeit des Zuführungs Anfälle (ANOVA auf die log-transformierten Daten, F
c 2 -Verteilung im Vergleich: p = 0,450). 1,10 sec für Saccharose und Chinin;; 0,80 sec für VE-Wasser, ANOVA auf die 2,67 sec für Saccharose: Keine Wirkung der Behandlungen auf die Latenz zwischen dem ersten antennal Kontakte und die Testlösung und die ersten Kontakte des Rüssels (Median gefunden log-transformierten Daten, F 2,13 = 0,620, p = 0,550). Darüber hinaus bleibt der Anteil der Hummeln die Rüssel Verlängerung der Testlösung nach Geschmack konstant über die Behandlungen (Saccharose: 66,7%; Saccharose und Chinin: 50,0%; VE-Wasser: 52,2%; binomischen GLM, Veränderung der Devianz im Vergleich zu der c 2 Verteilung: p = 0,840). Zusammen legen diese Ergebnisse nahe, dass die Antennen eine untergeordnete Rolle bei der Erkennung der Toxine in diesem Assay spielen.
Einem getrennten Experiment untersucht, ob es notwendig ist, Bienen für einen Zeitraum zu testen, mehr als 2 min. einen 2 min Testperiode und einer 10-minütigen Testzeitraum: Die Menge der Nahrung von den Bienen verbraucht wird mit dem 1 M Saccharose oder 1 mM Chinin in 1 M Saccharoselösungen in zwei Bedingungen getestet. Für beide Behandlungen, unterscheidet sich nicht für die Testperioden Gesamtnahrungsaufnahme und keine signifikanten Wechselwirkungen zwischen der Testperiode und der Behandlung (n = 6-13, ANOVA auf der log transformierten Daten; Effekt der Behandlungen: F = 1,31 54,8, p <0,001; Wirkung der Testzeitraum: 1,31 F = 0, p = 0,979; Effekt der Interaktion: F = 0,1, p = 0,457). Zusammenfassend a2 min Testperiode ist ausreichend, um die Wirkung der Lösung auf die Gesamtmenge der Nahrung durch Hummeln und der abschreckenden Wirkung von toxischen oder abweisenden Substanzen in diesem Test verbraucht zu beurteilen. Somit ist es durch Messung der Nahrungsaufnahme und Verhalten Testen Einspeisen ist es möglich Gesamtnahrungsaufnahme auf die Feinstruktur des Zuführens während des Assays zu korrelieren.
Abbildung 1: Latenzzeiten zwischen den Rüssel Kontakte während der ersten 2 min des Feeding Assay Dichte Plots der Latenzzeiten Zeit jedes Rüssels Kontakt mit der 1 M Sucrose - Lösung trennt, die 1 M Saccharose + 1 mM Chinin - Lösung und Wasser.. Die kumulierten Daten von 13, 10 und 11 Bienen sind jeweils vertreten. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. </ P>
Abbildung 2: Proboscis Kontakt Dauern während der ersten 2 Min von der Fütterung Assay Dichte Plots der Rüssel Kontaktdauern von Hummeln auf 1 M Saccharose Fütterung, 1 M Saccharose + 1 mM Chinin oder Wasser.. Probengröße wie in Abbildung 1 Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Rüssel Aktivität von Hummeln Fütterung auf 1 M Sucrose, 1 M Sucrose + 1 mM Chinin oder Wasser (A) Die kumulative Dauer der Fütterung Anfälle während der Testphase (B) die Häufigkeit von Schüben und (C) die Geschwindigkeit zugeführt wird . der Rüssel reTraktion nach dem ersten Kontakt. Beschriftung zeigt einen signifikanten Unterschied: Behandlungen mit verschiedenen Buchstaben zeigen P <0,05. Box-Plots stellen den Median (schwarze Balken), die niedrigsten und die höchsten Datenpunkte noch innerhalb von 1,5 des Quartilabstand (Whiskers) und die Ausreißer (Kreise). Probengröße wie in Abbildung 1 Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4:. Chinin Unterdrückt von Hummeln Fütterung (A) Gescannte Bilder der Mikrokapillarröhrchen zeigt den Pegel des 1 M Saccharose oder 1 M Saccharose plus 1 mM Chinin - Lösung (durch eine schwarze Linie) vor und nach der Testphase beziehungsweise. (B) Der Verbrauch von 1 M Saccharose, 1 M Saccharose plus 1 mM Chinin oder entsalztem Wasser allein durch Hummeln nach der Testphase. Beschriftung zeigt einen signifikanten Unterschied: Behandlungen mit verschiedenen Buchstaben zeigen P <0,001. Box-Plots stellen den Median (schwarze Balken), die niedrigsten und die höchsten Datenpunkte noch innerhalb von 1,5 des Quartilabstand (Whiskers) und die Ausreißer (Kreise). Probengröße wie in Abbildung 1 Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Video 1: Videoaufnahmen des Rüssels Aktivität in Richtung (A) 1 M Sucrose , (B) 1 M Sucrose Plus 1 mM Chinin und (C)d / 54233 / Video_figure_1C_Water.m4v "target =" _ blank "> Entionisiertes Wasser während der Testphase.
Discussion
Mit diesem neuartigen Verhaltenstest wird Chinin Fütterung der buff-tailed bumble bee abzuschrecken gezeigt. Die reduzierte Rüssel Kontaktzeit und Fütterung Kampf Frequenz mit Wasser oder Zuckerlösung mit Chinin geschnürt wird hier als Ablehnung interpretiert weiter zu initiieren auf nicht-nahrhaften oder potentiell toxischen Lösungen zuzuführen. Wenn Chinin bis 1 M Saccharose-Lösung hinzugefügt wird, Hummeln reduzieren nicht nur das Volumen der Lösung, die sie verbrauchen, auch sie die Rüssel schneller zurückziehen, so dass die Kontaktzeit zwischen den Mundwerkzeuge und der Lösung reduziert ein Toxin enthält. Zusammen legen diese Ergebnisse nahe , dass Chinin durch die geschmackliche Rezeptorzellen auf den Mundwerkzeuge der Hummel wahrgenommen wird, wie bereits zuvor 9 bei der Honigbiene identifiziert. Chinin ist ein Toxin für Insekten , die Malaise-ähnliches Verhalten bei der Honigbiene 10 und Zuschlag in der Malaria - Mücke (Anopheles gambiae) 23 induziert. Dieser Test könnte auch auf die Bezeichnung Bezeichnung der führenIon einiger abschreckend und potentiell toxischen Substanzen, die von den Geschmacksrezeptorzellen auf den Mundwerkzeuge in den Hummeln wahrgenommen werden.
Es ist entscheidend für die Mikrokapillare Rohr mit einem ausreichenden Volumen der Testlösung gefüllt werden während der gesamten Testphase dauern. Es wird empfohlen, mindestens etwa drei Viertel des Mikrokapillarröhre (zB 70-80 ul) gefüllt ist. Allerdings sollte darauf nicht vollständig auf das Mikrokapillarröhre füllen werden ergriffen, um die Gefahr von Verschütten während des Prozesses des Abtastens und Anbringen des Mikrokapillarröhre der experimentellen Vorrichtung zu reduzieren. Vorsicht ist auch geboten, wenn die 500 mM Saccharose Tröpfchen auf die Hummel präsentiert, so dass der Experimentator vermeidet das Tröpfchen in das Halterohr undicht.
Das 4-mm-Loch an der Spitze des Halterohrs ist groß genug für einen Erwachsenen Arbeiter bumble bee auf natürliche Weise ihre Rüssel in Richtung der Testlösung erweitern. Es ist jedoch möglich, dassHummeln können die Lösung mit ihren Antennen schmecken, bevor sie ihre Rüssel erstrecken. Dies könnte die Wahrscheinlichkeit von Rüssel Erweiterung beeinflussen als PER durch die Stimulierung ihre Antennen mit einer Zuckerlösung 15 in Hummeln hervorgerufen werden könnte. In der Tat die Antennen von Hautflügler wie die Legimmen (Trissolcus brochymenae) 24 oder der Honigbiene 13 sind mit Geschmack sensilla ausgestattet, so dass sie Zucker und Giftstoffe wie Chinin zu schmecken. Folglich anfängliche antennal Kontakte mit Lösungen sehr abschreckend Verbindungen wie Chinin enthält, könnte auch die Motivation einer Hummel reduzieren, um ihre Rüssel verlängern und damit den experimentellen Erfolgsrate beeinflussen. Obwohl antennal Kontakt mit der Testlösung nicht kontrolliert werden kann, in der vorliegenden Studie haben wir keine wesentlichen Auswirkungen von antennal Kontakt auf Rüssel Erweiterung in Richtung der Testlösung zu finden. In diesem Test einrichten, sofort die Mikrokapillarröhre nach dem Pre-Testphase wenn die Hummeln 'Antennen noch innerhalb der Halterohr sind, können die Möglichkeit zu reduzieren für die Hummeln die Testlösung mit ihren Antennen zu schmecken.
Die Hauptbeschränkung dieses Assays entsteht, wenn der Rüssel Retraktion von der Testlösung nach der ersten Rüssel Kontakt Verfolgen der Bewegungsverfolgungs Video-Software. Das Videomaterial zeigt nur 2D-Bewegung des Rüssels, so kann die gegebene Ausgabe der Geschwindigkeitsmessung unter oder über abgeschätzt werden. Jedoch mit einigen Modifikationen, könnte dieser Aspekt des Assays verbessert werden.
mit verschiedenen Verbindungen, einschließlich natürlich vorkommenden pflanzlichen Sekundärmetaboliten Dieser Test kann verwendet werden, um natürliche Fütterung Antworten zu Lösungen beobachten. Die Beobachtung der direkten Verfütterung Antworten mit diesem Test gibt detaillierte Informationen darüber, wie Hummeln diese Verbindungen erkennen. Dies ist von Vorteil gegenüber bestehenden 'go-no go' Methoden wie PER 18,19 7 , da diese Methode bei einer diskreten Fütterung Kampf mehrere Verhaltensreaktion Maßnahmen einschließlich Nahrungsmittelverbrauch produziert.
mehrere Messparameter ermöglicht gleichzeitig eine bessere Beurteilung der Schmackhaftigkeit einer Verbindung. Zum Beispiel in unserem Test, Hummeln vermeiden Wasser verbrauchen oder die Saccharose-Lösung mit Chinin geschnürt. Zurückziehen des Rüssels könnte durch eine Änderung in den Reaktionen der Zuckerrezeptorzellen 12,13 verursacht werden. Unser Test zeigt, dass Hummeln die Rüssel schneller zurückziehen, nachdem die Saccharose und Chinin-Lösung als Wasser allein in Kontakt steht; Dies könnte , dass Chinin schlagen eine Reihe von Neuronen zusätzlich zur Hemmung der Zuckersensorneuronen 9,12,13,25 beeinflusst.
Unser Assay erlaubt die Analyse der zeitlichen Muster der Verhaltensreaktionen während des Fütterns. Ein ähnliches Protokoll, bei dem die Verbrauchszeit und die Anzahl der Zeiträume gemessen hat albereit worden , um die Fütterung Reaktion von Drosophila zu nahrhaften und nicht nahrhaften Zucker 26 zu bewerten , umgesetzt. Wir gehen davon aus, dass die Bienen eine zuverlässigere Reaktion auf Fraßstimulantien in unserem Test als in anderen Verfahren wie PER aufweisen, weil die Bienen 21 frei bewegen kann in dem Halterohr sind. Diese Technik wird eine umfassende Analyse der Geschmacksschwellen erlauben für Nährstoffe und Giftstoffe, die Mechanismen zu beleuchten, der in Hummeln Fütterung und möglicherweise auch andere Bienenarten.
Disclosures
Die Autoren erklären, keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Leverhulme Trust Zuschuss (RPG-2012-708) und einem BBSRC Zuschuss (BB / M00709X / 1) zu GAW finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bumblebee colonies | Koppert Biological Systems | NATUPOL Beehive | |
| Digital microscopic camera | Dino-lite Europe | AM4815ZT | Dino-Lite Edge |
| 100 μl microcapillary tube | Blaubrand IntraEND | 709144 | |
| 15 ml polypropylene centifuge tube | Fisher Scientific | 11849650 | |
| 1 ml disposable plastic luer slip syringe | BD | 300013 | |
| Dell Latitude 3550 laptop | Dell | Check for compatibility with video software | |
| Canon CanoScan LiDE 120 | Canon | Check for compatibility with the computer/laptop | |
| Observer software version 5.0.25 | Noldus | ||
| Kinovea software version 0.8.15 | Kinovea | ||
| silicone tubing | 6 cm length, 1 mm inside Ø & 6 cm length, 4 mm inside Ø | ||
| Male luer x1/16" standard hose barbed polypropylene adapter | Cole-Parmer | TW-45518-22 | |
| Female luer x 1/16" standard hose barbed polypropylene adapter | Cole-Palmer | TW-45508-12 | |
| Steel mesh | 0.5 mm mesh size | ||
| Sucrose (grade II) | Sigma-Aldrich | S5391 | |
| Quinine hydrochloride dihydrate | Sigma-Aldrich | Q1125 | |
| ImageJ software version 1.48 | ImageJ |
References
- Adler, L. S. The ecological significance of toxic nectar. Oikos. 91, 409-420 (2000).
- Hagler, J. R., Buchmann, S. L. Honey bee (Hymenoptera, Apidae) foraging responses to phenolic-rich nectars. J Kansas Entomol Soc. 66, 223-230 (1993).
- Irwin, R. E., Cook, D., Richardson, L. L., Manson, J. S., Gardner, D. R. Secondary compounds in floral rewards of toxic rangeland plants: Impacts on pollinators. J Agr Food Chem. 62, 7335-7344 (2014).
- Praz, C. J., Mueller, A., Dorn, S. Specialized bees fail to develop on non-host pollen: Do plants chemically protect their pollen. Ecology. 89, 795-804 (2008).
- Baker, H. G., Baker, I. Studies of nectar-constitution and pollinator-plant coevolution. Coevolution of animals and plants. Gilbert, L. E., Raven, P. H. , University of Texas Press. 100-140 (1975).
- Stout, J. C., Parnell, J. A. N., Arroyo, J., Crowe, T. P. Pollination ecology and seed production of Rhododendron ponticum in native and exotic habitats. Biodivers Conserv. 15, 755-777 (2006).
- Tiedeken, E. J., Stout, J. C., Stevenson, P. C., Wright, G. A. Bumblebees are not deterred by ecologically relevant concentrations of nectar toxins. J Exp Biol. 217, 1620-1625 (2014).
- Ayestaran, A., Giurfa, M., de Brito Sanchez, M. G. Toxic but drank: Gustatory aversive compounds induce post-ingestional malaise in harnessed honeybees. Plos One. 5, (2010).
- Wright, G. A., et al. Parallel reinforcement pathways for conditioned food aversions in the honeybee. Curr Biol. 20, 2234-2240 (2010).
- Hurst, V., Stevenson, P. C., Wright, G. A. Toxins induce 'malaise' behaviour in the honeybee (Apis mellifera). J Comp Physiol A. 200, 881-890 (2014).
- Whitehead, A. T., Larsen, J. R. Electrophysiological responses of galeal contact chemoreceptors of Apis mellifera to selected sugars and electrolytes. J Insect Physiol. 22, 1609-1616 (1976).
- de Brito Sanchez, M. G., et al. The tarsal taste of honey bees: behavioral and electrophysiological analyses. Front Behav Neurosci. 8, 25 (2014).
- de Brito Sanchez, M. G., Giurfa, M., Mota, T. R. D., Gauthier, M. Electrophysiological and behavioural characterization of gustatory responses to antennal 'bitter' taste in honeybees. European Journal of Neuroscience. 22, 3161-3170 (2005).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera). J Comp Psychol. 97, 107-119 (1983).
- Laloi, D., et al. Olfactory conditioning of the proboscis extension in bumble bees. Entomol Exp Appl. 90, 123-129 (1999).
- Smith, B. H., Burden, C. M. A proboscis extension response protocol for investigating behavioral plasticity in insects: Application to basic, biomedical, and agricultural Research. J Vis Exp. , (2014).
- Felsenberg, J., Gehring, K. B., Antemann, V., Eisenhardt, D. Behavioural Pharmacology in classical conditioning of the proboscis extension response in honeybees (Apis mellifera). J Vis Exp. , (2011).
- Pankiw, T., Page, R. E. Effect of pheromones, hormones, and handling on sucrose response thresholds of honey bees (Apis mellifera L.). Journal of comparative physiology. A, Neuroethology, sensory, neural, and behavioral physiology. 189, 675-684 (2003).
- Scheiner, R., Page, R. E., Erber, J. Sucrose responsiveness and behavioral plasticity in honey bees (Apis mellifera). Apidologie. 35, 133-142 (2004).
- Kessler, S. C., et al. Bees prefer foods containing neonicotinoid pesticides. Nature. 521, 74-76 (2015).
- Mommaerts, V., Wackers, F., Smagghe, G. Assessment of gustatory responses to different sugars in harnessed and free-moving bumblebee workers (Bombus terrestris). Chem Senses. 38, 399-407 (2013).
- Chittka, L., Dyer, A. G., Bock, F., Dornhaus, A. Psychophysics: Bees trade off foraging speed for accuracy. Nature. 424, 388 (2003).
- Kessler, S., González, J., Vlimant, M., Glauser, G., Guerin, P. M. Quinine and artesunate inhibit feeding in the African malaria mosquito Anopheles gambiae: the role of gustatory organs within the mouthparts. Physiol Entomol. 39, 172-182 (2014).
- Iacovone, A., Salerno, G., French, A. S., Conti, E., Marion-Poll, F. Antennal gustatory perception and behavioural responses in Trissolcus brochymenae females. J Insect Physiol. 78, 15-25 (2015).
- French, A. S., et al. Dual mechanism for bitter avoidance in Drosophila. J. Neurosci. 35, 3990-4004 (2015).
- LeDue, E., Chen, Y. -C., Jung, A. Y., Dahanukar, A., Gordon, M. D. Pharyngeal sense organs drive robust sugar consumption in Drosophila. Nat. Commun. 6, 6667 (2015).
