Abstract
מאביקים Generalist כמו הדבורה זנב חובב, בומבוס האדמה, נתקלים בשני חומרים מזינים ורעלים בצוף פרחי שהן גובות לצמחים פורחים. רק מעט מחקרים תארו את תגובות gustatory דבורים לעבר רעלנים במזון, וניסויים אלו משמשים בעיקר את התגובה הרחבה חוטם על דבורי דבש מאופקים. הנה, assay התנהגותיות חדש מוצג למדידת תגובות ההאכלה של-נע בחופשיות, דבורי Bumble עובד פרט מזינים ורעלים. assay זה מודד את כמות פתרון מעובד על ידי כל דבורה ומזהה כיצד tastants במזון להשפיע על מייקרו של התנהגות האכילה.
הפתרונים מוצגים צינור microcapillary לדבורים בומבוס נפרדים מורעב בעבר במשך 2-4 שעות. ההתנהגות היא נתפסה על וידאו דיגיטלי. המבנה העדין של התנהגות האכילה מנותח באופן רציף על ידי הבקיע את עמדת proboscis (איברי פה) מהקלטות וידאו באמצעות תוכנת רישום אירועים. עמדת החוטם מוגדרת על ידי שלוש קטגוריות התנהגותיות שונות: (1) חוטם מוארך במגע עם הפתרון, (2) חוטם מוארך אך לא במגע עם הפתרון ו- (3) החוטם הוא מאוחסן מתחת לראש. יתר על כן את המהירות של החוטם חוזר בה מן הפתרון היא גם מוערכת.
ב assay הנוכחי היקף הפתרון נצרך, מספר התקפי האכלה, משך התקפי האכילה לבין המהירות של הכחשת החוטם לאחר המגע הראשון משמש כדי להעריך את phagostimulatory או פעילות ההרתעה של התרכובות הנבדקות.
assay הטעם החדש זה יאפשר לחוקרים למדוד כיצד תרכובות בצוף להשפיע על התנהגות האכילה של דבורים וגם תהיינה שימושי ביולוגי אבקה, חוקרי רעלים ו neuroethologists לומדים את מערכת הטעם של הדבורה.
Introduction
אינטראקציות הצמח-מאביק הם מורכבים. מאביקים לבקר פרחים להשיג צוף ואבקה כמזון; בתורו, מאביקים להקל רבייה מינית בצמחים. בעוד מערכת היחסים הזו היא בעיקר הדדיות, צוף פרחים ואבקה לפעמים מכילים רעלים או רכיבים אחרים בצמחים, 1-5 אשר יכול לפגוע מאביקים. הרציונל אקולוגי בנוכחות תרכובות כאמור צוף ואבקה לא ברור בכל ההגדרות. שאלה מצטיינת אחת בתחום זה היא איך מאביקים כגון דבורים יכולים לזהות ולהימנע פרחים עם רעלים המכילים צוף.
המין הדבורה, בומבוס האדמה (לינאוס, 1758), הוא מאביק generalist כי מבקר הפרחים של מיני צמחים רבים, כולל אלה צוף לייצר המכילים רעלים 6. דבורי Bumble הוכחו להימנע פתרונות רבים המכילים ריכוזים גבוהים של רעלים ב assay שני-בחירת 24 שעות 7. assay זהמזון צריכה שתארה Tiedeken et al. 7 עולה כי דבורים יכולות לזהות תרכובות מרירות בפתרונות. עם זאת, assay זה לא הצליח להבחין טעם מתהליכים שלאחר ingestive כגון חולים שיכולים גם להשפיע האכלת התנהגות לאורך זמן זה מרווח 8-10.
דבורים להחזיק sensilla התעורר אצלם על האנטנות שלהם, איברי הפה טרסי לזהות תרכובות 11-13. רפלקס רחבת החוטם (PER) ניסויים לערב הרחקת דבורים בודדות ברתמת ולאחר מכן גירוי sensilla המחושים של הדבורה כדי לייצר את ההאכלה רפלקס 14-17. יכולים להיות מרוסנים דבורים רתמות בודד ולאחר מכן מגורה לייצר רפלקס ההאכלה כמו assay יכל לטעום תרכובות 18,19. אחרים שינו את assay PER ללמוד את הרגישות של האנטנות או איברי פה לרעלים 9,20. עם זאת, דבורים חשופים ללחץ במהלך רתימה. זה יכול להשפיע על אופןהם מגיבים תרכובות 21.
הנה, assay חדש מתואר להעריך את תגובת טעם התנהגותיים של בחופשיות-נע דבורי Bumble כדי סוכרוז כינין, אלקלואיד כי דווח בעבר להיות מרתיע 9 ו -10 רעילים דבורי דבש (שהאפיס Apis) ודבורים בומבוס (Bombus terrestris) 7, 22. למרות כינין לא נמצא בצוף צמח, אלקלואיד זה משמש לעתים קרובות גירוי מרתיע במחקרים התנהגותיים ופיסיולוגיים בדבורים 7,9,12,13,22. השיטה כרוכה וידאו הקלטת איברי הפה של הדבורים בומבוס ברזולוציה רבה במהלך מגע החוטם הראשוני עם פתרונות הבדיקה. באופן ספציפי, את המבנה העדין של תגובת ההאכלה נבחן כשקלע ברציפות שנמשכת מזה מרווח 2 דקות. היקף פתרון נצרך נמדד בתקופת האכלה ולכן כמות המזון הנאכל יכול להיות מתואם עם מיקרו שלהתנהגות האכלה. גם את המהירות של ביטול החוטם נמדד, כאינדיקטור של הימנעות פעילה, ולכן זיהוי מראש ingestive.
Protocol
1. לכידת דבורים מהמושבה והתקופה הרעבה
הערה: הניסויים שתוארו כאן בוצעו באוניברסיטת ניוקאסל, בריטניה עם Audax בומבוס האדמה. מושבות מרובות (2-3) לרכוש מסחרית שימשו לכל טיפול. המושבות קויימו על ספסל בתנאי מעבדה (25 ± 2 ° C ו -28 ± 2% לחות יחסית) בחשכה מתמדת ו הואכלו עם כרצונך פתרונות סוכר ואבקת פרחים דבש דבורים שנאספו.
- אסוף העובד היחיד דבורים Bumble באמצעות בקבוקון פלסטיק (7 ס"מ, 2.8 ס"מ קוטר פנימי) עם פקק פלסטיק מחורר, לאחר פתח את השער למושבה רק מספיק זמן בשביל דבורה אחד כדי לצאת ולהיות לכודים.
- לפני הניסוי, בנפרד להרעיב כל הדבורים בומבוס במשך 2-4 שעות ב צלוחיות פלסטיק ולשמור בטמפרטורת החדר בחושך מוחלט.
2. העברת דבורים לתוך צינורות האחזקות לבין Habituation שלב
- לאחר תקופת הרעב, להעביר דבורה ישירות בקבוקון הפלסטיק לתוך צינור החזקה. הצינור מחזיק הוא צינור צנטריפוגות שונה 15 מ"ל (אורך: 119 מ"מ; קוטר 17 מ"מ), עם חור 4 מ"מ קדח בקצה וחתיכת רשת פלדה (הבסיס: 8 מ"מ; מ"מ גובה 30) קבוע בתוך ידי התכה הפלסטיק של הצינור עם מחט פלדה לנתח מחוממת.
- תקן צינור ההחזקה המכיל את הדבורה על בעל קלקר עם שעווה שיניים. תקן שתי חתיכות קרטון משני צדי צינור ההחזקה. זאת על מנת להגן על הדבורה מגירויים חזותיים שעשויים להפריע הניסוי.
- מקם מצלמה מיקרוסקופית דיגיטלית 5 סנטימטרים מעל קצה צינור ההחזקה ולחבר את המצלמה למחשב נייד תואם.
- התאם את צינור ההחזקה כך שלפחות 18 המ"מ הראשון של קצה החזקת הצינור הוא בתוך מסגרת וידאו. לפני הניסוי, להתחיל תקופת התרגלות 3 דקות.
3.שלב טרום מבחן: הצגת טיפת סוכרוז
- חבר מזרק למתאם הנשי המכיל טיפה של תמיסת סוכרוז (~ 3.5 μl, סוכרוז 500 מ"מ מומס במים deionized). הצג את סוכרוז בתוך קצה צינור ההחזקה להניע את הסיומת של החוטם.
- תן הדבורה עד 5 דקות לצרוך אגל סוכרוז. אם אגל אינו נצרך, להסיר את הדבורה מהניסוי.
- בגין הקלטת וידאו לאחר תקופת התרגלות. במחקר זה, פעילות החוטם נרשמה 26.7 מסגרות / sec -1 עם שיעור הגדלת 25x.
4. מבחן שלב: הצגת פתרון המבחן
- מלאו צינור microcapillary 100 μl עם פתרון המבחן. חבר אותו חתיכת צינורות סיליקון (אורך 6 ס"מ, 1 מ"מ קוטר פנימי) ולתקן אותה מניפולטור מיקרו.
- חבר את צינורות באמצעות מתאם זכר צינורות סיליקון אחר (6 ס"מ אורך, 4 מ"מ קוטר פנימי), WHIch משמש נורת פיפטה.
- מקם את מ"מ microcapillary צינור 5-10 הרחק קצה צינור החזקה. יש ללחוץ בעדינות את הצינורות לשמור פתרון ההאכלה בקצה צינור microcapillary.
- לאחר הדבורה צורכת אגל סוכרוז, להסיר לאלתר את המזרק המכיל את תמיסת סוכרוז 500 מ"מ.
- להתחיל את שלב 2 דקות הבדיקה כאשר קשר החוטם של הדבורה הפתרון בתוך צינור microcapillary.
- כדי לשלוט על אידוי אפשרי, למלא שני צינורות microcapillary נוספים עם סוכרוז או מים ולטפל בו בדיוק כמו במהלך שלב הבדיקה.
- לפני ואחרי כל ניסוי לסרוק את רמות נוזל בתוך הצינור microcapillary באמצעות סורק ב 600 dpi כדי למדוד את כמות המזון הנצרך (איור 4 א).
5. ניתוח תמונה
- לקבוע את היקף צריכת פתרון באמצעות ImageJ (גרסה 1.48), גידול proc תמונהessing תוכנה.
- העלה את קובץ התמונה זום לתוך התמונה (~ 400%). כדי להגדיר את היקף ההתייחסות, בחר בכלי קו ישר לצייר קו בין שני הקצוות של הצינור microcapillary. 'ניתוח' בחר ולאחר מכן "סולם גדר". הזן את האורך הכולל של הצינור תחת 'מרחק ידוע' ויחידת המקביל תחת 'יחידת האורך'.
- בחרו בכלי קו ישר שוב למתוח קו בין שני הקצוות של רמת נוזל. 'ניתוח' בחר ולאחר מכן "מדוד". בחלון תוצאות אורך הנוזל ניתן תחת עמודת 'האורך'.
- חשב את נפח הצריכה פתרון באמצעות הנוסחה:
איפה
הוא אורך הצינור microcapillary ו 
ו
הוא אורך הצינור microcapillary ו 
ו 6. ניתוח וידאו
- ציון את הרגלי התזונה במהלך שלב בדיקות 2 דקות של כל וידאו באמצעות תוכנת רישום אירועים (ראה לוח חומרים).
- בתחילה להגדיר את הרגלי התזונה (כלומר. האלמנטים) בתפריט כיתות התנהגותיים של תוכנת הצריבה. התנהגויות ההאכלה הן כדלהלן: (1) חוטם החוצה / קשר: החוטם מרחיב ונמצא בקשר עם הפתרון בתוך צינור microcapillary (2) חוטם החוצה / אי קיום מגע: החוטם מרחיב אינו במגע עם הפתרון בתוך צינור microcapillary, (3) חוטם מאוחסן: החוטם לא יוארך אלא מוסתר מתחת הראש (4) מחוץ לטווח ראייה: הדבורה היא מחוץ לפריים וידאו.
- גדר כל התנהגותכ 'מדינה' 'סותר' בתפריט המאפיינים ולבצע הקלטות רציפות למשך פרק 2 דקות. Replay קטעי וידאו במצב בהילוך איטי (2 פעמים לאט) עבור דיוק יותר.
- למדוד את מהירות הכחשת חוטם מפתרון הבדיקה לאחר המגע הראשון בין שתי מסגרות רצופות (מופרדות על ידי 37.5 msec בהקלטות הווידאו שמוצגות כאן) באמצעות תוכנת וידאו הצעת מעקב (ראה לוח חומרים).
- העלה את קובץ וידאו ולדלג אל המסגרת שבה החוטם ראשון קשר הפתרון.
- כדי להגדיר את היקף ההתייחסות, בחר בכלי הקו למתוח קו על הרוחב של צינור microcapillary בפריים הווידאו. קליק ימני על הקו ובחר 'כייל מידה'. הזן את הרוחב של צינור הנימים והיחידה המקבילה.
- בחר "תמונה" ואז "לתאם ממוצא מערכת '. בחלון החדש לחץ על קצה החוטם ובחר9; החל ".
- בחר בכלי להזיז את היד, קליק ימני על קצה החוטם על מסגרת וידאו ובחר "נתיב מסלול '. כדי להעביר את המסגרת הבאה ולתקן את מעקב הצבע אל קצה החוטם.
- קליק ימני על מעקב הצבע ובחר "תצורה". הבחירה 'נתיב מלא' ובחר 'מהירות' תחת מדידה. בחר "החל". מהירות מוצגת מכן.
Representative Results
את assay הרומן משמש על מנת לבחון את התגובות האכלה ל -1 M סוכרוז, 1 M פתרון סוכרוז פלוס 1 כינין מ"מ ומים deionized לבד. תגובות ההאכלה המיידיות לכל טיפול נקבעות על ידי כימותי משך קשר חוטם עם פתרון המבחן, את התדירות של התקפי האכילה לבין המהירות של החוטם חוזר בה מן פתרון המבחן לאחר המגע הראשון בשלב הבדיקה 2 דקות. היקף הפתרון הנצרך נמדד גם לאחר שלב הבדיקה. במחקר זה, בחרנו מרווח קריטריון התקף של 5 שניות (איור 1, ראה קובץ משלימה) בהתבסס על העבודה קודמת של צרפתי et al. 25 שהשתמשו חסימה בגובה של 5 שניות כדי לאפיין את התנהגות הכחשת חוטם ידי תסיסנית בתגובת הרתעה תרכובות 25. לכן הגדרנו התקף האכלה כאיש קשר בין החוטם המורחב והפתרון לאt מופרע על ידי היעדרות של אנשי קשר של 5 שניות או יותר.
בהשוואת סוכרוז מים ללא יונים לבד, הוספת כינין תמיסת סוכרוז כנראה מרתיע האכלה על ידי דבורי Bumble כפי שהם במהירות יהיו להתרחק אם הם מזהים חומר מרתיע (וידאו איור 1).
בניסוי זה, יש הטיפולים השפעה משמעותית על המשך המצטבר של קשר חוטם במהלך שלב הבדיקה (ANOVA על נתוני טרנספורמציה היומן, 2,31 F = 41, p <0.001). המשך המצטבר של זמן מגע עם כינין המכיל סוכרוז מצטמצם משמעותי בהשוואת סוכרוז לבד (p <0.001), אך לא מים ללא יונים בלבד (p = 0.219) (איור 2). בדומה לכך, יש את הטיפולים השפעה משמעותית על המשך המצטבר של התקפי אכילה (ANOVA על נתוני טרנספורמציה יומן, F
together.within-page = "1"> במגעים assay זה בין האנטנה ואת פתרון המבחן לא ניתן למנוע. עם זאת, אחוז דבורי Bumble באמצעות האנטנות שלהם לטעום פתרון ההאכלה במהלך שלב הבדיקה (סוכרוז: 46.1%, סוכרוז בתוספת כינין: 60.0% ומי deionized: 33.3%) אינו שונה באופן מובהק בין הטיפולים (הבינומי GLM, שינוי ב סטייה לעומת חלוקת 2 ג: p = 0.450). אין השפעה של הטיפולים נמצאת על חביון בין מגעי המחושים הראשונים ואת פתרון מבחן ואת המגעים הראשונים של החוטם (חציון: 2.67 שניות סוכרוז; 1.10 שניות סוכרוז בתוספת כינין; 0.80 שניות מים ללא יונים, ANOVA על נתוני יומן טרנספורמציה, F 2,13 = 0.620, p = 0.550). בנוסף, אחוז דבורי Bumble הארכת החוטם לטעום את פתרון המבחן נשאר קבוע על פני הטיפולים (סוכרוז: 66.7%; סוכרוז בתוספת כינין: 50.0%; מים ללא יונים: 52.2%; GLM הבינומי, שינוי סטייה לעומת חלוקת ג 2: p = 0.840). יחד התוצאות הללו מצביעות על כך האנטנות לשחק תפקיד שולי זיהוי של רעלי assay זה.
בניסוי נפרד בוחן אם יש צורך לבדוק דבורים לתקופה של זמן ארוך יותר מ -2 דקות. כמות המזון הנצרך על ידי דבורים נבחנת עם סוכרוז 1 M או 1 כינין מ"מ 1 M פתרונות סוכרוז בשני תנאים: תקופת הבדיקה 2 דקות תקופת הבדיקה 10 דקות. עבור שני הטיפולים, צריכת מזון כוללת אינה שונה לתקופות המבחן ואין אינטראקציות משמעותיות להתרחש בין תקופת המבחן ואת הטיפול (N = 6 - 13, ANOVA על נתוני טרנספורמציה היומן; השפעת הטיפולים: F 1,31 = 54.8, p <0.001; השפעת תקופת המבחן: F 1,31 = 0, p = 0.979; השפעת האינטראקציה: F = 0.1, p = 0.457). לסיכום,בתקופת 2 דקות בדיקה מספיקה כדי להעריך את ההשפעה של הפתרון על הסכום הכולל של מזון הנצרך על ידי דבורי השפעות ההרתעה של חומרים רעילים או דוחה assay זה. לכן, על ידי מדידת צריכת מזון מנסה לאמוד האכלת התנהגות, אפשר לתאם צריכת מזון הכוללת את המבנה העדין של האכלה במהלך assay.
איור 1: תקופות חביון בין מגעי החוטם במהלך המינימום 2 הראשון של Assay ההאכלה מגרש צפיפות של תקופות חביון הזמן להפריד כל קשר חוטם עם תמיסת סוכרוז 1 M, פתרון כינין 1 M סוכרוז + 1 המ"מ ומים.. הנתונים המצטברים מ -13, 10 ו -11 דבורים מיוצגים בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. </ P>
איור 2: משכי זמן חוטם לתקשר במהלך 2 הדקות הקודמות של Assay ההאכלה מגרש צפיפות של משכי קשר חוטם ידי דבורי האכלה ב -1 M סוכרוז, 1 M סוכרוז + 1 כינין או מים מ"מ.. גודל המדגם כמו באיור 1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: פעילות חוטם של צרעות האכלה ב -1 סוכרוז M, 1 M סוכרוז + 1 מ"מ כינין או מים (א) המשך המצטבר של התקפי אכילה במהלך שלב הבדיקה (ב) תדירות האכלה התקפית ו- (ג) את המהירות. של החוטם מחדשהמתיחה לאחר המגע הראשון. כיתוב מצביע על הבדל משמעותי: טיפולים עם אותיות שונות מצביעים P <0.05. מגרשי Box מייצגים חציון (פסים שחורים), רמה הנמוכה ביותר ואת נקודות הנתונים הגבוהות ביותר עדיין בתוך 1.5 של הטווח בין-הרבעונים (שפם) ואת החריגים (עיגולים). גודל המדגם כמו באיור 1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4:. Supresses כינין האכלה על ידי דבורים Bumble (א) תמונות סרוקות של צינורות microcapillary מראה את הרמה של סוכרוז 1 M או 1 M סוכרוז פלוס 1 מ"מ פתרון כינין (מסומן על ידי קו שחור) לפני ואחרי שלב הבדיקה בהתאמה. (ב) צריכת 1 M סוכרוז, 1 M סוכרוז פלוס 1 כינין מ"מ או מים ללא יונים לבד על ידי דבורים Bumble לאחר שלב הבדיקה. כיתוב מצביע על הבדל משמעותי: טיפולים עם אותיות שונות מצביעים P <0.001. מגרשי Box מייצגים חציון (פסים שחורים), רמה הנמוכה ביותר ואת נקודות הנתונים הגבוהות ביותר עדיין בתוך 1.5 של הטווח בין-הרבעונים (שפם) ואת החריגים (עיגולים). גודל המדגם כמו באיור 1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 1 וידאו: הקלטות וידאו של פעילות חוטם לכיוון (א) 1 M סוכרוז , (ב) 1 M סוכרוז פלוס 1 מ"מ כינין ו- (ג)ד / 54,233 / Video_figure_1C_Water.m4v "target =" _ blank "> מי Deionized במהלך שלב הבדיקה.
Discussion
עם assay התנהגותיים הרומן הזה, כינין מוצג להרתיע האכלה של הדבורה זנב-חובב. שעת קשר חוטם המופחתת ותדירות התקף האכלה עם מים או תמיסת סוכרוז מהולה כינין מתפרשת כאן כסירוב ליזום עוד הניזונים שאינם תזונתיים או רעילים פתרונות. כאשר כינין מתווסף 1 M תמיסת סוכרוז, דבורים Bumble לא רק להפחית את עוצמת הקול של פתרון שהם צורכים, הם גם לבטל חוטם מהר, ובכך להקטין קשר הזמן בין איברי הפה הפתרון המכיל רעלן. יחד, משתמע מתוצאות אלה כי כינין נתפסת על ידי תאי קולטן התעורר אצלם על איברי הפה של הדבורה, כפי שכבר בעבר שזוהו דבש דבורים 9. כינין הוא רעלן לחרקים שגורם התנהגות כמו-מועקה של דבש הדבורים 10 ו מציאה של יתוש המלריה (gambiae אנופלס) 23. assay זה גם יכול להוביל מגלים הזדהותיון של כמה הרתעה ואפשרות תרכובות רעילות הנתפסות על ידי תאי קולטן טעם על איברי הפה ב הדבורים בומבוס.
זה חיוני עבור צינור microcapillary להתמלא נפח מספיק של פתרון המבחן להימשך לאורך כל שלב הבדיקה. מומלץ שלפחות סביב שלושה רבעים של הצינור microcapillary (למשל 70-80 μl) מלא. עם זאת, יש להיזהר שלא למלא את צינור microcapillary לחלוטין כדי להפחית את הסיכון של דליפה במהלך התהליך של סריקת הצמדת צינור microcapillary למנגנון הניסיוני. טיפול צריך גם לקחת בעת הצגת 500 אגל סוכרוז מ"מ עד הדבורה, כך הנסיין נמנע דולף האגל לתוך צינור ההחזקה.
חור 4 המ"מ בקצה צינור ההחזקה הוא גדול מספיק עבור דבורה עובד מבוגרת להאריך החוטם שלה באופן טבעי לכיוון פתרון המבחן. עם זאת יתכן כידבורי Bumble יכולים לטעום את הפתרון עם האנטנות שלהם לפני ההארכה בחוטמיהם. הדבר עשוי להשפיע על ההסתברות הרחבה חוטם לפי יכול להיות שהושרו דבורים Bumble ידי גירוי האנטנות שלהם עם תמיסת סוכר 15. למעשה האנטנות של דבוראים כמו הצרעה הטפילה (Trissolcus brochymenae) 24 או את דבורת דבש 13 מצוידי הטעם sensilla, ומאפשרים להם לטעום סוכרים ורעלים כמו כינין. כתוצאה מכך, אנשי קשר מחושים ראשוניים עם תמיסות המכילים תרכובות מרתיעות מאוד כמו כינין יכול גם להפחית את המוטיבציה של דבורה להאריך החוטם שלה ולכן להשפיע על שיעור הצלחה הניסיון. למרות קשר מחושים עם פתרון המבחן לא יכול להיות נשלט, במחקר הנוכחי לא מצאנו השפעה מהותית של קשר מחושים על רחבת חוטם לעבר פתרון המבחן. ב assay זה, מיד בהקמת צינור microcapillary לאחר שלב טרום מבחן Wתרנגולת האנטנות של הדבורים בומבוס עדיין בתוך צינור ההחזקה יכולה להפחית את ההזדמנות עבור הדבורים בומבוס לטעום את פתרון המבחן עם האנטנות שלהם.
המגבלה העיקרית של assay זה מתעוררת כאשר מעקב אחר הכחשת החוטם הרחק פתרון המבחן אחרי מגע החוטם הראשון באמצעות תוכנת וידאו הצעת מעקב. צילום הווידאו מציג רק תנועת 2D של החוטם, כך הפלט הנתון של מהירות המדידה יכול להיות מתחת או מעל המשוער. אולם עם כמה שינויים, היבט זה של assay יכול להיות שיפור.
assay זה יכול לשמש כדי לצפות בתגובות האכלה טבעיות כלפי תמיסות המכילות תרכובות שונות כולל מטבוליטים טבעי מתחוללי צמח משני. התבוננות תגובות ההאכלה המיידיות עם assay זה נותן מידע מפורט אודות אופן דבורי Bumble לזהות תרכובות אלו. זה יש יתרון על פני הקיים "ללכת-לא ללכת" שיטות כמו PER 18,19 7 מכיוון ששיטה זו מייצרת כמה צעדי תגובה התנהגותית כוללים צריכת מזון במהלך התקף האכלה בדיד.
מדידת מספר פרמטרים בו זמנית מאפשרת הערכה טובה יותר של הטעם של תרכובת. לדוגמה ב assay שלנו, דבורים Bumble להימנע מצריכת מים או תמיסת סוכרוז מהול כינין. הכחשה של החוטם יכולה להיגרם על ידי שינוי התגובות של תאי קולטן סוכר 12,13. assay שלנו מראה כי דבורי Bumble לחזור החוטם מהר לאחר פניית הפתרון סוכרוז בתוספת כינין ממים לבד; זה יכול להציע כינין המשפיע קבוצה נפרדת של נוירונים בנוסף עיכוב נוירונים חישת סוכר 9,12,13,25.
assay שלנו מאפשר ניתוח של דפוס הזמני של תגובות התנהגותיות שבהאכלה. פרוטוקול דומה שבו זמן הצריכה ומספר ההתקפים נמדדים יש אלמוכן יושם כדי להעריך את תגובת ההאכלה של תסיסנית לסוכרים תזונתיים והלא תזונתיים 26. אנו צופים כי דבורים יפגינו תשובה אמינה יותר להאכלת ממריצים assay שלנו מאשר שיטות אחרות כגון PER כי הדבורים חופשיים לנוע בצינור ההחזקה 21. טכניקה זו תאפשר ניתוח ממצה של ספי הטעם וחומרים מזינים ורעלים כדי להאיר את מנגנוני האכלה בדבורים בומבוס ומיני דבורה אחרים בפוטנציה.
Disclosures
המחברים מצהירים שום ניגוד עניינים.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי מענק האמון Leverhulme (RPG-2012-708) ומענק BBSRC (BB / M00709X / 1) כדי Gaw.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bumblebee colonies | Koppert Biological Systems | NATUPOL Beehive | |
| Digital microscopic camera | Dino-lite Europe | AM4815ZT | Dino-Lite Edge |
| 100 μl microcapillary tube | Blaubrand IntraEND | 709144 | |
| 15 ml polypropylene centifuge tube | Fisher Scientific | 11849650 | |
| 1 ml disposable plastic luer slip syringe | BD | 300013 | |
| Dell Latitude 3550 laptop | Dell | Check for compatibility with video software | |
| Canon CanoScan LiDE 120 | Canon | Check for compatibility with the computer/laptop | |
| Observer software version 5.0.25 | Noldus | ||
| Kinovea software version 0.8.15 | Kinovea | ||
| silicone tubing | 6 cm length, 1 mm inside Ø & 6 cm length, 4 mm inside Ø | ||
| Male luer x1/16" standard hose barbed polypropylene adapter | Cole-Parmer | TW-45518-22 | |
| Female luer x 1/16" standard hose barbed polypropylene adapter | Cole-Palmer | TW-45508-12 | |
| Steel mesh | 0.5 mm mesh size | ||
| Sucrose (grade II) | Sigma-Aldrich | S5391 | |
| Quinine hydrochloride dihydrate | Sigma-Aldrich | Q1125 | |
| ImageJ software version 1.48 | ImageJ |
References
- Adler, L. S. The ecological significance of toxic nectar. Oikos. 91, 409-420 (2000).
- Hagler, J. R., Buchmann, S. L. Honey bee (Hymenoptera, Apidae) foraging responses to phenolic-rich nectars. J Kansas Entomol Soc. 66, 223-230 (1993).
- Irwin, R. E., Cook, D., Richardson, L. L., Manson, J. S., Gardner, D. R. Secondary compounds in floral rewards of toxic rangeland plants: Impacts on pollinators. J Agr Food Chem. 62, 7335-7344 (2014).
- Praz, C. J., Mueller, A., Dorn, S. Specialized bees fail to develop on non-host pollen: Do plants chemically protect their pollen. Ecology. 89, 795-804 (2008).
- Baker, H. G., Baker, I. Studies of nectar-constitution and pollinator-plant coevolution. Coevolution of animals and plants. Gilbert, L. E., Raven, P. H. , University of Texas Press. 100-140 (1975).
- Stout, J. C., Parnell, J. A. N., Arroyo, J., Crowe, T. P. Pollination ecology and seed production of Rhododendron ponticum in native and exotic habitats. Biodivers Conserv. 15, 755-777 (2006).
- Tiedeken, E. J., Stout, J. C., Stevenson, P. C., Wright, G. A. Bumblebees are not deterred by ecologically relevant concentrations of nectar toxins. J Exp Biol. 217, 1620-1625 (2014).
- Ayestaran, A., Giurfa, M., de Brito Sanchez, M. G. Toxic but drank: Gustatory aversive compounds induce post-ingestional malaise in harnessed honeybees. Plos One. 5, (2010).
- Wright, G. A., et al. Parallel reinforcement pathways for conditioned food aversions in the honeybee. Curr Biol. 20, 2234-2240 (2010).
- Hurst, V., Stevenson, P. C., Wright, G. A. Toxins induce 'malaise' behaviour in the honeybee (Apis mellifera). J Comp Physiol A. 200, 881-890 (2014).
- Whitehead, A. T., Larsen, J. R. Electrophysiological responses of galeal contact chemoreceptors of Apis mellifera to selected sugars and electrolytes. J Insect Physiol. 22, 1609-1616 (1976).
- de Brito Sanchez, M. G., et al. The tarsal taste of honey bees: behavioral and electrophysiological analyses. Front Behav Neurosci. 8, 25 (2014).
- de Brito Sanchez, M. G., Giurfa, M., Mota, T. R. D., Gauthier, M. Electrophysiological and behavioural characterization of gustatory responses to antennal 'bitter' taste in honeybees. European Journal of Neuroscience. 22, 3161-3170 (2005).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera). J Comp Psychol. 97, 107-119 (1983).
- Laloi, D., et al. Olfactory conditioning of the proboscis extension in bumble bees. Entomol Exp Appl. 90, 123-129 (1999).
- Smith, B. H., Burden, C. M. A proboscis extension response protocol for investigating behavioral plasticity in insects: Application to basic, biomedical, and agricultural Research. J Vis Exp. , (2014).
- Felsenberg, J., Gehring, K. B., Antemann, V., Eisenhardt, D. Behavioural Pharmacology in classical conditioning of the proboscis extension response in honeybees (Apis mellifera). J Vis Exp. , (2011).
- Pankiw, T., Page, R. E. Effect of pheromones, hormones, and handling on sucrose response thresholds of honey bees (Apis mellifera L.). Journal of comparative physiology. A, Neuroethology, sensory, neural, and behavioral physiology. 189, 675-684 (2003).
- Scheiner, R., Page, R. E., Erber, J. Sucrose responsiveness and behavioral plasticity in honey bees (Apis mellifera). Apidologie. 35, 133-142 (2004).
- Kessler, S. C., et al. Bees prefer foods containing neonicotinoid pesticides. Nature. 521, 74-76 (2015).
- Mommaerts, V., Wackers, F., Smagghe, G. Assessment of gustatory responses to different sugars in harnessed and free-moving bumblebee workers (Bombus terrestris). Chem Senses. 38, 399-407 (2013).
- Chittka, L., Dyer, A. G., Bock, F., Dornhaus, A. Psychophysics: Bees trade off foraging speed for accuracy. Nature. 424, 388 (2003).
- Kessler, S., González, J., Vlimant, M., Glauser, G., Guerin, P. M. Quinine and artesunate inhibit feeding in the African malaria mosquito Anopheles gambiae: the role of gustatory organs within the mouthparts. Physiol Entomol. 39, 172-182 (2014).
- Iacovone, A., Salerno, G., French, A. S., Conti, E., Marion-Poll, F. Antennal gustatory perception and behavioural responses in Trissolcus brochymenae females. J Insect Physiol. 78, 15-25 (2015).
- French, A. S., et al. Dual mechanism for bitter avoidance in Drosophila. J. Neurosci. 35, 3990-4004 (2015).
- LeDue, E., Chen, Y. -C., Jung, A. Y., Dahanukar, A., Gordon, M. D. Pharyngeal sense organs drive robust sugar consumption in Drosophila. Nat. Commun. 6, 6667 (2015).
