Summary
Les macrophages sont des cellules plastiques du système hématopoïétique qui jouent un rôle crucial dans l'immunité protectrice et l'homéostasie. Dans ce rapport, nous décrivons des techniques in vitro optimisées pour caractériser phénotypiquement et fonctionnellement les macrophages régulateurs infiltrants de greffe qui s'accumulent dans l'organe transplanté dans des conditions tolérantes.
Abstract
L'accumulation de macrophages dans les organes transplantés a longtemps été reconnue comme une caractéristique du rejet d'allogreffe 1 . Les monocytes immunogènes infiltrent l'allogreffe au début de la transplantation, montent une réponse réactive du greffon contre l'organe transplanté et initient le rejet d'organe 2 . Les données récentes suggèrent que les macrophages suppressifs facilitent la transplantation réussie à long terme 3 et sont nécessaires pour l'induction de la tolérance à la transplantation 4 . Cela suggère un concept multidimensionnel de l'ontogenèse, de l'activation et de la fonction des macrophages, qui exige une nouvelle feuille de route pour l'isolement et l'analyse de la fonction macrophage 5 . En raison de la plasticité des macrophages, il est nécessaire de fournir une méthodologie pour isoler et caractériser les macrophages, selon l'environnement tissulaire, et pour définir leurs fonctions selon différents scénarios. Ici, nous décriÊtre un protocole pour la caractérisation immunitaire des macrophages infiltrés par greffon et les méthodes que nous avons utilisées pour évaluer de manière fonctionnelle leur capacité à inhiber la prolifération de CD8 + T et à favoriser l'expansion Treg de CD4 + Foxp3 + in vitro .
Introduction
Ce protocole décrit des techniques in vitro pour étudier la fonction des macrophages infiltrant les tissus isolés à partir d'allogreffes cardiaques, selon leur capacité à moduler les réponses des lymphocytes T. Dans la littérature, les colorants fluorescents de suivi des cellules en combinaison avec la cytométrie en flux sont des outils puissants pour étudier la fonction suppresseur de types de cellules spécifiques in vitro et in vivo. Notre protocole suit la méthode de l'ester succinimidylique de carboxyfluorescéine (CFSE) pour surveiller la prolifération des lymphocytes in vitro .
Lorsqu'une cellule marquée par le CFSE se divise, sa descendance acquiert la moitié du nombre de molécules marquées par la carboxyfluorescéine 6 . La diminution correspondante de la fluorescence cellulaire par cytométrie de flux peut être utilisée pour évaluer la division cellulaire, en surveillant la capacité des macrophages suppressifs à moduler les réponses immunitaires des lymphocytes T. Puisque le CFSE est un colorant à base de fluorescéine, il est compatible avec un brOuad d'autres fluorochromes, ce qui le rend applicable à la cytométrie de flux multicolores. Le choix approprié des fluorochromes pour le phénotypage est également important pour éviter le chevauchement spectral excessif et l'incapacité de reconnaître les cellules positives aux anticorps, en particulier avec des colorants protéiques visibles tels que le CFSE 7 .
Il existe de nombreux avantages d'utiliser des colorants fluorescents sur des techniques alternatives qui mesurent la prolifération cellulaire, comme le dosage d'incorporation de thymidine, qui utilise une thymidine radiomarquée (TdR) 8 . Ce dosage utilise de la thymidine tritiée (3H-TdR) qui est incorporée dans de nouveaux brins d'ADN chromosomique lors de la division des cellules mitotiques. Une préoccupation de sécurité associée à cet essai est l'utilisation de radio-isotopes, car un compteur bêta à scintillation est utilisé pour mesurer la radioactivité dans l'ADN récupéré à partir des cellules afin de déterminer l'étendue de la division cellulaire. Sur le plan méthodologique, le culot thymidine tritiéAy n'est pas suffisamment souple pour tenir compte des importantes contraintes de laboratoire clinique telles que le faible nombre de cellules et l'analyse retardée après coloration. Au contraire, la coloration au CFSE a été démontrée pour prévenir la prolifération cellulaire et pour interférer avec les marqueurs critiques d'activation, tels que CD69, HLA-DR et CD25 9 . Par conséquent, la compréhension des avantages et des limites de chaque méthodologie, en particulier dans les études multicolores où les colorants multiples sont utilisés pour suivre différents types de cellules, est essentielle pour obtenir des résultats précis et reproductibles.
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Protocol
Dans cette étude, les souris sont logées conformément aux directives du ministère de l'Agriculture des États-Unis et aux recommandations du Guide du service de santé publique pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. Toutes les techniques expérimentales impliquant l'utilisation d'animaux ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le Comité Institutional Animal Care and Utilization Committee (IACUC) de la Mount Sinaï School of Medicine.
1. Préparation des médias
- Préparer le milieu RPMI 1640 complet avec 10% de FBS et 1% de pénicilline-streptomycine (10 000 U / mL) en utilisant 2 mM de L-glutamine, 1 mM de pyruvate de sodium, 0,1 mM d'acides aminés non essentiels, 5 mM d'HEPES et 0,05 mM de 2 -mercaptoethanol.
2. Isolation de l'allogreffe et suspension à une seule cellule
NOTE: La technique de transplantation et d'anastomose de l'artère pulmonaire et de la veine de cava inférieure a été initialement décrite par Corry et ses collaborateurs et peut être visualisée à Liu & KangS = "xref"> 10 , 11 ( figure 1A ).
- Anesthésier une souris transplantée avec 4-5% d'isoflurane dans une chambre d'induction. Sacrifiez-le par dislocation cervicale.
- Faire une incision abdominale de la ligne médiane avec des ciseaux standard et éliminer le contenu abdominal pour localiser l'aorte.
REMARQUE: Le coeur transplanté sera sur le côté droit de l'aorte abdominale du receveur ( Figure 1B ). - Retirez délicatement la greffe à l'aide d'une fine pince à dents pointues et placez-la immédiatement dans du milieu RPMI glacé.
REMARQUE: L'utilisation d'un ciseau chirurgical pour séparer le greffon de l'aorte peut endommager le greffon et provoquer l'adhérence du tissu au receveur. - Une fois que tous les greffons ont été collectés, les déplacer dans un capot de culture stérile pour le traitement des tissus. Placez le greffon dans une boîte de Pétri et coupez les morceaux en petits morceaux (1 mm) en utilisant des ciseaux stériles, émoussés et à microchirurgie.
- Avec dents pointuesEps, transférez les pièces dans un tube de 50 mL avec 5 mL de collagénase A (0,1 mg / mL de collagénase dans un PBS stérile 1x). Incuber pendant 1 h dans un bain de 37 ° C.
- Ajouter 5 mL de milieu RPMI pour neutraliser la collagénase et transférer l'échantillon à travers un filtre de 100 μm à l'aide du piston d'une seringue de 1 ml.
- Faire passer l'échantillon à 400 xg pendant 5 min à 4 ° C.
- Remettre en suspension la pastille dans 1 mL de tampon de lyse ACK. Bien mélanger et incuber pendant 5 min à 4 ° C.
- Ajouter 1 mL de milieu RPMI pour neutraliser le tampon de lyse et faire basculer l'échantillon à 400 xg pendant 5 m à 4 ° C.
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans 200 μL de milieu RPMI et le transférer dans un tube à base ronde en polypropylène de 5 ml.
REMARQUE: Les tubes en polypropylène supportent moins d'adhérence. En outre, le maintien des cellules à basse température, par exemple à 4 ° C, réduit l'adhérence.
3. Isolation des macrophages infiltrant le greffon à l'aide du tri cellulaire activé par fluorescenceIng
- Bloquer la liaison spécifique indésirable sur les cellules myéloïdes en utilisant un mAb de blocage du récepteur Fc (souris anti-souris CD16 / 32). Ajouter 1-2 μL par échantillon, 15 min avant la coloration de la surface.
- Tachez avec la solution finale de CD11b Percp / Cy5.5 anti-souris (0,6 μg / μl de concentration finale dans le milieu RPMI), AP45 / IgFluor780 anti-souris (0,6 μg / μL), APC Ly6C anti-souris (2 μg / μL) Et Ly6G Pe / Cy7 anti-souris (2 μg / μL). Couvrir les tubes avec du papier d'aluminium pour protéger les anticorps fluorescents de la lumière et incuber les tubes au réfrigérateur à 4 ° C pendant 45 minutes.
REMARQUE: Pour les compensations à une seule tache, préparer un tube de contrôle négatif (sans tache) et des tubes avec des cellules isolées avec chacun des fluorochromes. Pour aider à configurer la porte, les contrôles d'isotype peuvent être utilisés spécialement pour Ly6C (IgG2a) et Ly6G (IgG2b). - Lavez les cellules deux fois avec du milieu RPMI et tournez-les à 400 xg pendant 5 min à 4 ° C. Comptez les cellules en utilisant du bleu trypan et un hémocytomeR et diluez-les dans 1 mL de milieu RPMI pour 1 x 10 6 cellules. Avant le tri, transférez les échantillons à travers un capuchon de tube de filtre de 5 μm, 70 μm. Ajouter DAPI (1 μg / mL) comme marqueur de viabilité cellulaire et procéder à la tri.
- Étant donné que les macrophages sont des cellules fragiles et sensibles, définissez les conditions de tri à 20 psi et utilisent une taille de buse de 100 μm pour isoler les macrophages en utilisant un mode de pureté à 4 voies.
- Préparer des tubes de collecte avec 1 mL de milieu RPMI dans un tube de polypropylène de 5 mL.
- L'utilisation du logiciel du trieur ouvre une nouvelle expérience et sélectionne une expérience vide avec un panneau vierge pour définir les paramètres.
- Configurez un diagramme de points qui affiche la diffusion latérale vers l'avant (FSC) contre ( contre ) côté et la porte sur tous les leucocytes, à l'exclusion des débris et des touffes avec la plus petite diffusion avant et latérale. À partir de cette porte parentale, créez un nouveau tracé de points qui affiche SSC vs DAPI et la porte sur les cellules DAPI.
- Sur cette population nouvellement fermée, créez une annonceOt plot qui affiche CD11b vs CD45 et porte sur des macrophages et des neutrophiles double-positifs (CD11b + CD45 + ).
- À partir de là, créez un dernier tracé de points affichant Ly6C vs. Ly6G et déployez les populations souhaitables: Ly6C hi Ly6G - , Ly6C lo Ly6G - et Ly6C int Ly6G + ( Figure 2 ).
- Après le tri, vérifier la pureté et la viabilité cellulaire (> 90%) et faire tourner les tubes de collecte à 400 xg pendant 5 min à 4 ° C. Comptez les cellules en utilisant du trypan bleu et un hémocytomètre et resuspendez-les à la concentration souhaitée ( p. Ex., 1 x 10 6 macrophages / mL) dans un milieu RPMI complet.
- Placer 50 x 10 3 macrophages par puits dans une plaque à fond rond de 96 puits avec un volume final de 100 μL de milieu RPMI complet. Laissez les cellules intactes pendant au moins 24 h à 37 ° C et 5% de CO 2 .
4. IsolatioN de cellules T utilisant le tri cellulaire activé par fluorescence
REMARQUE: C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / Jn est une souche de souris ciblée ciblée par X qui co-marque les cellules exprimant le gène Foxp3 (forkhead box P3) avec une protéine fluorescente rouge monomère (mRFP).
- Anesthésier et sacrifier les souris C57BL / 6 et C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / J (H-2b) comme décrit précédemment à l'étape 2.1. Isoler la rate et les ganglions lymphatiques (LN: inguinal, lombaire, axillaire, brachial et cervical) et les placer rapidement dans du milieu RPMI glacé.
- Pour isoler le LN, placez la souris en position couchée, faites une incision de la ligne médiane de bas en haut, en coupant soigneusement le péritoine et en écartant délicatement la peau. Une fois que tous les LN inguinaux, lombaires, axillaires, brachiaux et cervicaux sont recueillis ( figure 1C , colorés en rouge), couper le péritoine et isoler la rate en haut à gauche de l'intestin.
- Désagréger la rate et le LN en utilisant un filtre de 100 μm placéSur un tube de 50 ml. En utilisant le piston d'une seringue de 1 mL, appuyez doucement sur le tissu. Rincez le filtre avec du milieu RPMI autant de fois que nécessaire jusqu'à ce qu'il soit propre.
REMARQUE: Le LN et la rate de chaque souris peuvent être regroupés dans le même tube. - Tourner à 400 xg pendant 5 min à 4 ° C.
- Remettre en suspension la pastille dans 2 ml de tampon de lyse ACK. Bien mélanger et incuber pendant 5 min à 4 ° C.
- Ajouter 2 ml de milieu RPMI pour neutraliser le tampon de lyse. Tourner à 400 xg pendant 5 min à 4 ° C.
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans 200 μL de milieu RPMI et le transférer dans un tube à fond rond en polystyrène de 5 ml.
- Teinture pour CD4 APC anti-souris (0,6 μg / μL) et / ou CD8 PeCy7 anti-souris (2 μg / μL). Couvrir les tubes avec du papier d'aluminium pour protéger les anticorps fluorescents de la lumière et incuber les tubes au réfrigérateur à 4 ° C pendant 45 minutes.
REMARQUE: pour les compensations à une seule tache, prépare un tube de contrôle négatif (pas de tache) etTubes avec des cellules marquées isolément avec chacun des fluorochromes. - Lavez les cellules deux fois avec du milieu RPMI et tournez-les à 400 xg pendant 5 min à 4 ° C. Comptez les cellules en utilisant du trypan bleu et un hémocytomètre.
NOTE: Le colorant CFSE est fourni sous forme de poudre d'ester succinimidylique de diacétate de carboxyfluorescéine en général à 50 μg. Ajouter 18 μL de DMSO dans un flacon de CFSE pour une solution mère finale de 5 mM et stocker à -20 ° C pendant plusieurs mois. - Pour l'étiquetage CFSE, ré-endiguer les cellules colorées au CD8 à une concentration de jusqu'à 10 6 cellules par ml dans du PBS à une concentration de travail finale de 5 μM CFSE à partir de la solution mère. Incuber les dans un bain à 20 ° C pendant 5 minutes comme décrit précédemment 6 .
REMARQUE: (ÉTAPE CRITIQUE) Pour les cellules à faible concentration (≤10 6 par mL), il est essentiel que les cellules soient marquées en présence de protéines ajoutées pour tamponner les effets toxiques du CFSE. Par conséquent, PBS peut contenir 5% de FBS. Notez que si moiLe dium est utilisé, les acides aminés libres peuvent réduire l'efficacité de l'étiquetage en faisant concurrence pour le CFSE. - Neutralisez le CFSE avec 2 mL de milieu RPMI. Tourner à 400 xg pendant 5 min à 4 ° C. Ajouter 1 ml de milieu RPMI pour 1 x 10 6 cellules CD8 T.
- Avant le tri, transférez l'échantillon à travers une crépine cellulaire de 70 μm sur un capuchon de tube de 5 mL. Ajouter 50 μL de 1x DAPI (1 μg / mL) comme marqueur de viabilité cellulaire et procéder au tri.
REMARQUE: 1x signifie 1: 1 rapport du réactif par rapport à un autre constituant. - Réglez les conditions de tri à 20 psi et à la taille de la buse de 100 μm pour isoler les cellules T CD8 + CFSE + à double positif ( Figure 3A ).
- Préparer des tubes de collecte avec 1 ml de milieu RPMI dans un tube de polypropylène de 5 ml et procéder à la tri.
- L'utilisation du logiciel du trieur ouvre une nouvelle expérience et sélectionne une expérience vide avec un panneau vierge pour définir les paramètres.
- Pour l'isolation des cellules T CD4 + , configurez un espace de points que disJoue le FSC vs SSC et la porte sur les lymphocytes, à l'exclusion des débris ainsi que des grandes cellules granulaires, comme les cellules dendritiques.
- À partir de cette porte parentale, créez un nouveau tracé de points qui affiche SSC vs DAPI et la porte sur les cellules DAPI.
- Sur cette population nouvellement fermée, créez un diagramme de points qui affiche SSC vs CD4 pour isoler toutes les cellules CD4 + ( Figure 3B ). Alternativement, un mAb anti-CD3 peut être utilisé pour assurer l'isolement des populations de cellules T pur.
NOTE: Une petite fraction de toutes les cellules T CD4 + (5-10%) devrait être Foxp3 + mRFP + .
- Après le tri, vérifier la pureté et la viabilité cellulaire (> 90%) et faire tourner les tubes de collecte à 400 xg pendant 5 min à 4 ° C. Comptez les cellules en utilisant du trypan bleu et un hémocytomètre. Remettre en suspension en utilisant 1 mL de milieu RPMI complet par 2 cellules de cellules T de 6 x 10 .
- Mettre en place un test de suppression en cultivant des lymphocytes T avec des macrophages préalablement triés. Plaque 10 x 10 4 CD4 + T et 10 x 10 4 cellules CD8 + CFSE + dans le même puit dans un volume final de 100 μL de milieu RPMI complet. Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 96 h.
NOTE: Les macrophages et les lymphocytes T ont été utilisés dans un rapport 1: 4. - Stimuler la division des lymphocytes T en lavant des billes magnétiques CD3 / CD28 activatrices de cellules T dans 2 ml de PBS avant de les utiliser afin d'éliminer le tampon contenant de l'azide. Ajouter 5 μL de billes CD3 / CD28 de cellules T souris par puits.
REMARQUE: Les billes magnétiques sont de taille similaire aux cellules présentant des antigènes et sont couplées aux mAb anti-CD3 et anti CD28, offrant une méthode simple pour l'activation et l'expansion des cellules T.
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Representative Results
Les résultats représentatifs montrent la stratégie de verrouillage décrite dans le protocole ci-dessus. Les résultats montrent également l'analyse de l'activité de prolifération des lymphocytes T après la co-culture avec des macrophages infiltrant le greffon. La capacité suppressive in vitro des sous-ensembles de macrophages a été analysée à la figure 4 . Les résultats indiquent que Ly6C lo Ly6G - macrophages obtenus à partir de récepteurs tolérés sont suppressifs. Les résultats indiquent également que les cellules Ly6C int Ly6G + affichent une capacité suppressive modeste. Seules les cellules Ly6C lo Ly6G ont favorisé l'expansion de CDG + Foxp3 + Treg in vitro . Ensemble, les données confirment la conclusion selon laquelle les lymphocytes CD6b + Ly6C lo Ly6G infiltrant le greffon possèdent plusieurs des propriétés associées aux cellules suppresseurs dérivées de monocytes 12 , enEn raison de leur capacité à inhiber la prolifération des lymphocytes T CD8 13 et à favoriser l'expansion des Treg de CD4 + Foxp3 + 14 .
Figure 1: modèle animal. ( A ) Les coeurs Balb / c (H2-d) ont été transplantés en C57BL / 6 (H2-b) entièrement allogénique comme décrit précédemment 10 . L'anastomose, de la veine de cava du receveur et de l'aorte abdominale avec l'artère pulmonaire du donneur et l'aorte ascendante, est indiquée. Les souris destinataires ont été traitées avec 250 μg de mAb anti-CD40L (clone MR1) pour l'induction de tolérance aux jours 0, 2 et 4, comme nous l'avons récemment signalé 4 . La fonction de greffe a été surveillée tous les deux jours par palpation abdominale. Le rejet a été défini comme l'arrêt complet d'un rythme cardiaque palpable et a été confirmé par une visualisation directe à Laparotomie. ( B ) Image représentative et ( C ) illustration de l'emplacement anatomique du LN et de la rate (coloré en rouge) et de l'allogreffe (coloré en violet) Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Stratégie de tri des macrophages. En partant de la partie supérieure gauche, les leucocytes sont d'abord fermés par la taille, puis les cellules singulet sont discriminées à partir de débris et de touffes. À partir de single, les cellules mortes sont exclus de la déclenchement de la fraction négative DAPI. Des cellules vivantes, CD45 + CD11b + est utilisé pour identifier les cellules myéloïdes. Trois populations de cellules myéloïdes sont davantage identifiées en fonction de l'expression Ly6C et Ly6G.= "_ Blank"> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Stratégie de tri des lymphocytes. Des résultats de cytométrie de flux représentatifs pour la stratégie de tri des lymphocytes. De la partie supérieure gauche, la porte sur la population de lymphocytes selon la diffusion directe et latérale. Exclure les débris et les touffes. À partir de single, les cellules mortes sont exclues en gating sur la fraction négative DAPI. À partir des cellules vivantes, ( A ) CD8 + CFSE + cellules doublement positives et ( B ) toutes les cellules T CD4 + , qui contiennent une fraction de cellules positives Foxp3 + , sont fermées. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Figure 4: essai de suppression. ( A ) Capacité suppresseur in vitro de chaque sous-ensemble myéloïde. La prolifération des lymphocytes T CD8 + a été surveillée par dilution CFSE après 96 h de co-culture avec des sous-ensembles myéloïdes. ( B ) Expansion Treg in vitro de chaque sous-ensemble myéloïde. Analyse de cytométrie de flux de l'expression de Foxp3 sur les lymphocytes T CD4 + après 96 h de co-culture avec des sous-ensembles myéloïdes. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Ce protocole décrit les méthodes utilisées pour immuno-caractériser les sous-ensembles de cellules myéloïdes infiltrantes de greffe dans un modèle murin expérimental de transplantation cardiaque, qui s'applique également à d'autres tissus dans différents modèles expérimentaux murins. Le triage cellulaire à basse pression à 20 psi était la méthode préférée pour isoler un bon rendement de sous-ensembles de cellules pures. Le maintien de la pureté de chaque sous-ensemble myéloïde est essentiel pour établir des résultats concluants de la capacité de suppression entre les différentes populations myéloïdes. Cependant, d'autres méthodes peuvent être utilisées pour l'isolement de diverses populations de leucocytes, comme les kits d'enrichissement commercial. Indépendamment de la population cellulaire d'intérêt, l'obtention de suspensions monocellulaires viables à partir du tissu transplanté est nécessaire pour obtenir des résultats optimaux de coloration de surface et de cytométrie en flux. Une manipulation incorrecte des tissus peut provoquer une perte de cellule et donc un faible rendement des sous-ensembles myéloïdes. Pour augmenter le rendement, assurez-vous de traiter l'échantillonChanger des tampons froids et maintenir les cellules dans des récipients à faible adhérence cellulaire (tubes en polypropylène). Dans ce protocole, nous avons utilisé la colagénase A de C. histolyticum , largement utilisée pour la désagrégation de nombreux types de tissus ( p. Ex. , Poumon, coeur, muscle, os, adipeux, foie, rein, cartilage, glande mammaire, placenta, sang Vaisseau, cerveau et tumeur). Pour éviter la perte de cellules lors du tri, il est fortement recommandé d'optimiser les anticorps et de générer une stratégie de verrouillage efficace. Dans ce protocole, nous avons caractérisé des macrophages murins à l'aide de CD11b-Percp / Cy5.5, CD45-APC / eFluor780, Ly6C / APC et Ly6G Pe / Cy7 anticorps conjugués à la fluorescence et cytométrie en flux. Comme les epitopes Ly6C / G n'existent pas chez l'homme, l'utilisation de CD14 / CD15 / CD16 est nécessaire pour le tri des cellules myéloïdes humaines 15 .
Dans l'analyse de cytométrie de flux multicolore, des chevauchements spectrales possibles des fluorocromes choisis peuvent se produire. Par conséquent, comme indiqué ci-dessusLes compensations à une seule tache sont très utiles pour éviter les problèmes de chevauchement. En outre, le titrage d'anticorps est fortement recommandé afin de réduire la fluorescence du fond et d'obtenir des résultats optimaux. Une autre considération importante pour réduire la liaison non spécifique est l'utilisation de colorants de viabilité. Dans ce protocole, DAPI est utilisé comme colorant de viabilité. DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole) est une coloration fluorescente bleue qui se lie fortement aux régions riches en AT dans l'ADN. Le maximum d'excitation pour DAPI lié à l'ADN est de 358 nm, et le maximum d'émission est de 461 nm. Lorsqu'il est utilisé selon le protocole, DAPI tache les noyaux spécifiquement, avec peu ou pas d'étiquetage cytoplasmique, à l'exclusion des cellules mortes dans l'analyse du flux. Cependant, selon le panel d'anticorps choisi, d'autres colorants de viabilité, tels que 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) et iodure de propidium (PI), peuvent être utilisés. L'exclusion précise des cellules mortes et l'identification des cellules vivantes est une condition préalable pour surveiller avec succès les lymphocytes T in vitro , car il est importantIl faut avoir des procédures qui peuvent suivre la prolifération des lymphocytes avec une perturbation minimale de la viabilité et de la fonction des cellules.
Comme mentionné ci-dessus, il existe des étapes critiques pour l'étiquetage cellulaire et les analyses de prolifération avec des colorants de suivi cellulaire tels que le CFSE. À titre d'exemple décrit dans la littérature, une attention particulière doit être accordée à l'exclusion des cellules mortes / mourantes afin d'obtenir des distributions uniformes et des pics hippiques distinctifs lors de l'utilisation de CFSE 16 . Il existe de nombreux colorants de suivi des cellules disponibles dans le commerce, selon les panneaux de coloration. En alternative aux colorants de suivi cellulaire, on effectue un dosage thymidine titrié pour évaluer la prolifération des lymphocytes et d'autres cellules dans les études sur le cancer 13,14 . Les protocoles d'incorporation de la thymidine évaluent la replication de l'ADN pendant la division cellulaire par la mesure de la 3H- ou de la 14-thymidine radiomarquée. Bien que cette méthode iS assez sensible et bien établi, les inconvénients majeurs pour la technique thymidine titrée est qu'il implique la radioactivité et ne fournit pas d'informations au niveau cellulaire unique. D'autre part, l'analyse de cytométrie de flux CFSE fournit des informations claires sur les sous-ensembles de lymphocytes répondant et a moins de variabilité inter et intralaboratoire.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Nous reconnaissons les contributions techniques des centres d'excellence en recherche de cytométrie de flux, de micro-chirurgie et de bio-dépôt / pathologie au mont Sinaï. Ce travail a été soutenu par l'Action COST BM1305: Action pour mettre au point et accélérer les thérapies tolératives cellulaires (A FACTT), les fonds de développement de Mount Sinai Recanati / Miller Transplantation Institute, Ministerio de Ciencia e Innovacion SAF2013-48834-R et SAF2016-80031-R JO
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10% FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1,000x 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100x Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100x L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 100x Non Esential amino acids | Corning | 25025039 | |
| 1 M HEPES buffer | Corning | 25060CL | |
| 100 mM Sodium Pyruvate | ThermoScientific | SH30239.01 | |
| Penicilin/Streptavidyn | ThermoScientific | 15140122 | |
| Collagenese A | Roche | 70381322 | |
| DPBS (w/o calcium&magnesium) | Corning | 21031CV | |
| 70 µm Cell strainer | Fisher | 22363548 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5mg-F | |
| CFSE-FITC | Invitrogen | C34554 | |
| Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11452D | |
| 96 well U-bottom plate | Corning | 353077 | |
| Antibodies: | |||
| anti-Ly6C-APC | eBioscience | 175932-80 | |
| anti-Ly6G-Pe/Cy7 | Biolegend | 127617 | |
| anti-CD11b-Percp/Cy5.5 | eBioscience | 45011282 | |
| anti-CD45-APC/Cy7 | eBioscience | 47045182 | |
| anti-CD4-APC | eBioscience | 17004181 | |
| anti-CD8-P/ Cy7 | eBioscience | 25008181 | |
| LSRII Flow Cytometer | BD Bioscience | ||
| FACSDiva Software | BD Bioscience | ||
| C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J | The Jackson Laboratory | 008374 | |
| C57BL/6 | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Balb/c | The Jackson Laboratory | 000651 |
References
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