Summary
Nós simulamos um sistema de ressurgência marinha ferruginoso Precambrian em uma coluna de fluxo vertical-escala de laboratório. O objetivo foi compreender perfis como geoquímicas de O2 e Fe (II) evoluir como cianobactérias produzem O 2. Os resultados mostram a criação de um chemocline devido a Fe (II) oxidação pelo fotossinteticamente O produziu 2.
Abstract
Um conceito convencional para a deposição de alguns pré-cambrianas Banded Ferro Formações (BIF) parte do princípio de que o ferro ferroso [Fe (II)] ressurgência de fontes hidrotermais no oceano pré-cambriano foi oxidado pelo oxigênio molecular [O 2] produzida por cianobactérias. Os BIFs mais antigas, depositadas antes da Grande Oxidação Evento (GOE) em cerca de 2,4 bilhões de anos (Gy) atrás, poderia ter se formado por oxidação direta de Fe (II) por anoxigênicas photoferrotrophs sob condições anóxicas. Como um método para testar os padrões geoquímicos e mineralógicos que se desenvolvem em diferentes cenários biológicos, nós projetamos uma coluna de fluxo vertical, 40 cm de comprimento para simular um Fe anóxica (II) rico em representante de um oceano antigo sistema de ressurgência marinha numa escala de laboratório . O cilindro foi embalado com uma matriz de pérolas de vidro poroso para estabilizar os gradientes geoquímicos e amostras líquidas para a quantificação de ferro poderiam ser tomadas ao longo da coluna de água. O oxigénio dissolvido foidetectado de forma não invasiva através optodes a partir do exterior. Os resultados de experiências bióticos que envolvidas fluxos de ressurgência de Fe (II) a partir do fundo, um gradiente de luz distintas, de cima, e cianobactérias presente na coluna de água, mostra uma clara evidência para a formação de Fe (III) precipita minerais e desenvolvimento de um chemocline entre o Fe (II) e O 2. Esta coluna permite testar hipóteses para a formação dos BIFs por cultura de cianobactérias (e no futuro photoferrotrophs) sob condições simuladas Precambrianos marinhos. Além disso, nós supomos que o nosso conceito de coluna permite a simulação de vários ambientes químicos e físicos - incluindo marinhos ou lacustres sedimentos superficiais.
Introduction
O pré-cambriano (4,6-,541 Gy atrás) atmosfera experimentou uma acumulação gradual de fotossíntese produzido oxigênio (O 2), talvez pontuada por mudanças graduais na chamada "Grande Oxidação Event" (GOE) a cerca de 2,4 Gy atrás, e novamente no Neoproterozóico (1-,541 Gy atrás) como o 2 atmosférico se aproximarem dos níveis modernos 1. As cianobactérias são os restos evolucionários dos primeiros organismos capazes de fotossíntese aeróbica 2. Geoquímicos estudos evidências e modelagem apoiar o papel dos ambientes costeiros rasos em abrigar comunidades ativas de cianobactérias ou organismos capazes de fotossíntese aeróbica ou fototróficas oxigênicos, gerando oásis de oxigênio locais na superfície do oceano abaixo de um ambiente predominantemente anóxica 3-5.
A deposição de formações ferríferas (BIFs) a partir de água do mar ao longo dos pontos Precambrianos de ferro (II) (Fe (II)) como um importante geoquímico Constituent da água do mar, pelo menos localmente, durante a sua deposição. Algumas das maiores BIFs são depósitos de águas profundas, formando fora da plataforma e talude continental. A quantidade de Fe depositado é incompatível a partir de um ponto de vista o equilíbrio de massa com (ou seja, resistência) de origem predominantemente continental. Portanto, grande parte da Fé devem ter sido fornecidos de alteração hidrotermal de máfica ou fundo do mar ultramafic crosta 6. As estimativas da taxa de Fe depositado popa dos ambientes costeiros são consistentes com Fe (II) fornecido à superfície do oceano através de ressurgência 7. Para que Fe para ser transportado em correntes de ressurgência, deve ter estado presente na forma reduzida, mobile - como Fe (II). O estado de oxidação de Fe média preservada em BIF é 2.4 8 e pensa-se geralmente que BIF preservar Fe depositado na forma de Fe (III), formado quando ressurgência de Fe (II) foi oxidado, possivelmente por oxigénio. Portanto, explorar Fe (II) mecanismos potenciais de oxidação ao longo environme inclinaçãonts é importante entender como BIF formado. Além disso, refinado caracterização geoquímica de sedimentos marinhos identificou que as condições ferruginosos, onde Fe (II) esteve presente em uma coluna de água anóxica, eram uma característica persistente dos oceanos em todo o pré-cambriano, e não pode ter sido limitado a apenas o tempo e lugar onde BIF foram depositados 9. Portanto, há pelo menos dois bilhões de anos de história da Terra, interfaces de redox entre Fe (II) e O 2 nos oceanos rasos eram susceptíveis comum.
Numerosos estudos utilizar sites modernos que são análogos químicos e / ou biológicos de características diferentes do oceano pré-cambriano. Um bom exemplo são lagos ferruginosos, onde Fe (II) é estável e presente nas águas de superfície iluminada pelo sol, enquanto a atividade fotossintética (incluindo por cianobactérias) foi detectado 10-13. Os resultados destes estudos fornecem informações sobre as características geoquímicas e microbianas de um ico para anóxico / ferchemocline ruginous. No entanto, estes sites são geralmente fisicamente estratificada com pouca mistura vertical 14, em vez de as interfaces químicas que ocorrem em um sistema de ressurgência, e são pensados para apoiar a produção mais oxigênio no tempo pré-cambriano 4.
Um análogo natural para explorar o desenvolvimento de um oásis de oxigênio marinho sob uma atmosfera anóxica, e por um (II) sistema de ressurgência rico em Fe na coluna de água de superfície iluminada pelo sol não está disponível na Terra moderna. Portanto, é necessário um sistema de laboratório que podem simular uma zona de ressurgência ferruginosas e também apoiar o crescimento de cianobactérias e photoferrotrophs. A compreensão e identificação de processos microbianos e sua interação com um meio aquoso ressurgência que representa a água do mar pré-cambriano promove a compreensão e pode complementar as informações obtidas a partir do disco de rock, a fim de compreender totalmente os processos biogeoquímicos distintivas na Terra antiga. Para esse fim, uma coluna de escala laboratorial foi concebido em que o Fe (II) rico em meio de água do mar (pH neutro) foi bombeada para a parte inferior da coluna, e bombeado para fora a partir do topo. Iluminação foi fornecido na parte superior para criar um 4 cm de largura "zona photic" que apoiou o crescimento de cianobactérias no top 3 cm. Os ambientes naturais são geralmente estratificada e estabilizado por gradientes físico-químicas, como salinidade ou temperatura. A fim de estabilizar a coluna de água sobre uma escala de laboratório, o cilindro coluna foi empacotada com uma matriz de pérolas de vidro porosa que ajudou a manter o estabelecimento de padrões geoquímico que se desenvolveram durante o experimento. Um fluxo contínuo de gás N2 / CO 2, foi aplicada para lavar o espaço superior da coluna, a fim de manter uma atmosfera anóxica reflectora de um oceano antes da GOE 15. Depois de um fluxo constante de Fe (II) foi estabelecida, cianobactérias foram inoculados através da coluna, e a sua growth foi monitorizada por contagem de células em amostras retiradas através de portas de amostragem. O oxigénio foi monitorada in situ, colocando folhas optode sensíveis ao oxigénio sobre a parede interna do cilindro de coluna e as medições foram feitas com uma fibra óptica a partir de fora da coluna. Aquosa Fe especiação foi quantificada por amostras remoção dos portos de amostragem horizontal de profundidade resolvida e analisados com o método Ferrozine. Os experimentos de controle abióticos e resultados demonstram uma prova de conceito - que um análogo de escala de laboratório da coluna de água antigo, mantido em isolamento da atmosfera, é realizável. Cianobactérias cresceu e produziu o oxigênio, e as reações entre Fe (II) e oxigênio foram resolúvel. Aqui, a metodologia para a concepção, preparação, montagem, execução e amostragem de tal coluna são apresentados, juntamente com os resultados de um 84 horas de execução da coluna enquanto inoculados com a cianobactéria marinha Synechococcus sp. PCC 7002.
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Protocol
1. Preparação de cultura médio
Nota: As informações sobre os equipamentos necessários, produtos químicos e materiais para a preparação do meio de cultura é listado na Tabela 1 Itálico códigos alfanuméricos entre parênteses referem-se a equipamentos discriminados na Tabela 2 e mostrado na Figura 1..
- Prepare 5 L de meio marinho fotoautotrófico (MP) (adiante designado por "meio") seguindo o protocolo de Wu et al. 16. Ajustar o pH para 6,8 utilizando HCl M anóxica e estéril 1 ou 0,5 M NaCO3. Como fonte para o Fe (II), adicionar 3,5 ml de um 1 M anóxica e estéril FeCl2 -solution para alcançar uma Fe final (II) a concentração de 500 uM após filtrar a solução forma no passo seguinte.
- Armazenar a solução de meio a 5 ° C durante 48 horas, a fim de precipitar o Fe (II) de carbonato e fosfato minerais. Fe (II) adição e precipitação de Fe mineral resulta em um pH mudança, portanto, reajustar o pH de volta para 6,8. Filtra-se o meio numa caixa de luvas anóxica (100% N 2) através de uma unidade de filtro de 0,22 um. Repartir o meio filtrada para um frasco estéril 5 L de vidro (E.'1) dentro de um porta-luvas e tampa com uma tampa de borracha butílica estéril.
- Lavar o espaço superior do frasco de meio com N2 / CO2 (v / v, 90/10) por inserção de uma agulha descartável ligada à linha de gás para a rolha, e uma segunda agulha que actua como um respiradouro. Certifique-se de alterar o volume do headspace 10 vezes. Por exemplo, com um fluxo de gás constante de 10 ml / seg, lave o volume superior de 50 ml durante pelo menos 50 seg (comparar Hungate & Macy 17).
- Cobrir a garrafa meio (E), que está agora pronto para usar com folha de alumínio e armazenar a RT em ambientes escuros para impedir a oxidação de Fe (II). Permitir que 3 dias para a preparação médio.
2. Preparação da Cultura
"> Nota:.. A cultura de Synechococcus PCC 7002 SP que é usado na experiência da coluna é descrito como marinho unicelular género cianobactérias photoheterotrophic 18 Foi fornecida pelo Dr. M. Eisenhut (Instituto de Bioquímica, Universidade de Duesseldorf, Alemanha) . Para o estudo atual da cultura material foi cultivado em meio anóxico MP sem Fe adicional (II).- Preparação de 100 ml de meio de MP seguindo o protocolo de Wu et al. 16, mas o cloreto férrico substituto com 1 ml de L citrato de amónio / férrico com 6 mg / ml.
- Em condições anóxicas (luvas, 100% N2), dispensar o meio em um 120 ml de garrafas de soro estéril, tampa com uma tampa de borracha butílica estéril e friso com cápsula de alumínio. Alterar o headspace para N 2 / CO 2 (v / v, 90/10) (compare Hungate & Macy 17) e inocular com 5% da cultura estoque. Subsequentemente armazenar a cultura numa incubadora de luz a 25 ° C e 600 Lux a partir de um Tungsten lâmpada.
- Desde Synechococcus sp. PCC 7002 é fotossensível, após a transferência, cobrir o frasco de soro com uma toalha de papel fino para o primeiro 24 horas na incubadora luz. Permitir que a cultura a crescer durante 6-8 dias. actividade fotossintética irá resultar na oxidação de Fe (II) e Fe (II) não será estático para a escala de tempo de crescimento celular, por conseguinte transferir a cultura depois de 7 dias para manter o Fe (II) no meio e as células adaptadas a Fe (II).
- Monitorar a densidade celular por recolha de amostras para a densidade óptica (DO) medições: A densidade de células (células / ml) da cultura pode ser determinado através da absorvância da amostra de suspensão de células em uma foto-espectrómetro, num comprimento de onda de 750 nm 19. A relação linear entre OD 750 e contagem de células microscópicas diretos de uma cultura em fase log irá determinar a densidade absoluta de célula 20.
- Assim que uma densidade celular de 10 8 células / ml é atingida,embrulhar a garrafa de soro com folha de alumínio, a fim de parar a produção de oxigênio pela fotossíntese.
- Remover o O2 na suspensão de células utilizando um filtro de seringa estéril de 0,22 um ligado a uma longa (100 mm) da agulha descartável inserido no meio líquido. Lave o headspace e da bolha da cultura com N 2 / CO 2 por 5 min (compare Hungate & Macy 17). Manter a amostra no escuro até a inoculação na coluna.
3. Preparação de Itens e peças individuais para Experimental Set-up
Nota: As informações sobre o equipamento necessário para o conjunto experimental, quantidades e especificações estão listadas na Tabela 2. Partes dos itens que serão utilizados para a montagem experimental são preparados com antecedência e são rotuladas individualmente com uma letra maiúscula única (AG), listadas na Tabela 2 e mostrado como close-ups na Figura 1 bem. Itálico códigos alfanuméricos entre parênteses no protocolo referem-se ao equipamento discriminada na Tabela 2 e são mostrados na Figura 1.
- A fim de preparar as portas de amostragem (D) para a coluna, fechar as portas fechadas por uma rolha de borracha butílica apertada (A.3). Inserir uma agulha de aço inoxidável (D. ') na tampa de borracha butílica. Certifique-se de que a ponta da agulha está no centro da coluna.
- Conectar-se a agulha para um tubo de borracha (D.2) e selar a ligação com um tubo termorretráctil (D.3). Conecte a outra extremidade do tubo a um pequeno conector Luer tubo de bloqueio ( 'D.5), selar a ligação com um tubo termorretráctil (D.3) e tape o conector do tubo com uma tampa de plástico apropriado (D.6) .
Nota: Dependendo do número desejado de pontos de amostragem é necessário fornecer uma porta principal com várias portas de amostragem - therefore inserir as agulhas de aço inoxidável (D.1) em um ângulo oblíquo na rolha de borracha butílica.
- Conectar-se a agulha para um tubo de borracha (D.2) e selar a ligação com um tubo termorretráctil (D.3). Conecte a outra extremidade do tubo a um pequeno conector Luer tubo de bloqueio ( 'D.5), selar a ligação com um tubo termorretráctil (D.3) e tape o conector do tubo com uma tampa de plástico apropriado (D.6) .
- Para conectar as garrafas de médio e de descarga para a coluna, modificar rolhas de borracha butílica seguintes os seguintes passos:
- Insira dois capilares de aço inoxidável (E.3; E.4) na tampa de borracha butílica (E.2). Ligue os tubos de borracha apropriados (E.6) para estes capilares e selar a conexão com tubos de calor encolhe (E.5).
- Adicionar uma ligação de tubo (E.7) para a outra extremidade do tubo capilar mais do (E.3) e também fixar este conector com um tubo termo-retráctil (E.5).
- Conectar uma agulha de aço inoxidável (E.11) à extremidade livre do outro tubo ligado ao capilar de mais curto (E.4), selar as ligações com termorretráctil tubos (E.5), e inserir a outra extremidade do agulha de aço inoxidável em uma rolha de borracha butílica menor (E.10). Insira dois capilares de aço inoxidável (G.3) em uma tampa de borracha grande butil (G.2) e anexar os tubos apropriados de borracha (G.4; G.5). Ligue a extremidade livre do tubo de borracha mais curto (G.4) para um capilar garrafa de descarga médio (W2). Equipar a extremidade livre do tubo mais longo (G.5) com um conector de tubo pequeno (G.6). Repita essas etapas, a fim de preparar uma nova rolha de borracha butílica para uma segunda garrafa de descarga.
- Prepara-se o tampão para o painel de distribuição médio (M) através da inserção de duas agulhas de aço inoxidável (F.3) para uma rolha de borracha de butilo (F.2), a fim de produzir linhas de fornecimento de dois meios para a coluna. Anexar um tubo de borracha (F.4) a cada uma das agulhas e conectar uma garrafa de forma capilar (C1) a um dos tubos de borracha, respectivamente.
- A fim de preparar as glândulas para a linha de fornecimento de meio (B), conectar um meiocapilar de fornecimento (C2) a um conector de tubo pequeno (B.3) com um tubo de borracha (B.4). Repita esta etapa para outra glândula de alimentação médio.
- Use o capilar de descarga mais médio (w1) em vez de preparar as glândulas para a linha de descarga médio e siga os passos anteriores (compare (B) na Figura 1).
Nota: É útil para rotular entrada e na saída com diferentes cores de fita para auxiliar na montagem apropriada.
- Use o capilar de descarga mais médio (w1) em vez de preparar as glândulas para a linha de descarga médio e siga os passos anteriores (compare (B) na Figura 1).
- Montar as peças de painel de troca de gás do espaço interno (C) através da inserção de dois longo Luer Lock agulhas de aço inoxidável (c.2) para um tubo de borracha (C.1) e certificar-se de que as pontas das agulhas atingir 4 cm para fora da outra extremidade do tubo. Encha o tubo com Polymers cola (C.8) e deixar secar o conjunto por pelo menos 6 horas.
- Vagamente encher duas seringas Luer bloqueio de vidro (C.3) com algodão (C.4).
- Separadamente preparar dois esfregar butilber rolhas (C.5), um com uma agulha de aço inoxidável inseridas (C.6) eo outro com uma agulha de aço inoxidável (C.7). Não ligue para as seringas de vidro, ainda.
- Prepara-se uma seringa de vidro (E.8) cheia com algodão (E.9) para uso posterior de acordo com a garrafa e gás bloco médio (GP).
- Montar o equipamento para um pacote de gás de 10 L (gp) ligando um tubo de borracha (gp.1) na válvula do bloco de gás. Inserir um conector de tubo (gp.2) na extremidade livre do tubo de borracha. Repita este procedimento para um segundo pacote de gás de 10 L.
4. Esterilização da coluna e do Equipamento
Nota: Dependendo das propriedades do material, o equipamento é esterilizado por um dos três métodos seguintes:
- Esterilizar o material feito de vidro por forno seco (180 ° C durante 4,25 h):
- Esterilizar o equipamento para fazer média (ver
- Esteriliza-se o equipamento para a coluna instalado num segundo passo. Enrole as seringas de vidro (C.3; E.8; F.1 - preparado na seção 3) com folha de alumínio e certifique-se de que as rolhas de borracha butílica correspondentes são removidos.
- Coloque as esferas de vidro (a.2) numa proveta de vidro e cobrem a parte superior com a folha de alumínio. Também cobrir a placa de vidro transparente (A.4), 4 x grandes conectores tubulares (b.2) e o conector de 3 vias (G.7) com folha de alumínio e forno-esterilizar tudo.
- Esterilizar o equipamento para fazer média (ver
- Esterilizar plásticos e líquidos autoclaváveis em autoclave (120 ° C, 10 bar, 20 min):
- No primeiro passo, Sterilize Widdel o balão com o meio, a solução -buffer NaHCO3 e duas rolhas de borracha butílica para o frasco de vidro de 5 L.
Nota: rolhas de borracha de butilo são preparados primeiro por ebulição em água ultrapura 3 vezes e, em seguida autoclavada em um copo de vidro com um pouco de água, coberta com folha de alumínio. As rolhas de molhadas são mais fáceis de inserir em garrafas de vidro. - Num segundo passo esterilizar o equipamento para a coluna de montagem experimental. A fim de preparar a coluna para esterilização na autoclave, enrole a abertura superior, as aberturas de fornecimento de mídia, as aberturas de descarga media, eo headspace desabafar com folha de alumínio antes da autoclavagem.
- Cobrir as portas de amostragem (D.'5) com as tampas de plástico apropriados (D.'6) e certifique-se de remover os grampos (D.4) antes da autoclavagem.
- Enrole as rolhas de borracha butílica e os capilares correspondentes para as garrafas de médio e de descarga (E.2; 2 x G.2 - i preparadosecção n 3), as rolhas de menores para as seringas de vidro (2 x C.5; E.'10 '; F.'2 - preparado na seção 3) e os capilares ligados às glândulas meio de alimentação e de descarga (s2; w1 - preparada na secção 3.4) em uma folha de alumínio e esterilizar todos os equipamentos na autoclave.
- Após a esterilização, a coluna secar e equipamento esterilizado num forno a 60 ° C durante mais 4 h.
- No primeiro passo, Sterilize Widdel o balão com o meio, a solução -buffer NaHCO3 e duas rolhas de borracha butílica para o frasco de vidro de 5 L.
- Uma vez que o tubo de bomba (AP) não é autoclavável, esterilizá-los em uma solução de etanol (EtOH) (80% de EtOH, 20% de água). Encher um copo adequado com EtOH-solução e coloque o tubo de bomba na mesma, assegurando que o tubo é completamente cheio com EtOH-solução. Retire depois de 3 horas e envolva diretamente em folha de alumínio pré-esterilizado (forno-esterilizado) e deixe secar à temperatura ambiente durante 2 h.
5. Montagem da coluna e do Equipamento
- Colocar a coluna (A) sobre uma superfície plana e estabilizar com um suporte de laboratório e grampos. Certifique-se de trabalhar em condições estéreis (por exemplo, dentro de 40 cm de um bico de Bunsen ou sob um capuz de fluxo laminar). Remova cuidadosamente a folha de alumínio da abertura superior e preencher as vidro-esferas esterilizadas (a.2).
- Prepara-se o vidro de relógio (a.4), a fim de fechar hermeticamente a coluna através da aplicação da cola Polímeros (A. 5) para a superfície interior na área onde estarão em contacto com a coluna. Pressione levemente o vidro de relógio no lugar no topo da coluna, a fim de cola ambas as partes firmemente junto. Permitir que pelo menos 6 horas para a instalação para secar.
Nota: É possível colocar um arame flexível estéril, fina entre a borda e a coluna de vidro de relógio, a fim de remover facilmente o vidro de relógio depois do experimento.
- Prepara-se o vidro de relógio (a.4), a fim de fechar hermeticamente a coluna através da aplicação da cola Polímeros (A. 5) para a superfície interior na área onde estarão em contacto com a coluna. Pressione levemente o vidro de relógio no lugar no topo da coluna, a fim de cola ambas as partes firmemente junto. Permitir que pelo menos 6 horas para a instalação para secar.
- Enquanto trabalhava em condições estéreis anexar os seguintes componentes para a coluna:
- Ligue os tubos de borracha (b.1) e os conectores de tubo correspondentes (b.2) ao fornecimento e descarga aberturas médias (compare (B) na Figura 1).
- Ligar as ligações de tubo das glândulas (b.3) para fornecimento de meios de comunicação e de descarga (preparada na secção 3.4) para os conectores correspondentes na coluna (comparar (B) na Figura 1).
- Fixe o painel de troca de gás headspace (compare (C) na Figura 1 - preparado na seção 3.5) ao headspace de ventilação na coluna e conectar as seringas de vidro (C.3) para as agulhas correspondentes de aço inox (c.2) e inserção as rolhas apropriadas de borracha butílica (C.6; C.7 - preparados na seção 3.5.2) para as seringas de vidro cheio de algodão (C.3).
- Insira as rolhas de borracha butílica para as garrafas de descarga (2 x G.20; - preparado na seção 3.2) em dois frascos de 3 L de vidro estéreis (G.1), e ligar as ligações de tubo das garrafas (G.6) para o conector de 3 vias (G.7).
- Conecte a extremidade livre do capilar Glândula de descarga médio (W1) à extremidade livre de um capilar garrafa de descarga (W2) com tubos de bomba (pt). Repita este procedimento para o segundo capilar Glândula de descarga médio e a segunda garrafa de descarga.
- Ligar a extremidade livre de uma garrafa capilar médio (S1) para a extremidade livre do capilar de fornecimento glândula médio (S2) com o tubo de bomba (PT). Repita este procedimento para o segundo capilar garrafa médio e o segundo meio capilar glândula abastecimento.
- Monte o painel de distribuição médio, inserindo a rolha com os capilares correspondentes (F.2 - preparado na seção 3.3) para dentro da seringa de vidro do meiopainel de distribuição (F.1).
- Ligue o painel de distribuição de média ao conector da rolha de borracha butílica para o frasco de forma (E.7 - comparar F na Figura 1).
- Ligue a linha 2 de gás N2 / CO para o painel de troca gasosa do espaço livre acima do Luer Lock agulha de aço inoxidável (ver a posição (LLF) na Figura 1), e descarregar a instalação coluna e sistema capilar com N2 / CO2 a baixa pressão (<10 mbar). Manter uma saída de gás nas extremidades abertas do capilar forma garrafa (E.3), o conector de 3 vias (G. 7), e as portas de amostragem (D.5). Portanto, certifique-se de ter as tampas das portas de amostragem (D.6) ligeiramente abertos, para manter condições estéreis através de uma sobrepressão de gás que flui para fora.
- Lave a instalação completa durante pelo menos 20 min.
Nota: Além disso, é possível fechar a outgassing agulha (C.6) do painel de troca gasosa do espaço de cabeça com um tubo de borracha apropriado e uma pinça, a fim de aumentar a eficiência de lavagem a instalação completa.
- Lave a instalação completa durante pelo menos 20 min.
- Enquanto isso, encher um saco de gás de 10 G (GP) com N2 / CO2 (v / v, 90/10), na sequência de 10 ciclos de enchimento e a eliminação de ar (usando uma bomba de vácuo) a totalidade do volume para garantir que o saco é completamente anóxica . Certifique-se de fechar a válvula da embalagem de gás após o preenchimento final. Repita este procedimento com um segundo pacote de gás, mas fechar a válvula depois de purga (ou seja, deixá-lo vazio).
Nota: O N 2 / CO 2 pacote cheio de gás vai ser ligado ao frasco de forma a fim de compensar o volume superior a aumentar devido à perda de meio por bombagem. O N 2 / CO 2 lavada, mas pacote de gás vazia, vai depois ser ligados às garrafas de descarga, a fim de permitir que o gás escape no espaço superior, devido ao aumento do volume de descarga de líquido. - Inserir tele butil rolha de borracha (E.10 - preparada no ponto 3.2.3) para a seringa de vidro esterilizada preenchido com algodão (E.8 - preparada na secção 3.6).
- Coloque a garrafa meio cheia e fechada (E - preparado na seção 1) na bancada do laboratório ao lado da rolha para o meio garrafa (E.2), e preparar-se para ligar a rolha da garrafa meio utilizando o seguinte procedimento:
- Feche o fluxo de gás N 2 / CO 2 no capilar (E.3) fechando o tubo de borracha correspondente (E.5) com uma braçadeira.
- Levemente levantar a tampa de borracha butílica da garrafa médio e liberar o espaço livre com N 2 / CO 2 (50 mbar) por enforcamento um, algodão seringa -filled esterilizado com uma inclinação, longa agulha de metal (1 mm x 140 mm) no gargalo da garrafa meio (compare Hungate & Macy 17).
- Mudar a agulha de metal longo da seringa (anteriormente utilizado para a lavagem do headspace) a uma agulha descartável (0,9 mm x 45 mm; amplamente disponível) e injetar na rolha, a fim de liberar o espaço superior do frasco de meio com N 2 / CO 2.
- Certifique-se de que tem um ligeiro fluxo de saída de gás na extremidade aberta da seringa gás (E.8 - montada na secção 5.10) ligado à tampa da garrafa forma. Lavar o espaço superior do frasco de forma (E) e a seringa de vidro (E.8) durante pelo menos 4 minutos.
Nota: Se necessário, abra aagulha desgaseificação (C.6) do painel de troca gasosa do espaço de cabeça de novo, a fim de manter um fluxo de saída de gás na extremidade aberta da agulha.
- Rapidamente abrir a válvula de gás do pacote e pressionar ligeiramente sobre o saco para manter uma saída de N2 / CO2, a fim de limpar o tubo e o conector do bloco de gás.
- Assim que o excesso de pressão é libertado a partir da forma garrafa, rapidamente ligar o conector do bloco de gás (gp.3) ao conector correspondente da seringa de vidro (E.8).
- Abrir a válvula de gás do pacote (GP)ligado às garrafas de descarga (G) para permitir ao ar ser libertado para o pacote de gás, enquanto as garrafas de descarga de encher com meio de saída.
6. A inoculação de bactérias na Coluna
Nota: Para uma experiência de controlo abiótico este passo é ignorado.
- Uma vez que a cultura de células irá ser injectado directamente na coluna através de rolhas de borracha de butilo dos principais pontos de amostragem ao longo do lado da coluna, certifique-se de ter preparado seis seringas com agulhas que são o tempo suficiente para atingir o centro do corpo da coluna.
- Esteriliza-se o lado de fora da tampa de borracha de butilo das seis portas de amostragem principais na coluna (A.3) com uma solução de EtOH (80%).
- Tenha a garrafa de soro com a cultura para inoculação pronto (preparado na seção 2) e esterilizar a rolha de borracha butílica por chamas várias gotas de solução de EtOH. Lave a seringa estéril com N2 / CO2, antes de tomar uma aliquota da cultura. Tomar 1 ml of a solução da célula anóxica e injectá-la no centro da coluna através das rolhas de borracha de butilo dos principais portos de amostragem (a.3).
Nota: Dependendo do crescimento bacteriano, pode ser necessário ajustar a velocidade de bombeamento (ou mesmo parar a bombagem) durante os primeiros dias da fase de retardamento para o crescimento e desenvolvimento de células para prevenir as culturas de ser lavado para fora.
7. Amostragem
Nota: A fim de recolher amostras através dos gradientes químicos que se desenvolvem no interior da coluna, é necessário iniciar a amostragem dos pontos de amostragem superiores antes de as portas mais profundas, como a perda de volume ocorre. Certifique-se de manter condições estéreis (por exemplo, através do trabalho dentro de 40 cm de um bico de Bunsen ou sob um capuz de fluxo laminar).
- Recolher as primeiras amostras de 24 h após a inoculação. Lave a seringa que vai ser utilizado para a amostragem com N estéril 2 / CO 2, a fim de evitar a injecção de oxigénio para o SAportos mpling (D). Certifique-se para encher a seringa com N 2 / CO 2 antes da amostragem.
- Remover rapidamente a tampa de plástico (D.6) e inserir a seringa de amostragem para o conector do tubo (D.5). Manter um pequeno intervalo entre seringa e conector do tubo. Libertar o gás a partir da seringa e lave o conector do tubo com N2 / CO2.
- Firmemente ligar a seringa ao conector do tubo. Remover o grampo (D4) e tomar uma amostra de cerca de 1 ml.
- Depois de desenhar a amostra e antes de retirar a seringa, coloque a braçadeira (D.4). Em seguida, retire a seringa de amostragem e firmemente fechar o conector do tubo (D.5), com a tampa de plástico correspondente (D.6).
- repita imediatamente passos 7,1-7,3 para a amostragem de cada porto.
- Recolher o próximo conjunto de amostras a cada 24 horas.
Nota: Para amostras adicionais em diferentes intervalos de tempo, que é necessário para remover uma pequena AMount de amostra (por exemplo, 0,2-0,4 ml) inicialmente antes que a amostra pode ser feita, de modo a remover o elemento residual no interior do tubo de recolha de amostras e para atingir as amostras representativas do interior da coluna.
8. Métodos de Análise
- Quantificação de oxigénio:
Nota: A concentração de oxigénio no interior do meio de fluxo e o espaço da cabeça da coluna é quantificada de forma não invasiva e não destrutiva utilizando os sensores de oxigénio ópticos e manchas da folha fluorescentes oxigénio sensível de 0,5 x 0,5 cm (chamados optodes), colada ao longo a parede de vidro interna da coluna, utilizando cola de silicone (A.6). Garantiu-se que os adesivos sensíveis a oxigénio da folha são insensíveis às espécies de Fe, a fim de conseguir leituras fiáveis.- Certifique-se para calibrar o software de computador com os parâmetros de calibração adequados para os optodes que são utilizados na coluna. Os sensores de oxigênio ópticos vêm com um Calibrat específicaião para a medição utilizando um medidor de oxigénio de fibra óptica controlada por computador correspondente.
- Inicie a medição e ter o cuidado de manter a fibra óptica polímero do medidor de oxigénio a um ângulo recto com a folha sensível ao oxigénio que é colada no interior da parede de vidro transparente da coluna.
- Repetir a medição para cada ponto de medição de O 2 ao longo da coluna.
- Fe (II) e análise de Fe total de amostras aquosas:
- Uma vez que o Fe (II) é rapidamente oxidado pelo oxigénio no ar, a pH neutro, estabilizar as amostras de líquido aquoso para Fe (II) quantificação imediatamente em solução de 1 M de HCl. Para um volume de amostra final de 1 ml de mistura de 0,5 ml da amostra líquida com HCl 0,5 M ml 2.
- Quantificar Fe total após a incubação de uma aliquota da amostra M de HCl-1 estabilizada com cloridrato de hidroxilamina (10% p / v, em HCl 1 M) durante 30 min. Este reagente reduz todo o Fe (III) a Fe (II), que pode, então, ser quantificada através do ensaio Ferrozine
- Executar uma Ferrozine ensaio utilizando um leitor de placas de micro-titulação. Medir a absorvância a um comprimento de onda de 562 nm. Certifique-se de ter padrões dentro da faixa de Fe detectável (II) e as concentrações de Fe total.
Nota: Se as concentrações de Fe, na amostra de líquido exceder calibrações padrão, é necessário diluir a amostra estabilizada com HCl 1M.- Calcular a concentração de Fe (III) por a diferença entre o total de Fe e de Fe (II).
- Executar uma Ferrozine ensaio utilizando um leitor de placas de micro-titulação. Medir a absorvância a um comprimento de onda de 562 nm. Certifique-se de ter padrões dentro da faixa de Fe detectável (II) e as concentrações de Fe total.
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Representative Results
experimento controle
Experimentos de controle abiótico (10 dias) demonstraram concentrações consistentemente baixos de oxigênio (O 2 <0,15 mg / L) sem flutuações significativas na Fe (II) -profile ao longo da coluna de água de ressurgência. A formação de precipitados (presumivelmente Fe (III) (oxyhydr-) óxidos) no reservatório médio e a ligeira diminuição do Fe (II) concentração global de 500 mm a 440 mM durante 10 dias indicar alguma difusão de oxigênio através de ligações feitas de borracha (por exemplo, E.6; gp.1 na Figura 1) 22 para esta experiência, as concentrações de oxigénio mais baixas que eram razoavelmente possível foram ≤0.15 mg / L e se encontra no intervalo de quantificação sensível ao oxigénio e acima do limite de detecção. 0,03 mg / L. valores de oxigênio abaixo de 0,15 mg / L são para o remainder deste documento referido como "anóxico".
experimento biótico
Parâmetros visíveis, crescimento celular e alterações na coluna de água
Antes da inoculação no dia 0 sem precipitados eram visíveis (Figura 2 A). Isto indicou que a coluna foi adequadamente a configuração e que nenhum oxigénio estava presente (comparar com a figura 3 A), que pode conduzir à oxidação do Fe (II) e a formação de Fe (III) precipita. Como resultado, a concentração de Fe (II) foi constante ao longo da coluna de água de afloramento, uma vez que é mostrada no perfil na Figura 4A. A Figura 2 A mostra que o gradiente de luz foi reduzida a superior de 6 cm dentro docoluna de água, utilizando a matriz de esferas de vidro no cilindro coluna.
A cor verde dentro de topo de 2,0 cm de coluna de água a 84 horas após a inoculação indica o crescimento das cianofíceas (Figura 2 B). A banda laranja claro notável a uma profundidade de -3 cm (destacado pela seta na Figura 2 B) abaixo da banda do verde é devido a FE-precipitados que se formaram durante o Fe (II) a oxidação por oxigénio molecular, produzidas pelo cianobactérias. precipitados semelhantes também eram visíveis na superfície da coluna de água. Espuma laranja claro formado na coluna de água da superfície 84 horas após a inoculação (Figura 2 B), indicando a produção de O 2 por cianobactérias. Os precipitados sobre a superfície da coluna de água, presumivelmente formado devido ao oxigénio, que é a saída dos gases nosuperfície. Residual de Fe (II) foi eventualmente oxidado na superfície e precipitados na matriz de pérolas de vidro formadas.
gradiente de oxigênio
Antes da inoculação no dia 0, determinou-se a concentração inicial de O 2 no meio líquido. A Figura 3 mostra claramente que a concentração de O 2 ao longo de toda a coluna de água foi consistentemente abaixo da concentração presente na experiência de controlo. O pré-inoculação O2 -concentration nunca excedeu valores de 0,13 mg / LO 2 (O2 média = 0,099 ± 0,002 mg / L). Isto indica que a coluna foi anóxica antes da inoculação.
A Figura 3 B mostra um aumento da concentração de O2 no84 horas após a inoculação com cianobactérias. Isto, juntamente com a biomassa verde visível (Figura 2 B) são consistentes com a produção fotossintética e a acumulação de O 2 na coluna. A concentração de O 2 após 84 horas alcançada uma concentração máxima de O 2 = 29,87 mg / L em uma profundidade -0,5 cm abaixo da superfície da coluna de água. Os 2 valores S na Figura 3 B indicam que os O 2 níveis eram sempre acima de concentração de fundo na parte superior de 8,5 cm dentro da coluna de água (O 2> 0,15 mg / L). Visivelmente alta concentrações de O 2 (> 0,50 mg / L) foram detectados de -0,5 para -5,5 cm de profundidade abaixo da superfície da coluna de água. Baixas concentrações de O 2 ≤ 0,15 mg / L em profundidades abaixo de -10.5 cm, juntamente com o valor medido menor para O 2 = 0,09 mg / L a uma profundidade de -20.5 cm indicam que Tse áreas foram anóxica.
Fe (II) gradiente
A Figura 4 A mostra que o Fe (II) a concentração no dia 0, antes da inoculação com cianobactérias, foi constante em toda a coluna de água com uma concentração média de Fe (II) média = 282,6 ± 6,8 uM. A concentração no reservatório de forma no dia 0 era de Fe (II) do reservatório = 320,4 ± 11,6 uM.
84 horas após a inoculação com cianobactérias o Fe concentração (II) diminuiu consideravelmente nas superior 9 cm dentro da coluna de água. A Figura 4 B mostra um Fe (II) gradiente distinto, em que as concentrações de Fe (II) diminuem para a superfície superior da coluna de água. No entanto, o Fe (II) foi ainda detectado na superfície da coluna de água. º e menor de Fe (II) a concentração era detectado directamente abaixo da superfície do meio líquido a uma profundidade de -0.9 cm. Fe (II), as concentrações aumentou com a profundidade a partir de Fe (II) = 9,9 ± 2,8 ^ M em -0.9 cm a Fe (II) = 258,6 ± 3,1 uM a uma profundidade de -8.9 cm, formando um linear positiva íngreme Fe (II) gradiente ao longo de profundidade ([Fe (II), d] = (d + 1,278) 0,031 ∙ -1; d: profundidade (cm) ; R2 = 0,9694) para limitar a parte superior 6.8 cm. Áreas no meio líquido abaixo -9 cm de profundidade permanecer sensivelmente constante e não mostram nenhuma diminuição significativa das suas concentrações de Fe (II) em comparação com os seus valores iniciais para o Fe (II) no Dia 0 (teste t, p> 0,05).
Figura 1. Experimento esquemática configurar. Os códigos alfanuméricos para itens referem-se a peças listadas na Tabela 2.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54251/54251fig1large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Mudanças visíveis na matriz de contas de vidro em todo o cilindro coluna antes e 84 horas após a inoculação com cianobactérias. Praças-de-rosa são sensores de oxigênio. (A) Close up da parte superior 6 cm na coluna criada antes da inoculação. A coluna de líquido enchido mostrando um gradiente de luz visível. A matriz de esferas de vidro reduz o gradiente de luz visível para os superiores a 6 cm. (B) Close up da parte superior seis centímetros 84 horas após a inoculação. O verde indica biomassa visível, mais denso no topo da coluna onde a intensidade da luz é maior. A seta aponta para uma banda laranja fracamente visíveis, a qual resulta da formação de Fe(III) precipita devido a Fe (II) oxidação por O 2 molecular produzido por cianobactérias. espuma cor de laranja pouco visíveis sobre a superfície da coluna de água indica Fe (III) também está precipitando lá. O 2 a saída dos gases através da superfície faz com que a formação de espuma do Fe (III) precipita. (C) Visão de cilindro coluna cheia. O crescimento visível de cianobactérias se limita aos superiores 4 cm, devido à disponibilidade de luz limitada com a profundidade. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. perfil oxigénio dentro da coluna de água antes e 84 horas após a inoculação com cianobactérias. Zero cm de profundidade no eixo dos y indica a água Colusuperfície mn. Os valores positivos para profundidades referem-se ao espaço de topo acima do nível do meio líquido, enquanto que os valores negativos representam profundidades dentro da coluna de água. Note-se a escala logarítmica para concentrações de O 2 no eixo dos x. A linha a tracejado vertical indica o limiar de condições anóxicas (O 2 ≤ 0,15 mg / L). (A) perfil de oxigênio [0h] antes da inoculação. Valores para O 2 foram constantemente abaixo de 0,13 mg / l ao longo da coluna de água. (B) perfil de Oxigénio 84 horas após a inoculação. O 2 foi acima de 0,5 mg / L no Alto 5,5 cm de coluna de água. O 2 concentrações foram maiores do que as concentrações de fundo (≥ 0,15 mg / L, linha a tracejado) em áreas acima -8,5 cm de profundidade. Áreas mais profundas foram anóxica com O 2 ≤ 0,15 mg / L. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 4. Perfil de Fe (II) dentro da coluna de água antes e 84 horas após a inoculação com cianobactérias. Nota: As barras de erro representam repetições técnicas deduzidas a partir de medições em triplicado de uma amostra no ensaio Ferrozine. (A), Fe (II) perfil [0h] antes da inoculação. Os valores de Fe (II) fosse constante ao longo da coluna de água com um valor significativo para o Fe (II) média = 282,6 ± 6,8 uM. Variações na (II) a partir de Fe resultado perfil única amostra de Fe (II) quantificações. Fe (II) quantificação em triplicata de amostra provavelmente levaria a menor variação. (B) Fe (II) perfil 84 horas após a inoculação. Visivelmente menor teor de Fe concentrações (II), na parte superior de 6,8 cm dentro da coluna de água. Fe (II) valores abaixo de -8,9 cm de profundidade apresentam maior Fe(II) concentrações que não diferem significativamente dos valores iniciais Fe (II) antes da inoculação com cianobactérias (T-test, p <0,05). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Equipamento | Quantidade | Descrição do item | Informações detalhadas sobre o | ||
| marca | Despacho n.º | adress referência | |||
| 1 | Widdel balão (5 L) | Ochs | 110015 | labor-ochs.de | |
| 2 | As garrafas de vidro (5 L) | Rotilabo | Y682.1 | carlroth.com | |
| 3 | pipetas de vidro (5 ml) | 51714 | labor-ochs.de | ||
| 1 | 0,22 Steritop unidade de filtro (0,22 membrana de polietersulfona) | Millipore | X337.1 | carlroth.com | |
| 0,5 m 2 | Papel alumínio | - | |||
| Suprimentos | - | N 2 - caixa de luvas (100% N 2) | - | ||
| - | N2 / CO 2 - gás (90/10, v / v; 50 mbar) | - | |||
| 1 | Estéril seringa de vidro Luer Lock, preenchido com algodão | C681.1 | carlroth.com | ||
| 1 | agulhas de aço inoxidável Luer Lock (150 mm, 1,0 mm de diâmetro) | 201015 | labor-ochs.de | ||
| produtos quimicos | 4,8 L | MQ-água | - | ||
| por meio de solução de 5 L | 100g | NaCl | 433209 | sigmaaldrich.com | |
| 34 g | MgSO4 | 208094 | sigmaaldrich.com | ||
| 7,5 g | CaCl2 | C4901 | sigmaaldrich.com | ||
| 1,25 g | NH4Cl | A9434 | sigmaaldrich.com | ||
| 0,34 g | KH 2 PO 4 | P5655 | sigmaaldrich.com | ||
| 0,45 g | KBr | P3691 | sigmaaldrich.com | ||
| 3,3 g | KCl | P9541 | sigmaaldrich.com | ||
| 200 ml | Anóxica Na 2 HCO3 solução -buffer (22 mm) | - | |||
| 15 mg | Selénio e solução de tungstato (comp. Wu et ai., 2014) | - | |||
| 5 ml | Na 2 S 2 O 3 de solução (1 M) | - | |||
| 2,5 ml | Marinha fotoautotrófico (MP) solução de vitaminas (comp. Wu et ai., 2014) | - | |||
| 5 ml | MP oligoelemento solução (comp. Wu et ai., 2014) | - | |||
| Referência | |||||
| Wu, W., Swanner, ED, Hao, LK, Zeitvogel, F., Obst, M., Pan, YX, e Kappler, A. (2014). Caracterização da fisiologia e célula-minerais interações do fototrófico anoxigênicas marinho Fe (II) oxidante Rhodovulum iodosum - implicações para a pré-cambriano Fe (II) oxidação. FEMS Microbiology Ecology, 88 (3), 503-515. | |||||
Tabela 1. Média Preparação. Lista de equipamentos, suprimentos e produtos químicos para a preparação de meio de cultura.
| Qtde. | Ref. | Descrição do item | Informações detalhadas sobre o | ||||
| para | 1 | (UMA) | cilindro de vidro | Y310.1 | carlroth.com | * Costume modificado pela instalação de fabricação de vidro | |
| 2 g | (A.1) | Lã de vidro | 7377,2 | carlroth.com | |||
| 1,03 L | (A.2) | contas de vidro (ø 0,55-0,7 mm) | 11079105 | biospec.com | |||
| 6 | (A. 3) | rolha de borracha butílica (ø 1,2 cm) | 271024 | labor-ochs.de | |||
| 1 | (A. 4) | Disco de Petri, de vidro (Ø 8,0 cm) | T939.1 | carlroth.com | |||
| 40 ml | (A. 5) | polímeros cola | OTTOSEAL S68 | adchem.de | |||
| 11 | (A.6) | folha de sensor de oxigênio óptico (para análise de oxigênio, veja abaixo) | - A pedido - | presens.de | |||
| para | 4 | (B) | médio Glândulas | ||||
| 4 | (B.1) | tubos de borracha (de 35 mm, 7 mm de diâmetro) | 770350 | labor-ochs.de | |||
| 4 | (B.2) | conector do tubo Luer Lock (3,0 mm, Luer bloqueio do sexo masculino = LLM) | P343.1 | carlroth.com | |||
| 4 | (B.3) | conector do tubo Luer Lock (3,0 mm, Luer Lock fêmea = LLF) | P335.1 | carlroth.com | |||
| 4 | (B.4) | um tubo de borracha (25 mm, 0,72 mm de DI) | 2600185 | newageindustries .com | |||
| para | 1 | (C) | Painel Headspace Troca de Gás | ||||
| 1 | (C.1) | um tubo de borracha (50 mM, a 7 mm de diâmetro) | 770350 | labor-ochs.de | |||
| 2 | (C.2) | agulha de aço inoxidável Luer Lock (150 mm, 1,0 mm de diâmetro) | 201015 | labor-ochs.de | |||
| 2 | (C.3) | Luer Lock seringa de vidro (10 ml) | C680.1 | carlroth.com | |||
| 2 g | (C.4) | algodão solto | - | ||||
| 2 | (C.5) | rolha de borracha butílica (ø 1,75 cm) | 271050 | labor-ochs.de | |||
| 1 | (C.6) | agulha de aço inoxidável (40 mm, 1,0 mm de diâmetro) | Sterican | 4665120 | bbraun.de | ||
| 1 | (C.7) | agulha de aço inoxidável com encaixe Luer (150 milímetros, 1,5 mm Dl) | 201520 | labor-ochs.de | |||
| (LLF) | Posição: Connecto fêmea Luer Lockr parte em C.7 | ||||||
| 10 ml | (C.8) | polímeros cola | OTTOSEAL S68 | adchem.de | |||
| para | 1 | (D) | porta de amostragem | ||||
| 1 | (D.1) | agulha de aço inoxidável (120 mm, 0,7 mm de diâmetro) | Sterican | 4665643 | bbraun.de | ||
| 1 | (D.2) | um tubo de borracha (40 milímetros, 0,74 mm de DI) | 2600185 | newageindustries .com | |||
| 2 | (D.3) | psiquiatra tubulação de calor (35 mm, 3 mm de diâmetro reduzido) | 541458-62 | conrad.de | |||
| 1 | (D.4) | fixação de tubo | STHC-C-500-4 | tekproducts.com | |||
| 1 | (D.5) | conector do tubo Luer Lock (1,0 mm LLF) | P334.1 | carlroth.com | |||
| 1 | (D.6) | tampa de plástico Luer Lock (LLM) | CT69.1 | carlroth.com | |||
| para | 1 | (E) | garrafa médio | ||||
| 1 | (E.1) | Garrafa de vidro (5 L) | Rotilabo | Y682.1 | carlroth.com | ||
| 1 | (E.2) | rolha de borracha butílica (por GL45) | 444704 | labor-ochs.de | |||
| 1 | (E.3) | capilar de aço inoxidável (de 300 mm, 0,74 mm de diâmetro) | 56736 | sigmaaldrich.com | |||
| 1 | (E.4) | capilar de aço inoxidável (50 mm, 0,74 mm de diâmetro) | 56737 | sigmaaldrich.com | |||
| 4 | (E.5) | Tubos (35 mm, 3 mm de diâmetro reduzido) | 541458-62 | conrad.de | |||
| 2 | (E.6) | um tubo de borracha (100 mM, 0,74 mm de DI) | 2600185 | newageindustries .com | |||
| 1 | (E.7) | conector do tubo Luer Lock (1,0 mm LLF) | P334.1 | carlroth.com | |||
| 1 | (E.8) | Luer Lock seringa de vidro (10 ml) | C680.1 | carlroth.com | |||
| 1 g | (E.9) | algodão solto | - | ||||
| 1 | (E.10) | rolha de borracha butílica (ø 1,75 cm) | 271050 | labor-ochs.de | |||
| 1 | (E.11) | agulha de aço inoxidável (40 mm, 0,8 mm de diâmetro) | Sterican | 4657519 | bbraun.de | ||
| para | 1 | (F) | Painel de distribuição médio | ||||
| 1 | (F.1) | Luer Lock seringa de vidro (5 ml) | <td>C679.1 | carlroth.com | |||
| 1 | (F.2) | rolha de borracha butílica (ø 1,75 mm) | 271050 | labor-ochs.de | |||
| 2 | (F.3) | agulha de aço inoxidável (40 mm, 0,8 mm de diâmetro) | Sterican | 4657519 | bbraun.de | ||
| 2 | (F.4) | um tubo de borracha (40 milímetros, 0,74 mm de DI) | 2600185 | newageindustries .com | |||
| para | 2 | (L) | garrafas de descarga | ||||
| 2 | (G.1) | Frasco de vidro (2 L) | Rotilabo | X716.1 | carlroth.com | ||
| 2 | (G.2) rolha de borracha butílica (por GL45) | 444704 | labor-ochs.de | ||||
| 4 | (G.3) | capilar de aço inoxidável (50 mm, 0,74 mm de diâmetro) | 56736 | sigmaaldrich.com | |||
| 2 | (G.4) | um tubo de borracha (30 mm x 0,74 milímetros ID) | 2600185 | newageindustries .com | |||
| 2 | (G.5) | um tubo de borracha (100 mm x 0,74 milímetros ID) | 2600185 | newageindustries .com | |||
| 2 | (G.6) | conector do tubo Luer Lock (1,0 mm LLF) | P334.1 | carlroth.com | |||
| 1 | (G.7) | Luer Lock conector de 3 vias (LLF, 2x LLM) | <td>6134 | cadenceinc.com | |||
| equipamento adicional | |||||||
| 1 | (EU) | Fonte de luz | Samsung | SI-P8V151DB1US | samsung.com | ||
| 1 | (P) | bomba peristáltica | ISMATEC | EW-78017-35 | coleparmer.com | ||
| 4 | (Pt) | tubulação de bombeamento (0,89 mm de diâmetro) | EW-97628-26 | coleparmer.com | |||
| 4 | (S1 / 2) | capilar de aço inoxidável (200 mm, 0,74 mm de diâmetro) | 56736 | sigmaaldrich.com | |||
| 4 | (W3 / 4) | Staicapilar de aço NLES (400 mm, 0,74 mm de diâmetro) | 56737 | sigmaaldrich.com | |||
| 2 | (Gp) | Supel inerte Foil (Tedlar - PFC) bloco de gás (10 L) | 30240-L | sigmaaldrich.com | |||
| com | 2 | (Gp.1) | tubo de borracha (30 mm, 6 mm Dl) | 770300 | labor-ochs.de | ||
| 1 | (Gp.2) | conector do tubo Luer Lock (3,0 mm, LLM) | P343.1 | carlroth.com | |||
| 1 | (Gp.3) | conector do tubo Luer Lock (3,0 mm, LLF) | P335.1 | carlroth.com | |||
| Suprimentos | 2 | - | N2 / CO 2 - linha de gás (90/10, v / v; 50mbar) | - | |||
| 2 | - | seringa à prova de gás (20 ml) | C681.1 | carlroth.com | |||
| 1 | - | bico de Bunsen | - | ||||
| 1 | - | medidor de oxigênio de fibra óptica para a quantificação de oxigénio | PreSens | TR-FB-10-01 | presens.de | ||
| 1 | - | Bomba de vácuo | - | ||||
| 1 | - | cola de silicone para optodes oxigênio | PreSens | PS1 | presens.de | ||
| -: Os itens marcados com um traço (-) estão geralmente disponíveis e não comoartigo ESPECÍFICAS | |||||||
Tabela 2. Coluna set-up. Quantidades, os números de referência alfanuméricos e descrições de itens de equipamentos para experimental set-up.
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Discussion
comunidades microbianas no oceano Pré-Cambriano eram regulados pelo, ou modificados como resultado de, a sua actividade e as prevalecentes condições geoquímicas. Ao interpretar as origens da BIF, investigadores geralmente inferir a presença ou a actividade de micro-organismos com base na sedimentology ou Geochemistry de BIF, por exemplo, Smith et ai. 23 e Johnson et ai. 24. O estudo de organismos modernos em ambientes modernos que têm análogos geoquímicos para ambientes antigos também é uma abordagem valiosa, por exemplo, Crowe et al. 11 e Koeksoy et al. 14. Uma terceira abordagem é utilizar organismos em sistemas de laboratório de engenharia que simulam processos que ocorrem no oceano pré-cambriano, por exemplo, Krepski et al. 25. Este tipo de abordagem é útil para testar hipóteses específicas, e remover factores biológicos que podem estar presentes em sistemas modernos química ou, mas não eramparte do oceano pré-cambriano (por exemplo, plantas aquáticas e animais). Por isso, apresentamos um método de prova de conceito para um sistema de ressurgência dinâmica, laboratório, em que a actividade de (ciano) bactérias e sua influência sobre resultando perfis geoquímicos podem ser avaliados sob condições controladas de laboratório. A nossa coluna pode ser usado para testar hipóteses sobre os organismos e processos que contribuem para a deposição de BIF, e os biosignatures retidos em BIF.
Nós otimizamos o protocolo para a configuração de coluna de modo que a montagem é compreensível e facilmente conductible. No entanto, algumas etapas do protocolo devem ser abordados com cuidado e idealmente realizada com a ajuda de uma pessoa auxiliar. Em particular, a ligação das garrafas médias para o cilindro de coluna tem de ser realizada rapidamente, a fim de evitar a contaminação da solução de meio com oxigénio. A utilização de equipamento não esterilizado ou trabalhando em condições de laboratório não estéreis resultará iN, a contaminação do experimento e os resultados não confiáveis. Por isso, é uma necessidade absoluta para esterilizar o equipamento e manter condições estéreis (trabalhando em uma capela de fluxo laminar ou 40 cm ao lado de um bico de Bunsen), enquanto a criação do experimento e coleta de amostras. Além disso, alguns parâmetros físico-químicos da coluna de material de causou alterações químicas durante o longo tempo de set-up no experimento de coluna. Peças que são feitas de tubo de borracha parecem ter um coeficiente de difusão para o oxigénio que é suficientemente elevada para afectar significativamente o frasco reservatório de meio e conduzir à oxidação do Fe (II) e precipitação mineral na solução no meio. O consumo abiótica de> 10% Fe (II) devido à precipitação durante o experimento abióticos mais de 10 dias (compare: Resultados representante) deve ser tomado em conta para futuros experimentos de longa duração. A fonte de luz que foi utilizado no presente estudo criado um gradiente de luz subsidência dentro dos 6 cm de profundidadeda coluna. Os espectros de luz cobriu os comprimentos de onda ativos fotossintéticos de clorofila a e b em Synechococcus e permitiu o crescimento e atividade fotossintética. Na verdade, a fonte de luz é um dos parâmetros mais importantes relativas a organismos fototróficas uma vez que ambos, a qualidade da luz e quantidade pode influenciar fortemente as bactérias fototróficas 11,13. Variações de comprimentos de onda e faixas espectrais, considerando também a radiação UV mais elevado durante o pré-cambriano, podem permitir ainda mais insights sobre reações luz biogeoquímicos dependentes. Durante as experiências de incubação de luz, verificámos que a luz foi conduzida através da parede de vidro da coluna, que emite luz através das portas de amostragem e na parte inferior da coluna. Para as experiências futuras, o vidro na parte superior da coluna deve ser substituído pelo material de vidro não-condutor de luz. O gradiente de luz deve ser medida em um mock set-up, como não havia nenhuma maneira fácil e barata de medir o gradiente de luz dentro dasistema fechado coluna disponível. Nós assumimos uma alteração significativa ao longo do tempo na profundidade máxima de penetração de luz, devido à absorção de luz pelas células e minerais. Medir o gradiente de luz in situ durante o experimento será de interesse para experiências futuras. O uso de grânulos de dispersão da luz na matriz de pérolas de vidro e a quantificação da luz dispersa a partir do exterior pode ser uma possibilidade de quantificar a disponibilidade relativa de luz em determinadas profundidades ao longo do tempo. Um outro aperfeiçoamento que incluem uma tampa que não precisa de ser colado, mas poderia ser facilmente acoplado e removido com uma flange e que rodeia braçadeira. Um orifício de fornecimento de meios de descarga e de 4 pontos que resultaria em um campo de escoamento mais homogéneo no interior da coluna. Mais estreito posicionamento dos principais portos de amostragem para amostras líquidas resultaria numa maior resolução de amostragem dos gradientes biológicos e geoquímico dentro da coluna.
No entanto, os primeiros resultados demonstramd que a coluna de fluxo vertical pode ser considerado como uma montagem experimental adequado para investigar processos microbianos e alterações geoquímico num sistema de afloramento. Nós afirmamos que esta coluna serve como um protótipo para comprovar a funcionalidade total do sistema. Suposições Além disso, nossos resultados validam amplamente realizadas, os resultados da modelagem, e inferências a partir de geoquímica sedimentar que um chemocline entre os resultados Fe (II) de oxigênio e se cianobactérias estão presentes em um Fe (II) rico em sistema de 20 ressurgência. As condições anóxicas antes da inoculação refletem um oceano pré-cambriano antes da colonização por cianobactérias ou organismos capazes de fotossíntese aeróbica. Com o aumento do oxigénio nas águas de superfície, ressurgência Fe (II) torna-se oxidado e se precipita como Fe (III) minerais, como ocorreu durante a deposição de BIF 26 .O estabelecimento de um chemocline ea formação mineral pode ser avaliada para extrapolar geoquímica processos em ambiente de maior escalas. No entanto, para upscaling os resultados avaliados para ambientes naturais (antigo), os processos físicos adicionais precisam ser considerados. Advective transporte lateral, por exemplo, pode perturbar o estabelecimento de um chemocline, mesmo que as turbulências induzidas pelo vento nas águas de superfície.
A extracção de amostras de líquidos a partir da coluna de água para o Fe (II), as medições totais de Fe, e o não-invasiva O2 quantificação foram capazes de controlar a evolução de uma frente de reacção entre estas espécies químicas de uma forma simples, rápida e fiável . A baixa concentração de Fe (III) em amostras tomadas a partir da coluna criada em experiências de controlo abióticos indicam claramente que, embora alguma oxidação ocorreu no frasco de meios de comunicação, a própria coluna foi fechada hermeticamente em O externo 2 afluxo. Além disso, estes resultados indicam que o protocolo de amostragem mantida amostras anóxicas para a quantificação de Fe (II). Mudanças no pH não foram registrados durante os experimen colunaT e pode ter um efeito dominante em Fe-especiação. No entanto, o sistema de fluxo de corrente foi tamponado por 22 mM de NaHCO 3, que está em equilíbrio com o anóxica N2 / CO2 atmosfera no espaço superior e permite manter um pH circum-neutro durante pelo menos 84 horas. No entanto, a quantificação in-situ do pH pode ser um parâmetro importante para entender completamente processos geoquímicos em potenciais experiências de longo prazo e a extrapolação para (antigo) sistemas de mar aberto. A matriz de esferas de vidro, utilizados para estabilizar as estabelecendo gradientes geoquímicos no cilindro coluna, levou a um acúmulo de Fe-precipitados na subsuperfície da coluna de água. Nossa hipótese é que os precipitados acumulados não tem um efeito dominante em nosso experimento 84 h. Entretanto, a biomassa degradante pode induzir processos redox em Fe-precipitados que resultam em Fe ciclismo. Isso precisa ser considerado com relação ao potencial (<84 hr) experimentos de longo prazo. De facto, luzinduzida ciclismo Fe-redox e uma liberação de Fe para a piscina ferro ferroso pode ser observado e quantificado em replicar a longo prazo (21 dias) experimentos (Wu, W., Maisch, M., Kappler, A., Pan, Y. , & Swanner, ED fotoquímica Fe (III) redução estabilizado Fe (II), em oásis de oxigênio Arqueano. Geologia. (em prep.)).
experimentos coluna futura vai incorporar ambos os vários microorganismos e variações na composição do meio de cultura. Isso permite a simulação de diferentes condições ambientais que são representativos de diferentes estágios durante a transformação do Oceano pré-cambriano. Por exemplo, a sílica pode ser adicionada ao meio para simular as concentrações de 0,67 a 2,2 mM que estavam presentes na água do mar Precambriano 27. Além disso, a concentração de sulfato na solução de forma poderia ser alterada para dirigir variações da composição da água do mar Precambriano. Variações do meio de cultura, provavelmente, influenciar a physiology e efeito de microrganismos sobre os padrões geoquímicos na coluna de água 19 que a configuração coluna atual nos permite investigar in situ. Além disso, experimentos antecipados vai envolver as comunidades microbianas mais complexos, tais como bactérias fototróficas Fe (II) -oxidizing (por exemplo, Kappler et ai.), 28 microaerofílica Fe (II) -oxidizing bactérias (por exemplo, Krepski et al.) 29 e cianobactérias. Os experimentos de coluna vai ajudar a desmembrar a contribuição individual destes processos microbianos à deposição das formações ferríferas. No entanto, para a interpretação e extrapolação para ambientes antigos (e modernas) precisa ser derivada com muito cuidado. O habitat microbiano que é simulada nos modelos atuais do estudo apenas as características básicas de um potencial de coluna de água pré-cambriano ressurgência oceano: fluxos verticais Fe (II), um gradiente de luz da zona fótica, atmosfera anóxica e cianobactérias. Em anúnciocondição, as condições no sistema de ressurgência artificial potencialmente favorecer o crescimento de cianobactérias, devido a temperaturas constantes e 24 condições de luz hr potencialmente levando a altas taxas de produção de O 2, enquanto que a elevada concentrações de O 2 posteriormente leva a maiores Fe taxas de oxidação (II) . Portanto, o presente estudo não pode ser interpretada como um experimento único para todas as hipóteses relativas à origem BIF.
No entanto, a configuração permite a investigação in situ de vários processos geoquímico e a variação e de simulação de certas condições de contorno (disponibilidade de luz, a composição do meio, fluxos). A quantificação dos parâmetros individuais e interações geoquímicos sob condições controladas em laboratório podem dar insights sobre ambientes antigos e modernos. Além disso, o sistema de coluna nos permite testar hipóteses sobre como as condições geoquímicas regulada atividade microbiana. Por exemplo, tem sido a hipótesed que altas concentrações de Fe (II) em sistemas de ressurgência do pré-cambriano podem ter produção limitada fotossintética de oxigênio devido à toxicidade de Fe (II) em iluminadas pelo sol, ambientes oxigenados 20. investigações futuras, adicionalmente, incorporar fluxos químicos e taxas volumétricas que permitem cálculos estequiométricos qualitativos e quantitativos da cinética de reação na coluna de água artificial. observações individuais irá então ser ligada a um modelo para avaliar simulações ambientais individuais. Com a coluna criada, agora somos capazes de investigar a resposta ao estresse direta de bactérias (ciano) para fluxos de alta Fe (II) e da luz em um sistema de ressurgência in-situ que representa condições Terra primitiva marinhos 20. A coluna também pode ser usado para testar hipóteses sobre as assinaturas geoquímico produzidos pela actividade microbiana, por exemplo a evolução de composições de isótopos Fe ao longo de um sistema de ressurgência em que o Fe (II) está a ser oxidado (por exemplo, Czaja etai.) 30. Além disso, as esferas de vidro que estabilizam os gradientes químicos no interior da coluna pode ser substituído com areia ou sedimentos. Por isso, é também possível aplicar esta coluna para simulações dos gradientes geoquímicos que podem se desenvolver em marinhos ou de água doce sedimentos habitados por microrganismos (por exemplo, Melton et al.) 31.
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Disclosures
Autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Mark Nordhoff ajudou na concepção e implementação de conexões de tubos. Ellen Struve ajudou a seleccionar e adquirir equipamentos utilizados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Widdel flask (5 L) | Ochs | 110015 | labor-ochs.de |
| Glass bottles (5 L) | Rotilabo | Y682.1 | carlroth.com |
| Glass pipettes (5 ml) | 51714 | labor-ochs.de | |
| 0.22 µm Steritop filter unit (0.22 µm Polyethersulfone membrane) | Millipore | X337.1 | carlroth.com |
| Aluminum foil | |||
| Sterile Luer Lock glass syringe, filled with cotton | C681.1 | carlroth.com | |
| Luer Lock stainless steel needles (150 mm, 1.0 mm ID) | 201015 | labor-ochs.de | |
| NaCl | Sigma | 433209 | sigmaaldrich.com |
| MgSO4 | Sigma | 208094 | sigmaaldrich.com |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | sigmaaldrich.com |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | sigmaaldrich.com |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | sigmaaldrich.com |
| KBr | Sigma | P3691 | sigmaaldrich.com |
| KCl | Sigma | P9541 | sigmaaldrich.com |
| Glass cylinder | Y310.1 | carlroth.com | |
| Glass wool | 7377.2 | carlroth.com | |
| Glass beads (ø 0.55 - 0.7 mm) | 11079105 | biospec.com | |
| Butyl rubber stopper (ø 1.2 cm) | 271024 | labor-ochs.de | |
| Petri Dish, glass (ø 8.0 cm) | T939.1 | carlroth.com | |
| Polymers glue | OTTOSEAL S68 | adchem.de | |
| Optical oxygen sensor foil (for oxygen analysis, see below) | – on request – | presens.de | |
| Rubber tubing (35 mm, 7 mm ID) | 770350 | labor-ochs.de | |
| Luer Lock tube connector (3.0 mm, Luer lock male = LLM) | P343.1 | carlroth.com | |
| Luer Lock tube connector (3.0 mm, Luer lock female = LLF) | P335.1 | carlroth.com | |
| Rubber tubing (25 mm, 0.72 mm ID) | 2600185 | newageindustries.com | |
| Rubber tubing (50 mm, 7 mm ID) | 770350 | labor-ochs.de | |
| Luer Lock stainless steel needle (150 mm, 1.0 mm ID) | 201015 | labor-ochs.de | |
| Luer Lock glass syringe (10 ml) | C680.1 | carlroth.com | |
| Loose cotton | – | ||
| Butyl rubber stopper (ø 1.75 cm) | 271050 | labor-ochs.de | |
| Stainless steel needle (40 mm, 1.0 mm ID) | Sterican | 4665120 | bbraun.de |
| Luer Lock stainless steel needle (150 mm, 1.5 mm ID) | 201520 | labor-ochs.de | |
| position: Luer Lock female connector part at C.7 | |||
| Polymers glue | OTTOSEAL S68 | adchem.de | |
| Stainless steel needle (120 mm, 0.7 mm ID) | Sterican | 4665643 | bbraun.de |
| Rubber tubing (40 mm, 0.74 mm ID) | 2600185 | newageindustries.com | |
| Heat shrink tubing (35 mm, 3 mm ID shrunk) | 541458 - 62 | conrad.de | |
| Tube clamp | STHC-C-500-4 | tekproducts.com | |
| Luer Lock tube connector (1.0 mm, LLF) | P334.1 | carlroth.com | |
| Luer Lock plastic cap (LLM) | CT69.1 | carlroth.com | |
| Glass bottle (5 L) | Rotilabo | Y682.1 | carlroth.com |
| Butyl rubber stopper (for GL45) | 444704 | labor-ochs.de | |
| Stainless steel capillary (300 mm, 0.74 mm ID) | 56736 | sigmaaldrich.com | |
| Stainless steel capillary (50 mm, 0.74 mm ID) | 56737 | sigmaaldrich.com | |
| Shrink tubing (35 mm, 3 mm ID shrunk) | 541458 - 62 | conrad.de | |
| Rubber tubing (100 mm, 0.74 mm ID) | 2600185 | newageindustries.com | |
| Luer Lock tube connector (1.0 mm, LLF) | P334.1 | carlroth.com | |
| Luer Lock glass syringe (10 ml) | C680.1 | carlroth.com | |
| Loose cotton | – | ||
| Butyl rubber stopper (ø 1.75 cm) | 271050 | labor-ochs.de | |
| Stainless Steel needle (40 mm, 0.8 mm ID) | Sterican | 4657519 | bbraun.de |
| Luer lock glass syringe (5 ml) | C679.1 | carlroth.com | |
| Butyl rubber stopper (ø 1.75 mm) | 271050 | labor-ochs.de | |
| Rubber tubing (40 mm, 0.74 mm ID) | 2600185 | newageindustries.com | |
| Glass bottle (2 L) | Rotilabo | X716.1 | carlroth.com |
| Butyl rubber stopper (for GL45) | 444704 | labor-ochs.de | |
| Stainless steel capillary (50 mm, 0.74 mm ID) | 56736 | sigmaaldrich.com | |
| Rubber tubing (30 mm x 0.74 mm ID) | 2600185 | newageindustries.com | |
| Rubber tubing (100 mm x 0.74 mm ID) | 2600185 | newageindustries.com | |
| Luer Lock tube connector (1.0 mm, LLF) | P334.1 | carlroth.com | |
| Luer Lock 3-way connector (LLF, 2x LLM) | 6134 | cadenceinc.com | |
| Light source | Samsung | SI-P8V151DB1US | samsung.com |
| Peristalic pump | Ismatec | EW-78017-35 | coleparmer.com |
| Pumping tubing (0.89 mm ID) | EW-97628-26 | coleparmer.com | |
| Stainless steel capillary (200 mm, 0.74 mm ID) | 56736 | sigmaaldrich.com | |
| Stainless steel capillary (400 mm, 0.74 mm ID) | 56737 | sigmaaldrich.com | |
| Supel-Inert Foil (Tedlar - PFC) gas pack (10 L) | 30240-U | sigmaaldrich.com | |
| Rubber tube (30 mm, 6 mm ID) | 770300 | labor-ochs.de | |
| Luer Lock tube connector (3.0 mm, LLM) | P343.1 | carlroth.com | |
| Luer Lock tube connector (3.0 mm, LLF) | P335.1 | carlroth.com | |
| Gas-tight syringe (20 ml) | C681.1 | carlroth.com | |
| Bunsen burner | – | ||
| Fiber optic oxygen meter for oxygen quantification | Presens | TR-FB-10-01 | presens.de |
| Vacuum pump | – | ||
| Silicone glue for oxygen optodes | Presens | PS1 | presens.de |
References
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