Summary
Vi simulert en prekambrium ferruginous marine oppstrømning system i en lab-skala vertikal gjennomstrømning kolonnen. Målet var å forstå hvordan geokjemiske profiler av O 2 og Fe (II) utvikle seg som cyanobakterier produserer O 2. Resultatene viser etablering av en kjemoklin på grunn av Fe (II) oksidering av photosynthetically produsert O 2.
Abstract
En konvensjonell konsept for deponering av noen prekambriske bøyle Iron Formasjoner (BIF) fortsetter på antagelsen om at toverdig jern [Fe (II)] oppstrømning fra hydrotermale kilder i prekambrium havet ble oksidert av molekylært oksygen [O 2] produsert av cyanobakterier. De eldste BIFs, deponert før den store Oksidasjon hendelse (GOE) på om lag 2,4 milliarder år (Gy) siden, kunne ha dannet ved direkte oksidasjon av Fe (II) ved anoxygenic photoferrotrophs henhold anoksiske forhold. Som en metode for testing av geokjemiske og mineralogiske mønstre som utvikler under forskjellige biologiske scenarier, har vi designet en 40 cm lang vertikal gjennomstrømning kolonne for å simulere en anoksisk Fe (II) rik marin oppstrømning system representant for en gammel havet på en lab skala . Sylinderen ble fylt med en porøs glassperle matrise for å stabilisere de geokjemiske gradienter, og væskeprøver for jern kvantifisering kan bli tatt gjennom vannsøylen. Oppløst oksygen varoppdaget ikke-invasiv via optodes fra utsiden. Resultater fra biotiske eksperimenter som involverte upwelling fluks av Fe (II) fra bunnen, en tydelig lys gradient fra toppen, og cyanobakterier til stede i vannsøylen, viser klart bevis for dannelse av Fe (III) mineralske utfellinger og utvikling av en kjemoklin mellom Fe (II) og O 2. Denne kolonnen tillater oss å teste hypoteser for dannelsen av de BIFs ved dyrking cyanobakterier (og i fremtiden photoferrotrophs) under simulerte marine prekambriske forhold. Videre hypoteser vi at vår kolonne konseptet tillater for simulering av ulike kjemiske og fysiske omgivelser - herunder grunne marine eller innsjøsedimenter.
Introduction
Prekambrium (4,6 til 0,541 Gy siden) atmosfære opplevd en gradvis oppbygging av photosynthetically produsert oksygen (O 2), kanskje avbrutt av vise endringer i den såkalte "Great Oksidasjon hendelse" (GOE) på ca 2,4 Gy siden, og igjen i Neoproterozoic (1 til 0,541 Gy siden) som atmosfærisk O 2 nærmet moderne nivå 1. Cyanobakterier er de evolusjonære rester av de første organismer som kan oxygenic fotosyntese to. Geokjemiske bevis og modellering studier støtter rollen til grunne kystmiljøer i husing aktive samfunn av cyanobakterier eller organismer som kan oxygenic fotosyntese eller oxygenic fotoautotrofi, genererer lokale oksygen oaser i overflaten havet under en overveiende anoksisk atmosfære 3-5.
Avsetningen av bøyle Iron Formasjoner (BIFs) fra sjøvann gjennom prekambriske poeng til jern (II) (Fe (II)) som en viktig geokjemiske constituent av sjøvann, i det minste lokalt, i løpet av deres behandling. Noen av de største BIFs er dypvanns innskudd, forming av kontinentalsokkelen og skråningen. Mengden av Fe deponert er uforenlige fra et massebalanse standpunkt med overveiende kontinental (dvs. forvitring) kilde. Derfor er mye av Fe må ha blitt levert fra hydrotermale endring av mafisk eller ultramafiske havbunnen skorpe 6. Estimater av frekvensen av Fe avsatt påhengs av kystmiljøet er i samsvar med Fe (II) som leveres til overflaten havet via oppstrømning 7. For at Fe som skal transporteres i upwelling strømmer, må ha vært tilstede i den reduserte, mobil formen - som Fe (II). Den gjennomsnittlige oksydasjonstilstanden av Fe bevart i BIF er 2,4 til 8, og det er generelt antatt at BIF bevare Fe avsatt som Fe (III), som dannes ved oppstrømning Fe (II) ble oksydert, eventuelt med oksygen. Derfor utforske potensielle Fe (II) oksidasjonsmekanismer langs skråningen environments er viktig å forstå hvordan BIF dannet. Videre har videreutviklet geokjemisk karakterisering av marine sedimenter identifisert som ferruginous forhold, der Fe (II) var til stede i en anoksisk vannsøyle, var en vedvarende funksjon av havene gjennom prekambrium, og kanskje ikke har vært begrenset til bare tid og sted hvor BIF ble avsatt 9. Derfor, i minst to milliarder år av jordens historie, redoks grensesnitt mellom Fe (II) og O 2 i de grunne havene var sannsynligvis vanlig.
Tallrike studier utnytte moderne nettsteder som er kjemiske og / eller biologiske analoger av ulike funksjoner i prekambrium havet. Et godt eksempel er jernholdig innsjøer hvor Fe (II) er stabil og til stede i solbelyste overflatevann mens fotosynteseaktiviteten (inkludert av cyanobakterier) ble påvist 10-13. Resultatene fra disse studiene gir innsikt i geokjemiske og mikrobielle egenskaper ved en oksisk til anoksisk / ferruginous kjemoklin. Men disse områdene er generelt fysisk stratifisert med liten vertikal miksing 14, i stedet for de kjemiske grensesnitt som forekommer i en oppstrømning system, og er tenkt å støtte de mest oksygen produksjon i prekambrium tid 4.
En naturlig analog å utforske utviklingen av et marint oksygen oase under en oksygenfri atmosfære, og på en Fe (II) rik oppstrømning system i solbelyste overflatevann kolonnen er ikke tilgjengelig på moderne Jorden. Derfor er et laboratorium system som kan simulere en ferruginous oppstrømning sone og også støtte veksten av cyanobakterier og photoferrotrophs nødvendig. Forståelsen og identifisering av mikrobielle prosesser og deres samspill med en oppstrømning vandig medium som representerer prekambrium sjøvann fremmer forståelse og kan utfylle informasjonen han fikk fra rock posten for å fullt ut forstå den særegne biogeokjemiske prosesser på gamle jorden. Mot dette formål, ble en laboratorie-skala-kolonne konstruert i hvilken Fe (II) -rik sjøvann medium (pH nøytral) ble pumpet inn i bunnen av kolonnen og pumpes ut fra toppen. Belysning ble gitt øverst for å skape en 4 cm bred "eufotisk" som støttet vekst av cyanobakterier i topp 3 cm. Naturmiljøer er generelt stratifisert og stabilisert av fysio gradienter, som salinitet eller temperatur. For å stabilisere vannsøylen på en lab-skala, ble kolonnen sylinder pakket med et porøst glassperle matrise som hjalp til å opprettholde etablering av geokjemiske mønstre som er utviklet i løpet av eksperimentet. En kontinuerlig N2 / CO2-gass-strømmen ble anvendt for å skylle det øvre område av kolonnen for å opprettholde en oksygenfri atmosfære reflektert av et hav før den GOE 15. Etter å ha en konstant strøm av Fe (II) ble etablert, ble inokulert cyanobakterier i hele kolonnen, og deres growth ble overvåket av celletall på prøver fjernet gjennom prøvetakingsportene. Oksygen ble overvåket in situ ved å plassere oksygenfølsomme optode folier på den indre vegg av kolonnen sylinder og målinger den ble gjort med en optisk fiber fra utsiden av kolonnen. Vandig Fe arts ble kvantifisert ved å fjerne prøver fra dybde-løst horisontale prøvetakingsporter og analysert med Ferrozine metoden. De abiotiske kontroll eksperimenter og resultater viser proof-of-concept - som en laboratorieskala analog av den gamle vannsøylen, holdt isolert fra atmosfæren, er oppnåelig. Cyanobakterier vokste og produsert oksygen, og reaksjonene mellom Fe (II) og oksygen ble løses. Heri er metodikken for design, forberedelser, montering, gjennomføring, og prøvetaking av en slik kolonne presentert, sammen med resultatene fra en 84-timers løp i kolonnen mens inokulert med den marine cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av Dyrking Medium
Merk: Informasjon om de nødvendige utstyr, kjemikalier og forsyninger for utarbeidelse av kulturmediet er oppført i tabell 1 Kursiv alfanumeriske koder i parentes refererer til utstyr spesifisert i tabell 2 og vist i figur 1..
- Forbered 5 liter Marine fotoautotrofi (MP) medium (heretter kalt "medium") etter protokollen av Wu et al. 16. Juster pH til 6,8 ved hjelp av anoksisk og steril 1 M HCl eller 0,5 M Naco 3. Som en kilde for Fe (II), tilsett 3,5 ml av en 1 M anoksiske og sterile FeCl ^ 2-oppløsning for å oppnå en avsluttende Fe (II) konsentrasjon på 500 uM etter filtrering av mediet oppløsning i neste trinn.
- Oppbevar medium oppløsningen ved 5 ° C i 48 timer for å utfelle Fe (II) karbonat og fosfatmineraler. Fe (II) addisjon og Fe mineralsk utfelling resulterer i en pH- endring, derfor justere pH tilbake til 6,8. Filtrer det medium i en anoksisk (100% N2) hanskerommet gjennom et 0,22 um filter enhet. Tilsett den filtrerte medium i en steril 5 L glassflaske (E.'1) inne i et hanskerom, og lokket med en steril gummipropp.
- Spyl det øvre område av mediet flasken med N2 / CO 2 (v / v, 90/10) ved å sette inn en engangsnål som er koblet til gassledningen inn i stopperen, og en andre nål som fungerer som en ventil. Sørg for å endre headspace volum 10 ganger. For eksempel, med en konstant gass-strøm på 10 ml / sek, spyle rommet oventil volum på 50 ml i minst 50 sek (sammenlign Hungate og Macy 17).
- Dekk til medium flasken (e) som er nå klar til bruk med aluminiumsfolie og oppbevar ved romtemperatur under mørke forhold for å hindre fotooksidasjon av Fe (II). Tillat 3 dager medium forberedelse.
2. Utarbeidelse av kultur
"> Merk:.. Kulturen i Synechococcus sp PCC 7002 som brukes i kolonne forsøket er beskrevet som encellede marine photoheterotrophic cyanobakterier slekten 18 Det ble gitt av Dr. M. Eisenhut (Institute for Plant biokjemi, Universitetet i Düsseldorf, Tyskland) . For denne studien stamkulturen ble dyrket på anoksisk MP medium uten ekstra Fe (II).- Fremstille 100 ml MP medium følge protokollen av Wu et al., 16 men erstatning ferriklorid med 1 ml / l jern-III-ammoniumcitrat på 6 mg / ml.
- Under anoksiske forhold (hanskerom, 100% N 2), dispensere mediet inn i en 120 ml sterilt serum flaske, cap med en steril butylgummipropp og krympe med en aluminiumshette. Endre headspace til N 2 / CO 2 (v / v, 90/10) (sammenlign Hungate og Macy 17) og vaksinere med 5% av bestanden kultur. Deretter oppbevare kulturen i et lys-inkubator ved 25 ° C og 600 lux fra en Tungsten lyspære.
- Siden Synechococcus sp. PCC 7002 er lysfølsomme, etter overføring, dekke serum flaske med et tynt papir håndkle for første 24-timers i lys kuvøse. Tillate kulturen å vokse i 6-8 dager. Fotosyntetisk aktivitet vil resultere i oksydasjon av Fe (II) og Fe (II) vil ikke være statisk for den tidsskala av cellulær vekst, og derfor overføre kulturen etter 7 dager for å opprettholde Fe (II) i mediet, og cellene innrettet til Fe (II).
- Overvåke celletetthet ved å ta prøver for optisk tetthet (OD) målinger: Celletetthet (celler / ml) av kultur kan bli bestemt ved absorbansen av cellesuspensjonen prøven i en foto-spektrometer ved en bølgelengde på 750 nm 19. En lineær sammenheng mellom OD 750 og direkte mikroskopiske legemer på en kultur i log fase vil bestemme den absolutte celletetthet 20.
- Så snart en celletetthet på 10 8 celler / ml er nådd,vikle serumflaske med aluminiumsfolie for å stoppe oksygenproduksjon av fotosyntesen.
- Fjern O 2 i cellesuspensjonen ved hjelp av et 0,22 pm sterilt sprøytefilter festet til en lang (100 mm) engangsnål innført i det flytende medium. Skyll headspace og boble kulturen med N 2 / CO 2 i 5 min (sammenlign Hungate og Macy 17). Holde prøven i mørke før inokulering inn i kolonnen.
3. Utarbeidelse av elementer og enkelte delene for Eksperimentell Set-up
Merk: Informasjon om ønsket utstyr for den eksperimentelle oppsett, er mengder og spesifikasjoner oppført i Tabell 2. Deler av de elementene som vil bli brukt for det eksperimentelle oppsettet er forberedt på forhånd og er individuelt merket med en enkelt bokstav (AG), oppført i tabell 2 og vist som nærbilder i figur 1 også. kursiv alfanumeriske koder i parentes i protokollen viser til utstyr spesifisert i tabell 2, og er vist i figur 1.
- For å forberede prøvepunkter (D) for kolonnen, lukke porter med tettsittende butylgummipropp (A.3). Sette inn en nål av rustfritt stål (d ') inn i gummipropp. Pass på at spissen av kanylen befinner seg i sentrum av kolonnen.
- Koble nålen til en gummislange (D.2) og forsegle forbindelse med en varme-krympe rør (D.3). Feste den andre ende av røret til et lite Luer-lås rørkobling ( 'D.5), forsegle forbindelse med en varme-krympe rør (D.3) og dekker rørkobling med et passende plastlokk (D.6) .
Merk: Avhengig av ønsket antall prøvetakingsporter er det nødvendig å gi en hovedport med ulike prøvetakingsporter - therefore sette inn rustfritt stål nåler (D.1) i en skrå vinkel inn i gummipropp.
- Koble nålen til en gummislange (D.2) og forsegle forbindelse med en varme-krympe rør (D.3). Feste den andre ende av røret til et lite Luer-lås rørkobling ( 'D.5), forsegle forbindelse med en varme-krympe rør (D.3) og dekker rørkobling med et passende plastlokk (D.6) .
- For å koble mellom og utløps flasker til kolonnen, endre butylgummipropp følgende de neste trinnene:
- Sett to rustfrie stålkapillærer (E.3; E.4) inn i butylgummistopp (E.2). Koble de riktige gummi slanger (E.6) til disse kapillærer og forsegle forbindelse med varme krympe rør (E.5).
- Legg til en rørkobling (E.7) til den andre enden av røret av lengre kapillar (E.3) og også feste dette kontakten med en varme-krympe rør (E.5).
- Koble en nål av rustfritt stål (E.11) til den frie enden av røret festet til kortere kapillær (E.4), forsegle forbindelser med krympe rør (E.5), og sett den andre enden av rustfritt stål nål inn i en mindre butylgummistopp (E.10). Sett to rustfrie stålkapillærer (G.3) inn i en stor butylgummistopp (G.2) og fest den aktuelle gummi slanger (G.4, G.5). Koble den frie ende av den kortere gummirøret (G.4) til et medium utladning flaske kapillar (w2). Utstyre den frie enden av det lange røret (G.5) med en liten tube kontakt (G.6). Gjenta disse trinnene for å forberede en ny butylgummipropp for en andre utslipp flaske.
- Forbered proppen for mediet fordelingspanel (F) ved å sette inn to rustfrie stålnåler (F.3) i en gummipropp (F.2) for å produsere to medietilførselslinjer for kolonnen. Fest et gummirør (F.4) til hver av nålene og koble den ene medium flaske kapillar (c1) til en av gummirørene, henholdsvis.
- For å fremstille kjertlene på mellomtilførselsledningen (B), koble en mediumforsyning kapillær (c2) til en liten tube kontakt (B.3) med en gummislange (B.4). Gjenta dette trinnet for et annet medium forsyning kjertel.
- Bruk lengre medium utslippet kapillær (w1) i stedet for å forberede kjertler for mediet utløpsledningen og følge de forrige trinnene (sammenlign (B) i figur 1).
Merk: Det er nyttig å merke innløp og utløp med forskjellige farger av tape for å bistå i riktig montering.
- Bruk lengre medium utslippet kapillær (w1) i stedet for å forberede kjertler for mediet utløpsledningen og følge de forrige trinnene (sammenlign (B) i figur 1).
- Monter delene for headspace gassutveksling panel (C) ved å sette to lange Luer lock stål nåler (C.2) rustfritt inn en gummislange (C.1) og sørg for at tuppen av nålene nå 4 cm utenfor den andre enden av slangen. Fyll røret med Polymers lim (C.8) og la enheten tørke i minst 6 timer.
- Løst fylle to Luer lock sprøyter av glass (C.3) med bomull (C.4).
- Separat forberede to butyl gniBER stoppere (C.5), ett med en rustfritt stål nål inn (C.6) og den andre med en nål av rustfritt stål (C.7). Ikke koble til glass sprøyter, ennå.
- Forbered en glassprøyte (E.8) fylt med bomull (E.9) for senere bruk i tråd med medium flaske og gass pakke (gp).
- Montere utstyr for en 10 l gass pakke (gp) ved å kople et gummirør (gp.1) på ventilen på gass pakningen. Sett inn en tube-kontakt (gp.2) i den frie enden av gummislange. Gjenta denne prosedyren for en andre 10 L gass pack.
4. Sterilisering av Column og utstyr
Merk: Avhengig av materialegenskaper, er utstyret steriliseres ved en av følgende tre metoder:
- Sterilisere utstyr laget av glass med tørr ovn (180 ° C i 4,25 time):
- Sterilisere utstyr for å lage medium (se
- Sterilisere utstyr for kolonnen satt opp i et andre trinn. Pakk glass sprøyter (C.3, E.8, F.1 - utarbeidet i seksjon 3) med aluminiumsfolie og sørge for at de tilsvarende butylgummipropp fjernes.
- Plasser glassperler (A.2) i et glassbeger og dekke toppen med aluminiumsfolie. Også dekke gjennomsiktig glass plate (A.4), 4 x store tube kontakter (B.2) og 3-veis kontakt (G.7) med aluminiumsfolie og ovn-sterilisere alt.
- Sterilisere utstyr for å lage medium (se
- Steriliser autoklaver plast og væsker ved autoklav (120 ° C, 10 bar, 20 min):
- I det første trinnet, sterilize den Widdel kolbe med mediet, den NaHCO3-buffer løsning og to butylgummipropp for 5 L glassflaske.
Merk: Butyl gummipropper er først utarbeidet av kokende i ultrarent vann 3 ganger og deretter autoklaveres i et begerglass med litt vann, dekket med aluminiumsfolie med. De våte propper er lettere å sette inn i glassflasker. - I et andre trinn sterilisere utstyr for det eksperimentelle kolonnen satt opp. For å fremstille den kolonne for sterilisering i autoklaven, vikle den øvre åpning, media tilførselsåpningene, media utslippsventilene, og topprommet ventil med aluminiumsfolie før autoklavering.
- Dekk prøvetakings porter (D.'5) med de riktige plasthetter (D.'6) og sørg for å fjerne klemmene (D.4) før autoklavering.
- Pakk butylgummipropp og tilsvarende kapillærer for mellomstore og utløps flasker (E.2, 2 x G.2 - utarbeidet in § 3), mindre stoppers for glass sprøyter (2 x C.5, E.'10 '; F.'2 - utarbeidet i § 3) og kapillærene knyttet til mellom forsyning og avløps kjertler (s2; w1 - fremstilt i avsnitt 3.4) inn i aluminiumsfolie og sterilisere alt utstyr i autoklaven.
- Etter sterilisering, tørker den steriliserte kolonnen og utstyr i en ovn ved 60 ° C i ytterligere 4 timer.
- I det første trinnet, sterilize den Widdel kolbe med mediet, den NaHCO3-buffer løsning og to butylgummipropp for 5 L glassflaske.
- Siden pumpen røret (pt) ikke er autoklaverbare, sterilisere dem i en etanol (EtOH) løsning (80% EtOH, 20% i vann). Fylle et passende beger med EtOH-løsning og sette pumpen slangen i det, slik at røret er fullstendig fylt med EtOH-løsning. Ta ut etter 3 timer og pakk direkte inn i pre-sterilisert aluminiumsfolie (ovn-sterilisert) og la tørke ved romtemperatur i 2 timer.
5. Montering av Column og utstyr
- Plasser kolonnen (A) på en flat overflate og stabiliseres med en laboratorie-stativ og klemmer. Sørg for å arbeide under sterile forhold (for eksempel innen 40 cm av en gassbrenner eller under en laminær flow hette). Fjern forsiktig aluminiumsfolien fra topp åpning og fylle ut de steriliserte glassperler (A.2).
- Klargjør urglass (A.4) for å tett lukke kolonnen ved å påføre lim Polymers (A.5) til den indre overflate i området der den kommer i kontakt med kolonnen. Lett trykk urglass på plass på toppen av kolonnen for å lime begge delene tett sammen. La det være minst 6 timer for at installasjonen skal tørke.
Merk: Det er mulig å plassere en steril, fine bøyelig ledning mellom kolonne kant og klokken glasset, for å enkelt ta uret glass etter forsøket.
- Klargjør urglass (A.4) for å tett lukke kolonnen ved å påføre lim Polymers (A.5) til den indre overflate i området der den kommer i kontakt med kolonnen. Lett trykk urglass på plass på toppen av kolonnen for å lime begge delene tett sammen. La det være minst 6 timer for at installasjonen skal tørke.
- Mens han jobbet under sterile forhold knytte følgende deler til kolonne:
- Koble gummirørene (B.1) og de tilsvarende rør kontakter (B.2) til de mellom forsyning og avløpsventiler (sammenlign (B) i figur 1).
- Koble slangekoblinger av kjertler (B.3) for media tilførsel og utslipp (utarbeidet i avsnitt 3.4) til de tilsvarende kontaktene på kolonnen (sammenligne (B) i figur 1).
- Fest headspace gassutveksling panel (sammenlign (C) i figur 1 - utarbeidet i kapittel 3.5) til headspace lufte på kolonnen og koble glass sprøyter (C.3) til de tilsvarende rustfritt stål nåler (C.2) og sett de aktuelle butylgummipropp (C.6, C.7 - utarbeidet i avsnitt 3.5.2) inn i bomull fylte sprøyter av glass (C.3).
- Sett butylgummipropp for utslipps flasker (2 x G.20, - utarbeidet i kapittel 3.2) i to sterile 3 L glassflasker (G.1), og koble slangekoblinger av flaskene (G.6) til 3-veis kontakt (G.7).
- Koble den frie enden av mediet utløps kjertel kapillar (w1) til den frie ende av en utløps flaske kapillar (w2) med pumpeslangen (pt). Gjenta denne fremgangsmåten for det andre medium utløps kjertel kapillær og den andre utløp flasken.
- Koble den frie ende av en mellom flaske kapillar (s1) til den frie ende av det medium tilførsels kjertel kapillar (s2) med pumpeslangen (pt). Gjenta denne fremgangsmåten for det andre medium flasken kapillær og det andre medium tilførsel kjertel kapillar.
- Monter medium distribusjonspanelet ved å sette proppen med de tilsvarende kapillærer (F.2 - utarbeidet i kapittel 3.3) inn i glassprøyte av medietdistribusjon panel (F.1).
- Koble medium distribusjonspanelet til kontakten på butylgummistopp for mediet flaske (E.7 - sammenlign F i figur 1).
- Koble N2 / CO2 gass linje til topprommet gassutveksling panelet til Luer-lås nål av rustfritt stål (se stilling (LLF) i figur 1), og spyle installasjon kolonnen og kapillære system med N2 / CO2 ved lavt trykk (<10 mbar). Opprettholde en strøm av gass på de åpne endene av medium flaske kapillær (E.3), 3-veis kontakt (G. 7), og prøvetaking porter (D.5). Sørg derfor for å ha caps av prøvetakings porter (D.6) litt åpne, for å opprettholde sterile forhold gjennom et overtrykk på gassen som strømmer ut.
- Spyl komplett installasjon i minst 20 min.
Merk: I tillegg, er det mulig å lukke outgassing nål (C.6) i topprommet gassutveksling panel med en passende gummi slange og en klemme for å øke effektiviteten av spyletotalanlegget.
- Spyl komplett installasjon i minst 20 min.
- I mellomtiden fylle en 10 L gassposen (gp) med N 2 / CO 2 (v / v, 90/10), etter 10 runder med fylling og utluftings (ved hjelp av en vakuumpumpe) hele volumet for å sikre at posen er fullstendig anoksisk . Sørg for å lukke ventilen på gasspakken etter den siste fyll. Gjenta denne prosedyren med en annen gass pakke, men stenge ventilen efter avlufting (dvs. la den tom).
Merk: N2 / CO2-gass fylt pakke vil bli koblet til mediet flasken for å kompensere den økende topprommet volum på grunn av medium tap ved pumping. N 2 / CO 2 tømmes, men tom gass pakke, senere vil bli koblet til tappe flaskene, for å tillate gass å unnslippe topprommet på grunn av økende væskeutløpsvolum. - Sett than butylgummistopp (E.10 - utarbeidet i avsnitt 3.2.3) inn i sterile glass sprøyte fylt med bomull (E.8 - utarbeidet i punkt 3.6).
- Plasser fylt og lukket medium flaske (E - utarbeidet i seksjon 1) på laboratoriebenken ved siden av kork til medium flaske (E.2), og forberede seg til å koble stopperen til mediet flaske med følgende prosedyre:
- Lukke N2 / CO2-gass-strøm inn i det kapillære (E.3) ved å lukke den tilsvarende gummirøret (E.5) med en slangeklemme.
- Lett løft butylgummistopp av medium flasken og skylle headspace med N 2 / CO 2 (50 mbar) ved å henge en sterilisert, bomull -filled sprøyte med en bøyd, lang metall nål (1 mm x 140 mm) inn i flaskehalsen av mediet flasken (sammenlign Hungate og Macy 17).
- Endrer den lange metall nålen på sprøyten (som tidligere ble brukt for å spyle den topprom) til en engangsnål (0,9 mm x 45 mm, allment tilgjengelig) og injisere inn i stopperen for å tømme det øvre område av mediet flasken med N2 / CO 2.
- Sørg for å ha en liten strøm av gass på den åpne enden av gass sprøyte (E.8 - samlet i avsnitt 5.10) som er koblet til den stopper av mediet flasken. Spyl det øvre område av mediet flasken (E) og glassprøyte (E.8) i minst 4 min.
Merk: Hvis det er nødvendig, åpnerutgassing nål (C.6) i topprommet gassutveksling panel på nytt for å opprettholde en strøm av gass ved den åpne ende av nålen.
- Raskt åpne ventilen på gass pakke og trykke lett på posen for å opprettholde en strøm av N 2 / CO 2 for å spyle røret og kontakten på gass pack.
- Så snart overtrykket slippes fra mediet flasken, raskt koble kontakten av gasspakken (gp.3) til den tilsvarende kontakt i glassprøyte (E.8).
- Åpne ventilen på gasspakken (gp)koblet til utslipps flasker (G) for å tillate luft å bli sluppet inn i gasspakken mens utslipps flaskene fylles opp med strøm medium.
6. Inokulering av bakterier inn i kolonne
Merk: For en abiotiske kontroll eksperiment dette trinnet hoppet over.
- Siden cellekultur vil bli direkte injisert i kolonnen gjennom butylgummipropp av de viktigste prøvepunkter langs siden av kolonnen, må du sørge for å ha utarbeidet seks sprøyter med nåler som er lange nok til å nå sentrum av kolonnen kroppen.
- Steril utsiden av butyl gummipropp av de seks hovedprøvetakingsportene ved kolonnens (A.3) med en EtOH-oppløsning (80%).
- Har serum flaske med kulturen for vaksinasjon klar (utarbeidet i seksjon 2) og sterilisere butylgummistopp av flammende flere dråper EtOH løsning. Spyl sprøyten med steril N2 / CO2 lot en alikvot av kulturen. Ta en ml of den anoksiske celleløsning og injisere det inn i midten av kolonnen gjennom butyl gummikorker av de viktigste prøvetakingsportene (A.3).
Merk: Avhengig av bakterievekst, kan det være nødvendig å justere pumpehastighet (eller til og med stoppe pumping) i løpet av de første dagene av lag-fasen for cellevekst og utvikling for å hindre at kulturene fra å bli vasket ut.
7. sampling
Bemerk: For å samle inn prøver på tvers av kjemiske gradienter som utvikler seg inne i søylen, er det nødvendig å starte prøvetaking fra toppen prøvetakingsportene før de dypere porter, som volum tap oppstår. Sørg for å opprettholde sterile forhold (f.eks, ved å arbeide innen 40 cm av en gassbrenner eller under en laminær flow hette).
- Samle de første prøvene 24 timer etter vaksinasjon. Spyl sprøyten som skal brukes for prøvetaking med steril N2 / CO2, for å unngå oksygen injeksjon i sa-mpling porter (D). Sørg for å fylle sprøyten med N 2 / CO 2 før prøvetaking.
- Raskt fjerne plasthetten (D.6) og sett prøvetaking sprøyten inn i røret kontakten (D.5). Opprettholde et lite gap mellom sprøyte og slange-kontakt. Slipp gassen fra sprøyten og spyle røret kontakten med N 2 / CO 2.
- En fast forbindelse med sprøyten til rørkobling. Fjern klemmen (D.4) og begynne å ta en prøve av ca 1 ml.
- Når du har tegnet prøven og før du tar sprøyten, fest klemmen (D.4). Deretter fjerner prøvetaking sprøyten og fast lukker røret kontakten (D.5) med tilsvarende plastlokk (D.6).
- gjenta Umiddelbart trinn 7,1-7,3 for prøvetaking fra hver port.
- Samle det neste settet med prøver hver 24. time.
Merk: For ytterligere prøver på ulike tidssteg, er det nødvendig å fjerne en liten amount av prøven (for eksempel 0,2-0,4 ml) til å begynne før prøven kan tas, for å fjerne rester av mediet inne i prøvetakingsrøret og for å oppnå representative prøver fra innsiden av kolonnen.
8. analysemetoder
- Oxygen kvantifisering:
Merk: Oksygenkonsentrasjonen i gjennomstrømningsmedium og den øvre delen av kolonnen er kvantifisert ikke-invasiv og ikke-destruktivt ved bruk av de optiske oksygensensorer og oksygenfølsomme fluorescerende folie flekker av 0,5 x 0,5 cm (såkalt optodes), limt langs den indre glassveggen av kolonnen ved anvendelse av silisium-lim (A.6). Det ble sørget for at de oksygenfølsomme folie flekker er ufølsomme for Fe arter for å oppnå pålitelige avlesninger.- Sørg for å kalibrere dataprogrammer med de riktige kalibreringsparametrene for optodes som brukes i kolonnen. De optiske oksygen sensorer kommer med en bestemt calibration for måling ved hjelp av en tilsvarende PC-styrte fiberoptisk oksygenmåler.
- Starte målingen og ta vare for å holde polymeren optisk fiber av den oksygenmåler i rett vinkel i forhold til oksygenfølsomme folie som er limt fast på innsiden av gjennomsiktig glass vegg av kolonnen.
- Gjenta målingen for hver enkelt O to målepunkt i hele kolonnen.
- Fe (II) og total Fe analyse av vandige prøver:
- Ettersom Fe (II) blir raskt oksidert av oksygen i luft ved nøytral pH-verdi, stabilisere de flytende prøvene i vandig Fe (II) kvantifisering gang i 1 M HCl-oppløsning. For et endelig prøvevolum på 1 ml blande 0,5 ml flytende prøve med 0,5 ml 2 M HCl.
- Kvantifisere total Fe etter inkubering av en prøve av det 1 M HCl-stabiliserte prøve med hydroksylamin-hydroklorid (10% vekt / volum, i 1 M HCl) i 30 minutter. Dette reagenset reduserer alt Fe (III) til Fe (II), som så kan kvantifiseres via Ferrozine analysen
- Utfør en Ferrozine analysen ved hjelp av en mikro-titer plateleser. Mål absorbansen ved en bølgelengde på 562 nm. Sørg for å ha standarder innenfor området for påvisbare Fe (II) og total Fe konsentrasjoner.
Merk: Hvis Fe-konsentrasjonene i væskeprøven overskride standard kalibreringer, er det nødvendig å fortynne det stabiliserte prøven med 1 M HCl.- Beregne konsentrasjonen av Fe (III) av forskjellen mellom total Fe og Fe (II).
- Utfør en Ferrozine analysen ved hjelp av en mikro-titer plateleser. Mål absorbansen ved en bølgelengde på 562 nm. Sørg for å ha standarder innenfor området for påvisbare Fe (II) og total Fe konsentrasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
kontrollforsøk
Abiotiske kontrollforsøk (10 dager) viste gjennomgående lav oksygenkonsentrasjon (O 2 <0,15 mg / l) uten vesentlige svingninger i Fe (II) -profile hele oppstrømning vannsøylen. Dannelsen av bunnfall (antagelig Fe (III) (oxyhydr-) oksyder) i mediet reservoaret og svak nedgang i det totale Fe (II) konsentrasjon fra 500 uM til 440 uM over 10 dager viser at noen av oksygendiffusjon gjennom forbindelsene fremstilt av gummi (f.eks E.6; gp.1 i figur 1) 22 for dette eksperiment de laveste oksygenkonsentrasjoner som var praktisk mulig var ≤0.15 mg / l, og er i området for en sensitiv oksygen kvantifisering og over deteksjonsgrensen på. 0,03 mg / l. Oksygen-verdier under 0,15 mg / l er for remainder av dette papir referert til som "ikke-oksyderende".
biotiske eksperiment
Synlige parametre, cellevekst og endringer i vannsøylen
Før inokulering på dag 0 er ingen utfellinger var synlige (figur 2 A). Dette indikerte at kolonnen var riktig oppsett og at ingen oksygen var tilstede (sammenlign figur 3 A) som kan føre til oksidasjon av Fe (II) og dannelsen av Fe (III) utfelles. Som et resultat av (II) -konsentrasjon Fe var konstant gjennom hele oppstrømning vannsøylen som det er vist i profil i figur 4A. Figur 2 A viser at lys gradienten ble redusert til de øvre 6 cm innenforvannsøyle ved hjelp av glassperler matrisen i kolonne sylinder på.
Den grønne farge innenfor de øverste 2,0 cm vannsøyle 84 timer etter inokulering angir veksten av cyanobakterier (figur 2 B). Den bemerkelsesverdige lys oransje bånd på en dybde på -3 cm (markert med pil i figur 2 B) under det grønne båndet er på grunn av Fe-utfellinger som dannes i løpet av Fe (II) oksidering av molekylært oksygen, som produseres av cyanobakterier. Lignende bunnfall var også synlig på overflaten av vannsøylen. Lys orange skum dannet på vannsøylen flaten 84 timer etter inokulering (figur 2 B) som angir fremstilling av O-2 av cyanobakterier. Bunnfallet på overflaten av vannsøylen antagelig dannet på grunn av oksygenet som er utgassing vedflate. Gjenværende Fe (II) ble til slutt oksydert på overflaten og dannet bunnfall på glassperlemassen.
oksygen gradient
Før inokulering på dag 0, ble den initielle O 2-konsentrasjonen i det flytende medium bestemt. Figur 3 A viser tydelig at konsentrasjonen for O 2 gjennom hele vannsøylen var gjennomgående lavere enn konsentrasjonen som er tilstede i kontrollforsøk. Den pre-inokulering O 2 -concentration oversteg aldri verdier på 0,13 mg / LO to (O to middelverdi = 0,099 ± 0,002 mg / l). Dette indikerer at kolonnen var anoksisk før inokulering.
Figur 3 B viser en økning av O 2 konsentrasjon på84 timer etter inokulering med cyanobakterier. Dette, sammen med den synlige grønne biomasse (figur 2 B) er i overensstemmelse med den fotosyntetiske produksjon og akkumulering av O 2 i kolonnen. O 2 -konsentrasjonen etter 84 timer oppnås en maksimal konsentrasjon for O 2 = 29,87 mg / L i en dybde på -0,5 cm under vannsøylen overflaten. O 2 verdier i figur 3 B indikerer at O 2 nivåer var alltid over bakgrunnskonsentrasjon i den øvre 8,5 cm innenfor den vannsøyle (O 2> 0,15 mg / l). Merkbart høyt O 2 konsentrasjoner (> 0,50 mg / l) ble påvist fra -0,5 til -5,5 cm dybde under vannoverflaten kolonnen. Lavere konsentrasjoner for O 2 ≤ 0,15 mg / l ved dybder under -10.5 cm, sammen med den lavest målte verdi for O to = 0,09 mg / L ved en dybde på -20.5 cm indikerer at Tesse områder var anoksisk.
Fe (II) gradient
Figur 4 A viser at Fe (II) -konsentrasjon på dag 0, før inokulering med cyanobakterier, var konstant gjennom hele vannsøylen med en midlere konsentrasjon av Fe (II) middelverdi = 282,6 ± 6,8 uM. Konsentrasjonen i mediet reservoaret på dag 0 ble Fe (II) reservoar = 320,4 ± 11,6 uM.
84 timer etter inokulering med cyanobakterier til (II) -konsentrasjon Fe avtatt betydelig i de øverste 9 cm i vannsøylen. Figur 4 B viser en tydelig Fe (II) gradient, hvor konsentrasjoner av Fe (II) reduseres til den øvre overflaten av vannsøyle. Imidlertid, Fe (II) var fremdeles detekteres ved overflaten av vannsøylen. th e laveste Fe (II) -konsentrasjon detektert var direkte under det flytende medium overflate i en dybde på -0.9 cm. Fe (II) konsentrasjoner økte med dybde fra Fe (II) = 9,9 ± 2,8 uM ved -0.9 cm til Fe (II) = 258,6 ± 3,1 uM i en dybde på -8.9 cm, danner en bratt positiv lineær Fe (II) gradient over dybde ([Fe (II)-d] = (d + 1,278) 0,031 ∙ 1; d: dybde (cm) ; R2 = 0,9694) begrenset til de øverste 6,8 cm. Områder i det flytende medium under -9 cm dybde forblir merkbart konstant og viser ingen signifikant reduksjon i deres konsentrasjoner for Fe (II) i forhold til deres opprinnelige verdier for Fe (II) på dag 0 (T-test, p <0,05).
Figur 1. Skjematisk eksperiment satt opp. Alfanumeriske koder for elementer refererer til delene som er oppgitt i tabell 2.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54251/54251fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Synlige forandringer i glassperle matrise hele kolonnen sylinder før og 84 timer etter inokulering med cyanobakterier. Rosa rutene er oksygen sensorer. (A) Nærbilde av de øverste 6 cm i kolonnen satt opp før vaksinasjonen. Den væskefylte kolonnen som viser en synlig lys gradient. Glassperlemassen smalner synlig lys gradient til de øvre 6 cm. (B) Nærbilde av den øvre 6 cm 84 timer etter vaksinasjon. Grønn indikerer synlig biomasse, tettere i toppen av kolonnen der lysintensiteten er høyest. Pilen peker mot en svakt synlig oransje band, noe som resulterte fra dannelsen av Fe(III) utfelles på grunn av Fe (II) oksidering av molekylær O 2 som produseres av cyanobakterier. Svakt synlig oransje skum på toppen av vannsøylen overflaten indikerer Fe (III) også utfelling der. O 2 utgassing gjennom overflaten bevirker skumming av Fe (III) utfelles. (C) Oversikt over fylt kolonne sylinder. Synlig vekst av cyanobakterier er begrenset til de øverste 4 cm på grunn av begrenset lys tilgjengelighet med dybde. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Oksygen profil i vannsøylen før og 84 timer etter inokulering med cyanobakterier. Null cm for dybde på y-aksen indikerer vannet column overflaten. Positive verdier for dybder refererer til topprommet over væskemediet nivå, mens negative verdier representerer dybder i vannsøylen. Legg merke til logaritmisk skala for O 2 konsentrasjoner på x-aksen. Den vertikale stiplede linjen angir terskelen for anoksiske betingelser (O 2 ≤ 0,15 mg / l). (A) Oksygen profil [0h] før inokulering. Verdier for O 2 var konstant under 0,13 mg / l i hele vannsøylen. (B) Oksygen profilen 84 timer etter vaksinasjon. O 2 var over 0,5 mg / l i den øvre 5,5 cm av vannsøylen. O 2 konsentrasjonene er høyere enn bakgrunnskonsentrasjoner (≥ 0,15 mg / L, stiplet linje) i områdene ovenfor -8,5 cm dybde. Dypere områder var anoksisk med O 2 ≤ 0,15 mg / l. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 4. Fe (II) profil i vannsøylen før og 84 timer etter inokulering med cyanobakterier. Merk: Feilfelt representerer tekniske replikater utledet fra tre eksemplarer målinger av én prøve i Ferrozine analysen. (A) Fe (II) profil [0h] før inokulering. Verdier for Fe (II) var konstant gjennom hele vannsøylen med en middelverdi for Fe (II) middelverdi = 282,6 ± 6,8 uM. Variasjoner i Fe (II) profil resultat fra enkelteksempler Fe (II) quantifications. Fe (II) Tallfesting på eksempel triplicates vil trolig føre til mindre variasjon. (B) Fe (II) profil 84 timer etter inokulering. Merkbart lavere Fe (II) konsentrasjoner i den øvre 6,8 cm i vannsøylen. Fe (II) verdier under -8,9 cm dybde viser høyere Fe(II) konsentrasjoner som ikke vesentlig forskjellig fra innledende Fe (II) verdier før inokulering med cyanobakterier (T-test, p <0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Utstyr | Mengde | Produktbeskrivelse | informasjon detaljer | ||
| Merke | Best.nr. | Referanse adresse | |||
| 1 | Widdel kolbe (5 L) | Ochs | 110015 | labor-ochs.de | |
| 2 | Glassflasker (5 L) | Rotilabo | Y682.1 | carlroth.com | |
| 3 | Glass pipetter (5 ml) | 51714 | labor-ochs.de | ||
| 1 | 0,22 mikrometer Steritop filterenheten (0,22 mikrometer polyetersulfon membran) | Millipore | X337.1 | carlroth.com | |
| 0,5 m 2 | Aluminiumsfolie | - | |||
| Supplies | - | N 2 - hanskerom (100% N 2) | - | ||
| - | N 2 / CO 2 - gass (90/10, v / v; 50 mbar) | - | |||
| 1 | Steril Luer Lock glassprøyte, fylt med bomull | C681.1 | carlroth.com | ||
| 1 | Luer Lock rustfritt stål nåler (150 mm, 1,0 mm ID) | 201015 | labor-ochs.de | ||
| Kjemikalier | 4,8 L | MQ-vann | - | ||
| for 5 L medium løsning | 100 g | NaCl | 433209 | sigmaaldrich.com | |
| 34 g | MgSO4 | 208094 | sigmaaldrich.com | ||
| 7,5 g | CaCl2 | C4901 | sigmaaldrich.com | ||
| 1,25 g | NH4CI | A9434 | sigmaaldrich.com | ||
| 0,34 g | KH 2 PO 4 | P5655 | sigmaaldrich.com | ||
| 0,45 g | KBr | P3691 | sigmaaldrich.com | ||
| 3,3 g | KCl | P9541 | sigmaaldrich.com | ||
| 200 ml | Anoksisk Na 2 HCO 3-buffer-løsning (22 mM) | - | |||
| 15 mg | Selen og wolframat løsning (forb. Wu et al., 2014) | - | |||
| 5 ml | Na 2 S 2 O 3-løsning (1 M) | - | |||
| 2,5 ml | Marine fotoautotrofi (MP) vitamin løsning (forb. Wu et al., 2014) | - | |||
| 5 ml | MP sporstoffet solution (komp. Wu et al., 2014) | - | |||
| Henvisning | |||||
| Wu, W., Swanner, ED, Hao, LK, Zeitvogel, F., Obst, M., Pan, YX, og Kappler, A. (2014). Karakterisering av fysiologi og celle mineral interaksjoner av det marine anoxygenic phototrophic Fe (II) oksiderer Rhodovulum iodosum - implikasjoner for prekambrium Fe (II) oksidasjon. Fems Mikrobiologi Ecology, 88 (3), 503-515. | |||||
Tabell 1. Medium forberedelser. Utstyrsliste, forsyninger og kjemikalier for utarbeidelse av kulturmediet.
| Antall. | Ref. | Produktbeskrivelse | informasjon detaljer | ||||
| til | 1 | (EN) | glassylinder | Y310.1 | carlroth.com | * Tilpasset modifisert av glass produksjonsanlegg | |
| 2 g | (A.1) | glassull | 7377,2 | carlroth.com | |||
| 1,03 L | (A.2) | Glassperler (ø 0,55 til 0,7 mm) | 11079105 | biospec.com | |||
| 6 | (A.3) | Butylgummistopp (ø 1,2 cm) | 271024 | labor-ochs.de | |||
| 1 | (A.4) | Petri oppvask, glass (ø 8,0 cm) | T939.1 | carlroth.com | |||
| 40 ml | (A.5) | Polymers lim | OTTOSEAL S68 | adchem.de | |||
| 11 | (A.6) | Optisk oksygensensor folie (for oksygen-analyse, se nedenfor) | - på forespørsel - | presens.de | |||
| til | 4 | (B) | medium kjertler | ||||
| 4 | (B.1) | Gummi rør (35 mm, 7 mm ID) | 770350 | labor-ochs.de | |||
| 4 | (B.2) | Luer Lock rør kontakten (3,0 mm, luer lock hann = LLM) | P343.1 | carlroth.com | |||
| 4 | (B.3) | Luer Lock rør kontakten (3,0 mm, luer lock hunn = LLF) | P335.1 | carlroth.com | |||
| 4 | (B.4) | Gummi slangen (25 mm, 0,72 mm ID) | 2600185 | newageindustries .com | |||
| til | 1 | (C) | Headspace gassutveksling Panel | ||||
| 1 | (C.1) | Gummi slangen (50 mm, 7 mm ID) | 770350 | labor-ochs.de | |||
| 2 | (C.2) | Luer-Lock-nål av rustfritt stål (150 mm, 1,0 mm ID) | 201015 | labor-ochs.de | |||
| 2 | (C.3) | Luer-Lock glassprøyte (10 ml) | C680.1 | carlroth.com | |||
| 2 g | (C.4) | Loose bomull | - | ||||
| 2 | (C.5) | Butylgummistopp (ø 1,75 cm) | 271050 | labor-ochs.de | |||
| 1 | (C.6) | Nål av rustfritt stål (40 mm, 1,0 mm ID) | Sterican | 4665120 | bbraun.de | ||
| 1 | (C.7) | Luer-Lock-nål av rustfritt stål (150 mm, 1,5 mm ID) | 201520 | labor-ochs.de | |||
| (LLF) | stilling: Luer Lock kvinnelige kontakr del på C.7 | ||||||
| 10 ml | (C.8) | Polymers lim | OTTOSEAL S68 | adchem.de | |||
| til | 1 | (D) | sampling Port | ||||
| 1 | (D.1) | Rustfritt stål nål (120 mm, 0,7 mm ID) | Sterican | 4665643 | bbraun.de | ||
| 1 | (D.2) | Gummi slangen (40 mm, 0,74 mm ID) | 2600185 | newageindustries .com | |||
| 2 | (D.3) | Krympeslange (35 mm, 3 mm ID krympet) | 541458-62 | conrad.de | |||
| 1 | (D.4) | slangeklemmen | STHC-C-500-4 | tekproducts.com | |||
| 1 | (D.5) | Luer Lock rør kontakten (1,0 mm, LLF) | P334.1 | carlroth.com | |||
| 1 | (D.6) | Luer Lock plastlokk (LLM) | CT69.1 | carlroth.com | |||
| til | 1 | (E) | medium flaske | ||||
| 1 | (E.1) | Glassflaske (5 L) | Rotilabo | Y682.1 | carlroth.com | ||
| 1 | (E.2) | Butylgummistopp (for GL45) | 444704 | labor-ochs.de | |||
| 1 | (E.3) | Rustfritt stål kapillær (300 mm, 0,74 mm ID) | 56736 | sigmaaldrich.com | |||
| 1 | (E.4) | Rustfritt stål kapillær (50 mm, 0,74 mm ID) | 56737 | sigmaaldrich.com | |||
| 4 | (E.5) | Krympeslange (35 mm, krympet 3 mm ID) | 541458-62 | conrad.de | |||
| 2 | (E.6) | Gummi slangen (100 mm, 0,74 mm ID) | 2600185 | newageindustries .com | |||
| 1 | (E.7) | Luer Lock rør kontakten (1,0 mm, LLF) | P334.1 | carlroth.com | |||
| 1 | (E.8) | Luer-Lock glassprøyte (10 ml) | C680.1 | carlroth.com | |||
| 1 g | (E.9) | Loose bomull | - | ||||
| 1 | (E.10) | Butylgummistopp (ø 1,75 cm) | 271050 | labor-ochs.de | |||
| 1 | (E.11) | Rustfritt stål nål (40 mm, 0,8 mm ID) | Sterican | 4657519 | bbraun.de | ||
| til | 1 | (F) | Medium distribusjon panel | ||||
| 1 | (F.1) | Luer Lock glass sprøyte (5 ml) | <td>C679.1 | carlroth.com | |||
| 1 | (F.2) | Butylgummistopp (ø 1,75 mm) | 271050 | labor-ochs.de | |||
| 2 | (F.3) | Nål av rustfritt stål (40 mm, 0,8 mm ID) | Sterican | 4657519 | bbraun.de | ||
| 2 | (F.4) | Gummi slangen (40 mm, 0,74 mm ID) | 2600185 | newageindustries .com | |||
| til | 2 | (G) | utslipps~~POS=TRUNC flasker | ||||
| 2 | (G.1) | Glassflaske (2 L) | Rotilabo | X716.1 | carlroth.com | ||
| 2 | (G.2) Butylgummistopp (for GL45) | 444704 | labor-ochs.de | ||||
| 4 | (G.3) | Rustfritt stål kapillær (50 mm, 0,74 mm ID) | 56736 | sigmaaldrich.com | |||
| 2 | (G.4) | Gummi rør (30 mm x 0,74 mm ID) | 2600185 | newageindustries .com | |||
| 2 | (G.5) | Gummi slangen (100 mm x 0,74 mm ID) | 2600185 | newageindustries .com | |||
| 2 | (G.6) | Luer Lock rør kontakten (1,0 mm, LLF) | P334.1 | carlroth.com | |||
| 1 | (G.7) | Luer Lock 3-veis kontakt (LLF, 2x LLM) | <td>6134 | cadenceinc.com | |||
| tilleggsutstyr | |||||||
| 1 | (L) | Lyskilde | Samsung | SI-P8V151DB1US | samsung.com | ||
| 1 | (P) | peristaltisk pumpe | Ismatec | EW-78017-35 | coleparmer.com | ||
| 4 | (Pt) | Pumping tubing (0,89 mm ID) | EW-97628-26 | coleparmer.com | |||
| 4 | (S1 / 2) | Rustfritt stål kapillær (200 mm, 0,74 mm ID) | 56736 | sigmaaldrich.com | |||
| 4 | (W3 / 4) | Stainless stål kapillær (400 mm, 0,74 mm ID) | 56737 | sigmaaldrich.com | |||
| 2 | (Gp) | Supel-Inert Foil (Tedlar - PFC) gass pakke (10 L) | 30240-U | sigmaaldrich.com | |||
| med | 2 | (Gp.1) | Gummi rør (30 mm, 6 mm ID) | 770300 | labor-ochs.de | ||
| 1 | (Gp.2) | Luer Lock rør kontakten (3,0 mm, LLM) | P343.1 | carlroth.com | |||
| 1 | (Gp.3) | Luer Lock rør kontakten (3,0 mm, LLF) | P335.1 | carlroth.com | |||
| Supplies | 2 | - | N 2 / CO 2 - gassledningen (90/10, v / v; 50mbar) | - | |||
| 2 | - | Gasstett sprøyte (20 ml) | C681.1 | carlroth.com | |||
| 1 | - | bunsenbrenneren | - | ||||
| 1 | - | Fiberoptisk oksygenmåler for oksygen kvantifisering | Presens | TR-FB-10-01 | presens.de | ||
| 1 | - | Støvsuger pumpe | - | ||||
| 1 | - | Silikon lim for oksygen optodes | Presens | PS1 | presens.de | ||
| -: Elementer merket med en strek (-) er allment tilgjengelig og ikke såpecific element | |||||||
Tabell 2. kolonne oppsett. Mengder, alfanumeriske referansenummer og elementbeskrivelsene av utstyr for eksperimentelle oppsett.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikrobielle samfunn i prekambrium havet ble regulert av, eller endring som et resultat av deres aktivitet og de rådende geokjemiske forhold. I tolke opprinnelsen til BIF, forskere generelt antyde tilstedeværelsen eller aktiviteten til mikroorganismer basert på sedimentologi eller geokjemi av BIF, f.eks Smith et al. 23 og Johnson et al. 24. Studiet av moderne organismer i moderne miljøer som har geokjemiske analoger til gamle miljøer er også en verdifull tilnærming, f.eks Crowe et al. 11 og Koeksoy et al. 14. En tredje tilnærming er å benytte organismer i konstruerte laboratoriesystemer som simulerer prosesser som pågår i prekambrium havet, for eksempel, Krepski et al. 25. Denne type fremgangsmåte er nyttig for å teste bestemte hypoteser, og fjerne kjemiske eller biologiske faktorer som kan være tilstede i moderne systemer, men var ikkedel av prekambrium havet (f.eks, vannplanter og dyr). Vi presenterer derfor en proof-of-concept fremgangsmåte for en dynamisk, laboratorium oppstrømning system, hvori aktiviteten til (cyano) bakterier og deres innflytelse på resulterende geokjemiske profiler kan vurderes under kontrollerte laboratoriebetingelser. Vår kolonne kan brukes til å teste hypoteser om organismene og prosesser som bidrar til avsetning av BIF, og biosignatur beholdt i BIF.
Vi optimalisert protokollen for kolonnen oppsett slik at monteringen er forståelig og enkelt conductible. Men noen trinnene i protokollen må håndteres forsiktig og ideelt utført med hjelp av en hjelpe person. Spesielt må tilkoblingen av de mellom flasker å kolonne sylinderen den kan utføres raskt for å unngå forurensning av mediet løsning med oksygen. Bruken av ikke-steril eller utstyr som arbeider under sterile laboratoriebetingelser vil resultere in forurensning av eksperimentet og upålitelige resultater. Derfor er det en absolutt nødvendighet å sterilisere utstyr og vedlikeholde sterile forhold (jobber i en laminær hette eller 40 cm ved siden av en Bunsen-brenner) mens du setter opp forsøket og prøvetaking. I tillegg er noen fysisk-kjemiske parametre i kolonnematerialet forårsaket kjemiske endringer over lang tid satt opp i kolonne eksperiment den. Deler som er laget av gummi slangen synes å ha en diffusjonskoeffisient for oksygen som er høy nok til å signifikant påvirke mediet reservoaret flasken og føre til oksidasjon av Fe (II) og mineral utfelling i mediet oppløsning. Det abiotiske inntak av> 10% Fe (II) på grunn av nedbør i løpet av abiotiske forsøket over 10 dager (sammenlign: representative resultater) må tas i betraktning for fremtidige langsiktige eksperimenter. Den lyskilde som ble brukt i denne studien opprettet en nedstrømning lys gradient innenfor den øvre 6 cmav kolonnen. Lyset spektra dekket fotosyntese aktive bølgelengder av klorofyll a og b i Synechococcus og tillot vekst og fotosynteseaktiviteten. Faktisk lyskilden er en av de viktigste parametrene om phototrophic organismer siden begge kan lett kvalitet og kvantitet sterkt påvirke phototrophic bakterier 11,13. Varianter av bølgelengder og spektral klasser, også med tanke på høyere UV-stråling i løpet av prekambrium, kan videre tillate innsikt i lys avhengige biogeokjemiske reaksjoner. I lys ruge eksperimenter, oppdaget vi at lyset ble ført gjennom glassveggen av kolonnen, som sender ut lys gjennom prøvetakingsportene og ved bunnen av kolonnen. For senere eksperimenter, bør glasset ved toppen av kolonnen erstattes av ikke-lysledende glass. Lyset gradient må måles i en mock set-up, så det var ingen enkel og billig måte å måle lyset gradient innenforlukket kolonne system er tilgjengelig. Vi forutsetter en betydelig endring over tid i den maksimale inntrengningsdybde av lys på grunn av absorpsjon av lys av celler og mineraler. Måling av lys gradient in situ under eksperimentet vil være av interesse for fremtidige eksperimenter. Bruken av lysspredende perler i glassperler matrisen og kvantifisering av spredt lys fra utsiden, kan det være en mulighet for å kvantifisere den relative lett tilgjengelighet i visse dybder over tid. En ytterligere forbedring ville omfatte et deksel som ikke må limes, men kan enkelt festes og fjernes med en flens og omsluttende klemme. En fire-punkts tilførsel media og utløpsporten ville resultere i et mer homogent strømningsfelt i kolonnen. Smalere posisjonering av hovedprøvetakingsportene for væskeprøver vil resultere i en høyere oppløsning av sampling av de biologiske og geokjemiske gradienter innenfor kolonnen.
Ikke desto mindre, den første resultatene viserd at den vertikale gjennomstrømningskolonne kan anses som en passende eksperimentelle oppsettet for å undersøke mikrobielle prosesser og geokjemiske endringer i en oppstrømning system. Vi påstår at denne kolonnen tjener som en prototype for å bevise den samlede funksjonalitet av systemet. Videre våre resultater validere allment holdt forutsetninger, modellering resultater og slutninger fra sedimentære geokjemi at en kjemoklin mellom oksygen og Fe (II) resultater hvis cyanobakterier er til stede i en Fe (II) rik oppstrømning system 20. De anoksiske betingelser før vaksinasjonen reflektere en prekambrium havet før kolonisering av cyanobakterier eller organismer som kan oxygenic fotosyntese. Med fremveksten av oksygen i overflatevann, blir oppstrømning Fe (II) oksideres og utfelles som Fe (III) mineraler som skjedde under deponering av BIF 26 sikret etablering av et kjemoklin og mineraldannelse kan vurderes å ekstrapolere geokjemiske prosesser i større skala miljøs. Men for oppskalering de evaluerte resultatene til naturlige (gamle) miljøer, flere fysiske prosesser som må vurderes. Advective lateral transport, for eksempel, kan forstyrre etableringen av en kjemoklin, samme som vind-indusert turbulens i overflatevannet.
Utvinning av væskeprøver fra vannsøylen for Fe (II), total Fe målinger, og den ikke-invasiv O 2 kvantifisering var i stand til å følge utviklingen av en reaksjonsfronten mellom disse kjemiske stoffer i en enkel, rask og pålitelig måte . Konsentrasjonen lav Fe (III) i prøver tatt fra kolonnen satt opp i abiotiske kontrollforsøk viser tydelig at selv om noen oksydasjon skjedde i media flasken, ble kolonnen selv lukket hermetisk til ekstern O 2 tilstrømning. Videre har disse resultatene indikerer at vår prøvetakings protokoll opprettholdes anoksiske prøver for Fe (II) kvantifisering. Endringer i pH ble ikke registrert under kolonne experimen det og kan ha en dominerende effekt på Fe-arts. Men den nåværende gjennomstrømningssystemet ble bufret med 22 mM NaHCO3 som er i likevekt med den anoksiske N2 / CO2-atmosfære i topprommet og gjør det mulig å opprettholde en circum-nøytral pH-verdi i minst 84 timer. Likevel kan in-situ kvantifisering av pH være en viktig parameter for å fullt ut forstå geokjemiske prosesser i potensielle lange kjøre eksperimenter og ekstrapolering til (gamle) åpent hav systemer. Glassperle matrise, som brukes til å stabilisere etablere geokjemiske gradienter i kolonne sylinder den, førte til en opphopning av Fe-utfellinger i undergrunnen av vannsøylen. Vi hypotese at de akkumulerte utfellinger ikke har en dominerende innvirkning på vår 84 timers eksperiment. Men kanskje nedverdigende biomasse indusere redoks prosesser på Fe-utfellinger som resulterer i Fe sykling. Dette må vurderes om mulige lange løp (<84 t) eksperimenter. Faktisk, lettindusert Fe-redoks sykling og en frigjøring av Fe til toverdig jern bassenget kunne observeres og kvantifisert i replikere lang sikt (21 dager) eksperimenter (Wu, W., Maisch, M., Kappler, A., Pan, Y. , og Swanner, ED Foto Fe (III) reduksjon stabilisert Fe (II) i Arkeikum oksygen oaser. Geology. (in prep.)).
Fremtidige kolonne eksperimenter vil inkorporere både forskjellige mikroorganismer og variasjoner i kulturmediet sammensetning. Dette gjør at simulering av ulike miljøforhold som er representative for ulike stadier under omleggingen av prekambrium Ocean. For eksempel kan silika tilsettes til mediet for å simulere konsentrasjonen på 0,67 til 2,2 mm som var til stede i urtiden sjøvann 27. Videre er konsentrasjonen av sulfat i mediet løsning kan bli endret for å ta opp variasjoner i sammensetningen av urtiden sjøvann. Variasjoner av dyrkningsmediet vil sannsynligvis påvirke physiology og effekten av mikroorganismer på de geokjemiske mønstre i vannsøylen 19 som gjeldende kolonne oppsettet tillater oss å undersøke in situ. I tillegg til dette, vil forventede eksperimenter involvere mer komplekse mikrobielle fellesskap som phototrophic Fe (II) -oxidizing bakterier (f.eks, Kappler et al.) 28, mikroaerofil Fe (II) -oxidizing bakterier (f.eks, Krepski et al.) 29 og cyanobakterier. Kolonne eksperimenter vil bidra til å skille fra hverandre de individuelle bidrag av disse mikrobielle prosesser for avsetning av båndjern formasjoner. Men for tolkning og ekstrapolering til gamle (og moderne) miljøer må utledes svært nøye. Den mikrobielle habitat som er simulert i dagens studiemodeller de grunnleggende funksjonene i en potensiell prekambrium oppstrømning havet vannsøylen: vertikale Fe (II) flukser og en eufotisk lys gradient, anoksisk atmosfære og cyanobakterier. i annonsendition, forholdene i kunstig oppstrømning systemet potensielt favoriserer vekst av cyanobakterier, på grunn av konstant temperatur og 24 timers lysforhold potensielt fører til høyere O 2 produksjonsrater, mens forhøyet O 2 -konsentrasjoner senere fører til høyere Fe (II) oksidasjon priser . Derfor denne studien kan ikke tolkes som en forsøks passer alle hypoteser om BIF opprinnelse.
Likevel tillater oppsett in-situ undersøkelse av ulike geokjemiske prosesser og variasjonen og simulering av visse grensebetingelser (lys tilgjengelighet, medium sammensetning, flukser). Kvantifisering av enkeltparametere og geokjemiske interaksjoner etter lab-kontrollerte forhold kan gi innsikt i gamle og moderne miljøer. Videre gir den kolonnesystem oss for å teste hypoteser om hvordan de geokjemiske betingelsene reguleres mikrobiell aktivitet. For eksempel har det vært hypoteserd at høye konsentrasjoner Fe (II) i prekambriske upwelling systemer kan ha begrenset fotosyntetiske oksygenproduksjon på grunn av giftigheten av Fe (II) i solbelyste, oksygen miljøer 20. Fremtidige undersøkelser vil i tillegg omfatte kjemiske fluks og volumetriske priser som gjør at kvalitative og kvantitative støkiometriske beregninger av reaksjonskinetikk i den kunstige vannsøylen. Enkle observasjoner vil da være knyttet til å evaluere en modell for de ulike miljø simuleringer. Med kolonnen satt opp, er vi nå i stand til å undersøke direkte stressrespons av (cyano) bakterier til fluks av høy Fe (II) og lys i en in-situ oppstrømning system som representerer marine Early Earth forhold 20. Kolonnen kan også brukes til å teste hypoteser angående geokjemiske signaturer som produseres av mikrobiell aktivitet, for eksempel utviklingen av Fe isotopen preparater langs en oppstrømning system hvor Fe (II) blir oksydert (f.eks Czaja etal.) 30. I tillegg kunne de glassperler som stabiliserer de kjemiske gradienter innenfor kolonnen erstattes med sand eller sedimenter. Det er derfor også mulig å anvende denne kolonnen for simuleringer av de geokjemiske gradienter som kan utvikle i marine eller ferskvannssedimenter bebodd av mikroorganismer (f.eks Melton et al.) 31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Mark Nordhoff bistått i utformingen og gjennomføringen av slangekoblinger. Ellen Struve bidratt til å velge og kjøpe utstyr som brukes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Widdel flask (5 L) | Ochs | 110015 | labor-ochs.de |
| Glass bottles (5 L) | Rotilabo | Y682.1 | carlroth.com |
| Glass pipettes (5 ml) | 51714 | labor-ochs.de | |
| 0.22 µm Steritop filter unit (0.22 µm Polyethersulfone membrane) | Millipore | X337.1 | carlroth.com |
| Aluminum foil | |||
| Sterile Luer Lock glass syringe, filled with cotton | C681.1 | carlroth.com | |
| Luer Lock stainless steel needles (150 mm, 1.0 mm ID) | 201015 | labor-ochs.de | |
| NaCl | Sigma | 433209 | sigmaaldrich.com |
| MgSO4 | Sigma | 208094 | sigmaaldrich.com |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | sigmaaldrich.com |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | sigmaaldrich.com |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | sigmaaldrich.com |
| KBr | Sigma | P3691 | sigmaaldrich.com |
| KCl | Sigma | P9541 | sigmaaldrich.com |
| Glass cylinder | Y310.1 | carlroth.com | |
| Glass wool | 7377.2 | carlroth.com | |
| Glass beads (ø 0.55 - 0.7 mm) | 11079105 | biospec.com | |
| Butyl rubber stopper (ø 1.2 cm) | 271024 | labor-ochs.de | |
| Petri Dish, glass (ø 8.0 cm) | T939.1 | carlroth.com | |
| Polymers glue | OTTOSEAL S68 | adchem.de | |
| Optical oxygen sensor foil (for oxygen analysis, see below) | – on request – | presens.de | |
| Rubber tubing (35 mm, 7 mm ID) | 770350 | labor-ochs.de | |
| Luer Lock tube connector (3.0 mm, Luer lock male = LLM) | P343.1 | carlroth.com | |
| Luer Lock tube connector (3.0 mm, Luer lock female = LLF) | P335.1 | carlroth.com | |
| Rubber tubing (25 mm, 0.72 mm ID) | 2600185 | newageindustries.com | |
| Rubber tubing (50 mm, 7 mm ID) | 770350 | labor-ochs.de | |
| Luer Lock stainless steel needle (150 mm, 1.0 mm ID) | 201015 | labor-ochs.de | |
| Luer Lock glass syringe (10 ml) | C680.1 | carlroth.com | |
| Loose cotton | – | ||
| Butyl rubber stopper (ø 1.75 cm) | 271050 | labor-ochs.de | |
| Stainless steel needle (40 mm, 1.0 mm ID) | Sterican | 4665120 | bbraun.de |
| Luer Lock stainless steel needle (150 mm, 1.5 mm ID) | 201520 | labor-ochs.de | |
| position: Luer Lock female connector part at C.7 | |||
| Polymers glue | OTTOSEAL S68 | adchem.de | |
| Stainless steel needle (120 mm, 0.7 mm ID) | Sterican | 4665643 | bbraun.de |
| Rubber tubing (40 mm, 0.74 mm ID) | 2600185 | newageindustries.com | |
| Heat shrink tubing (35 mm, 3 mm ID shrunk) | 541458 - 62 | conrad.de | |
| Tube clamp | STHC-C-500-4 | tekproducts.com | |
| Luer Lock tube connector (1.0 mm, LLF) | P334.1 | carlroth.com | |
| Luer Lock plastic cap (LLM) | CT69.1 | carlroth.com | |
| Glass bottle (5 L) | Rotilabo | Y682.1 | carlroth.com |
| Butyl rubber stopper (for GL45) | 444704 | labor-ochs.de | |
| Stainless steel capillary (300 mm, 0.74 mm ID) | 56736 | sigmaaldrich.com | |
| Stainless steel capillary (50 mm, 0.74 mm ID) | 56737 | sigmaaldrich.com | |
| Shrink tubing (35 mm, 3 mm ID shrunk) | 541458 - 62 | conrad.de | |
| Rubber tubing (100 mm, 0.74 mm ID) | 2600185 | newageindustries.com | |
| Luer Lock tube connector (1.0 mm, LLF) | P334.1 | carlroth.com | |
| Luer Lock glass syringe (10 ml) | C680.1 | carlroth.com | |
| Loose cotton | – | ||
| Butyl rubber stopper (ø 1.75 cm) | 271050 | labor-ochs.de | |
| Stainless Steel needle (40 mm, 0.8 mm ID) | Sterican | 4657519 | bbraun.de |
| Luer lock glass syringe (5 ml) | C679.1 | carlroth.com | |
| Butyl rubber stopper (ø 1.75 mm) | 271050 | labor-ochs.de | |
| Rubber tubing (40 mm, 0.74 mm ID) | 2600185 | newageindustries.com | |
| Glass bottle (2 L) | Rotilabo | X716.1 | carlroth.com |
| Butyl rubber stopper (for GL45) | 444704 | labor-ochs.de | |
| Stainless steel capillary (50 mm, 0.74 mm ID) | 56736 | sigmaaldrich.com | |
| Rubber tubing (30 mm x 0.74 mm ID) | 2600185 | newageindustries.com | |
| Rubber tubing (100 mm x 0.74 mm ID) | 2600185 | newageindustries.com | |
| Luer Lock tube connector (1.0 mm, LLF) | P334.1 | carlroth.com | |
| Luer Lock 3-way connector (LLF, 2x LLM) | 6134 | cadenceinc.com | |
| Light source | Samsung | SI-P8V151DB1US | samsung.com |
| Peristalic pump | Ismatec | EW-78017-35 | coleparmer.com |
| Pumping tubing (0.89 mm ID) | EW-97628-26 | coleparmer.com | |
| Stainless steel capillary (200 mm, 0.74 mm ID) | 56736 | sigmaaldrich.com | |
| Stainless steel capillary (400 mm, 0.74 mm ID) | 56737 | sigmaaldrich.com | |
| Supel-Inert Foil (Tedlar - PFC) gas pack (10 L) | 30240-U | sigmaaldrich.com | |
| Rubber tube (30 mm, 6 mm ID) | 770300 | labor-ochs.de | |
| Luer Lock tube connector (3.0 mm, LLM) | P343.1 | carlroth.com | |
| Luer Lock tube connector (3.0 mm, LLF) | P335.1 | carlroth.com | |
| Gas-tight syringe (20 ml) | C681.1 | carlroth.com | |
| Bunsen burner | – | ||
| Fiber optic oxygen meter for oxygen quantification | Presens | TR-FB-10-01 | presens.de |
| Vacuum pump | – | ||
| Silicone glue for oxygen optodes | Presens | PS1 | presens.de |
References
- Lyons, T. W., Reinhard, C. T., Planavsky, N. J. The rise of oxygen in Earth's early ocean and atmosphere. Nature. 506 (7488), 307-315 (2014).
- Raymond, J., Blankenship, R. E. The origin of the oxygen-evolving complex. Coord. Chem. Rev. 252 (3-4), 377-383 (2008).
- Kendall, B., Reinhard, C. T., Lyons, T., Kaufman, A. J., Poulton, S. W., Anbar, A. D. Pervasive oxygenation along late Archaean ocean margins. Nature Geosci. 3 (9), 647-652 (2010).
- Olson, S. L., Kump, L. R., Kasting, J. F. Quantifying the areal extent and dissolved oxygen concentrations of Archean oxygen oases. Chem. Geol. 362 (1), 35-43 (2013).
- Satkoski, A. M., Beukes, N. J., Li, W., Beard, B. L., Johnson, C. M. A redox-stratified ocean 3.2 billion years ago. Earth Planet. Sci. Lett. 430 (1), 43-53 (2015).
- Holland, H. D. Oceans - Possible Source of Iron in Iron-Formations. Econ. Geol. 68 (7), 1169-1172 (1973).
- Holland, H. D., Lazar, B., Mccaffrey, M. Evolution of the Atmosphere and Oceans. Nature. 320 (6057), 27-33 (1986).
- Klein, C., Beukes, N. J. Time distribution, stratigraphy, and sedimentologic setting, and geochemistry of Precambrian iron-formations. The Proterozoic Biosphere. Schopf, J. W., Klein, C. , Cambridge University Press. 139-146 (1992).
- Poulton, S. W., Canfield, D. E. Ferruginous Conditions: A Dominant Feature of the Ocean through Earth's History. Elements. 7 (2), 107-112 (2011).
- Busigny, V., et al. Iron isotopes in an Archean ocean analogue. Geochim. Cosmochim. Acta. 133, 443-462 (2014).
- Crowe, S. A., et al. Photoferrotrophs thrive in an Archean Ocean analogue. PNAS. 105 (41), 15938-15943 (2008).
- Jones, C., et al. Biogeochemistry of manganese in ferruginous Lake Matano, Indonesia. Biogeosciences. 8 (10), 2977-2991 (2011).
- Lliros, M., et al. Pelagic photoferrotrophy and iron cycling in a modern ferruginous basin. Sci. Rep. 5 (13803), (2015).
- Koeksoy, E., Halama, M., Konhauser, K. O., Kappler, A. Using modern ferruginous habitats to interpret Precambrian banded iron formation deposition. Int. J. Astrobiol. , 1-13 (2015).
- Canfield, D. E. A new model for Proterozoic ocean chemistry. Nature. 396 (6710), 450-453 (1998).
- Wu, W. F., et al. Characterization of the physiology and cell-mineral interactions of the marine anoxygenic phototrophic Fe(II) oxidizer Rhodovulum iodosum - implications for Precambrian Fe(II) oxidation. FEMS Microbiol. Ecol. 88 (3), 503-515 (2014).
- Hungate, R. E., Macy, J. The Roll-Tube Method for Cultivation of Strict Anaerobes. Bull. Ecol. Res. Comm. 17 (1), 123-126 (1973).
- Van Baalen, C. Studies on marine blue-green algae. Bot. mar. 4 (1-2), 129-139 (1962).
- Sakamoto, T., Bryant, D. A. Growth at low temperature causes nitrogen limitation in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002. Arch. Microbiol. 169 (1), 10-19 (1998).
- Swanner, E. D., Mloszewska, A. M., Cirpka, O. A., Schoenberg, R., Konhauser, K. O., Kappler, A. Modulation of oxygen production in Archaean oceans by episodes of Fe(II) toxicity. Nature Geosci. 8 (2), 126-130 (2015).
- Stookey, L. L. Ferrozine - a New Spectrophotometric Reagent for Iron. Anal. Chem. 42 (7), 779-784 (1970).
- Fitch, M. W., Koros, W. J., Nolen, R. L., Carnes, J. R. Permeation of Several Gases through Elastomers, with Emphasis on the Deuterium Hydrogen Pair. J. Appl. Polym. Sci. 47 (6), 1033-1046 (1993).
- Smith, A. J. B., Beukes, N. J., Gutzmer, J. The Composition and Depositional Environments of Mesoarchean Iron Formations of the West Rand Group of the Witwatersrand Supergroup, South Africa. Econ. Geol. 108 (1), 111-134 (2013).
- Johnson, C. M., Beard, B. L., Klein, C., Beukes, N. J., Roden, E. E. Iron isotopes constrain biologic and abiologic processes in banded iron formation genesis. Geochim. Cosmochim. Acta. 72 (1), 151-169 (2008).
- Krepski, S. T., Emerson, D., Hredzak-Showalter, P. L., Luther, G. W., Chan, C. S. Morphology of biogenic iron oxides records microbial physiology and environmental conditions: toward interpreting iron microfossils. Geobiology. 11 (5), 457-471 (2013).
- Posth, N. R., Konhauser, K. O., Kappler, A. Microbiological processes in banded iron formation deposition. Sedimentology. 60 (7), 1733-1754 (2013).
- Maliva, R. G., Knoll, A. H., Simonson, B. M. Secular change in the Precambrian silica cycle: Insights from chert petrology. Geol. Soc. Am. Bull. 117 (7-8), 835-845 (2005).
- Kappler, A., Pasquero, C., Konhauser, K. O., Newman, D. K. Deposition of banded iron formations by anoxygenic phototrophic Fe(II)-oxidizing bacteria. Geology. 33 (11), 865-868 (2005).
- Krepski, S. T., Hanson, T. E., Chan, C. S. Isolation and characterization of a novel biomineral stalk-forming iron-oxidizing bacterium from a circumneutral groundwater seep. Environ. Microbiol. 14 (7), 1671-1680 (2012).
- Czaja, A. D., Johnson, C. M., Beard, B. L., Roden, E. E., Li, W. Q., Moorbath, S. Biological Fe oxidation controlled deposition of banded iron formation in the ca. 3770 Ma Isua Supracrustal Belt (West Greenland). Earth. Planet. Sci. Lett. 363 (1), 192-203 (2013).
- Melton, E. D., Schmidt, C., Kappler, A. Microbial iron(II) oxidation in littoral freshwater lake sediment: the potential for competition between phototrophic vs. nitrate-reducing iron(II)-oxidizers. Front. Microbiol. 3 (197), 1-12 (2012).
