Introduction
Den mänskliga övre ögonlocket utför cirka 10.000 blinkar varje dag ett, med bara 1 - 2 mm smal konjunktival region motsätter sig ögongloben. På grund av dess avtorkning rörelse under blinkning, har denna del av locket marginalen benämnts den "locktorkar" region 2. Det antas att friktions ökas i detta område under vanliga blinkande, på grund av att locket torka över hela världen. Detta kan spela en betydande roll i okulär komfort. Kontaktlinsbärare i särskild erfarenhet okulär obehag och detta är en av de främsta orsakerna till att upphöra lins bära tre. När en kontaktlins placeras på ögat, har friktionskoefficienten mellan linsmaterialet och den okulära ytan visat sig ändra fyra. Det finns bevis som tyder på att torrhetssymptom kunde relateras till denna förändrade friktion 2,5,6.
Denna förening kan också återspeglas i kliniskt observerbara fenomen, särskilt lock wiper epitheliopathy (LWE), även kallad övre ögonlocket marginal färgning (ULMS) 6. LWE är ett tidigt tecken på okulär irritation och en potentiell prediktor för torr ögonsjukdom. Det observeras och mätas med den vitala färgning av de övre och undre lock marginalregioner. Även om detta betygssystemet 2 och dess kliniska giltighet (dvs korrelation med subjektiva symtom) är fortfarande under debatt, förblir okulär obehag en gåta för kliniker och forskare både och, viktigast av allt, en olägenhet för patienterna.
To-date, är lite känt om kliniskt relevanta varianter i (under) cellulär anatomi och fysiologi av locket torkarområdet 7 och endast en rapport använder sig av cytologiska metoder 8. Impression cytologi (IC) har använts i mer än 40 år för att samla in celler från epitel ytan av bulbär eller böjd bindhinna genom tillämpning av ett membran 9,10. Vid avlägsnande, de vidhäftande cellerna genomgå cytological färgning och mikroskopisk avbildning. På grund av den anatomiska och cellulära skillnader i locket torkar regionen kräver denna teknik optimering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: Innan samla celler från människa, informerat samtycke och etik godkännande måste erhållas.
1. Förbered Stain
OBS: Förbered fläck på dagen för experimentet.
- Tillsätt 5 | il Ethidium (eller 4 ^ M) och 5 | il Calcein AM (eller 4 ^ M) till 2,5 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i 15 ml centrifugrör; blanda. Linda in i aluminiumfolie för att skydda från ljus och förvaras vid RT fram till användning.
2. Samla celler
- Avlägsna cellodlingsinsatser från sina paket och etikett för varje ögonlock som ska provtas. Mark orientering av cellsamling på den sida av membranet plasthållare med hjälp av permanent markör. Conduct spaltlampa inspektion vid måttlig förstoring (cirka 20X) för att bekräfta lämplig hälsa i regionen att genomgå IC.
- Fördela en droppe lokalbedövning (0,5% proparakain hydroklorid) i den nedre konjunktivalsäcken av each ögat och instruera deltagare att hålla ögonen stängda under en minut.
- Evert övre ögonlocket och håll på plats med ögonfransarna, undvika all kontakt med locket torkarområdet.
Valfritt: hjälp av en sekundär utredare kan krävas för att utföra det här steget. - Applicera membranet vinkelrätt mot den centrala delen av locket torkar region med minimalt tryck.
- Håll membran på plats för 3-5 sek. Observera membranet blir genomskinlig i kontaktområdet. Vid denna tidpunkt, försiktigt bort membran och tillåta deltagarens locket till "flip" tillbaka på plats.
- Omgående tillämpa en droppe PBS till provet, för att förhindra den från att torka ut. Membran blir genomskinlig och bör inte vända ogenomskinliga när som helst, eftersom det indikerar torkning. Har den sekundära utredare fortsätta omedelbart med bearbetning av prover (avsnitt 3).
- Genomför slutkontroll öga för att säkerställa integriteten i bindhinnan. Fördela okulära smörjmedel och instruera deltagareatt undvika att gnugga ögonen tills bedövande effekt avtar (ca 15 min.).
3. Provbearbetning
- Använda mikro-sax, klippa membranet i hälften (en halv för varje efterföljande analyser), vinkelrätt genom mitten av cellsamling. Skär längs den yttre marginalen av en membran halv att separera den från plasthållaren; undvika interaktion med de uppsamlade cellerna på membranet, bland annat att säkerställa att membranet inte vika på sig själv.
- Fäst membranet med en pincett innan helt lossnar från hållaren. Plats membranet in märkt 2 ml centrifugrör innehållande 500 pl 95% (volym / volym) etanol och lämna att fixa i minst 20 min till ett maximum av 2 h före bearbetning (avsnitt 4.2).
- Omedelbart separat andra halvan av membranet (som beskrivs i avsnitt 3.2) och snabbt fortsätta med avsnitt 4.1.
4. Prov Färgning
- Immunocytochemical Färgning
- Placera försiktigt membran i 35 mm glasbottnad odlingsskål med uppsamlingssidan nedåt; säkerställa membranet är platt.
- Pipettera 20 | il av immuncytokemiska betskompositionen monteras i avsnitt 1 på till membranet. Om prov lockar upp, använder engångs pipettspetsar att noggrant platta membranet genom att trycka dess kanter ner. Undvik kontakt med celluppsamlingsområden.
- täcka försiktigt membranet med täckglas. Undvik onödiga rörelser prov. Täck skålen med lock och tätning med lab-film runt kanterna. Blockera inte insyn i skålen (topp och botten) och synlighet prov. Märk med lab markör.
- Omedelbart gå vidare med avbildning (avsnitt 5.1), sedan tillbaka till avsnitt 4.2 för att fortsätta med cytologisk färgning av den andra halvan av membranet.
- cytologisk färgning
- Gradvis hydratisera membranet genom långsam tillsats av 500 | il destillerat vatten till röret used för fixering i avsnitt 3.4. Aspirera innehållet flera gånger i pipettspetsen att blanda, ta bort innehåll.
- Tillsätt 500 | il destillerat vatten. Låt stå i några sekunder, sedan bort. Tillsätt 500 pl av Alcian Blue-färgning och låt stå i 3 min. Ta bort fläckar och utföra tre på varandra följande 500 pl destillerat vatten sköljer eller tills vätskan sköljer klar.
- Tillsätt 500 l av hematoxylin # 1 fläcken och låt stå i tre minuter. Ta bort fläckar och utföra tre på varandra följande 500 pl destillerat vatten sköljningar eller tills vätskan sköljer klar. Torka (baksida avsnitt 4.2.1) genom att aspirera den klara vätskan.
- Tillsätt 500 l av Papanicolaou OG-6 fläcken och låt stå i tre minuter. Ta bort fläckar och utföra en 500 pl 95% (v / v) etanol skölj.
- Tillsätt 500 l av Papanicolaou EA-65 fläcken och låt stå i tre minuter. Avlägsna fläcken och utföra tre på varandra följande 500 | j, l 95% (volym / volym) etanol sköljningar.
- Helt torka med hjälp av tre på varandra följande 500 mikroliter 100% etanol sköljningar. med användning av TWEezers, ta bort prov från lösning; undvika att röra celluppsamlingsområden.
- Placera membranet på glasskiva; se till att celluppsamlingsledningen är antingen parallellt eller vinkelrätt mot glida marginal för enklare inriktning under avbildning.
- Applicera en droppe 100% etanol och täck med glas halka. Omedelbart gå vidare med avbildning (avsnitt 5.2).
5. Prov Imaging
- Avbildnings Fluorescerande Immunocytokemiska Stains
- Använd en konfokala laserskanning mikroskop (CLSM) 11 eller fluorescensmikroskop 12, utrustad med en digital färgkamera, som är ansluten till en dator som kör en bild förvärv programvara. På grund av de prover som innesluten i odlingsskålar, kan ett inverterat mikroskop vara nödvändig.
- Inrättat mikroskop 11,12 enligt absorption och emissionsspektra hos etidium homodimer-1 (528/617 nm Ex / Em maxima i närvaro av DNA) och kalcein AM (494/517 nm Ex / Em maxima).
- Välj mikroskop lägsta förstoring (t.ex. 2.5x mål) och aktivera den digitala bildsystem; observera provet som visas på datorskärmen.
- Inspektera provet för cellulära funktioner av intresse.
- Välj önskad mikroskop förstoring och få bilder med hjälp av bildbehandlingsprogram.
- Spara filer i antingen nativt mikroskop filformat eller ett okomprimerat filformat (t.ex. * .raw, * .tiff).
- Imaging Cytologisk Stains
- Använd en vanlig laboratorie ljus-fält mikroskop utan filter, utrustad med en digital färgkamera, som är ansluten till en dator som kör en bild förvärv programvara.
- Plats och lås glasskiva (från steg 4.2.8) på mikroskop scenen. Rehydrera provet med 100% etanol efter behov, genom hela avbildningsproceduren.
- Välj mikroskop lägsta förstoring (t.ex. 2.5x mål) och aktivera the digitala bildsystem; observera provet som visas på datorskärmen.
- Säkerställa cellsamling är i linje med antingen X eller Y-axeln av mikroskop scenen kontroll. Justera om det behövs, genom att ta bort locket glida och rotera provet med en pipettspets eller pincett.
- Med hjälp av bildprogram, fånga bilden (s) av hela provet med den lägsta mikroskop förstoringen.
- Växla till måttlig mikroskop förstoring (t.ex. 10 - 20X objektiv) och justera mikroskop ljuskälla och programvara avbildningsparametrar (exponering, kontrast, vitbalans, etc.), och inaktivera deras automatiserade program mätning. Spara dessa inställningar för framtida bruk.
- Bestämma start- och slutpunkter för skanning (t.ex. övre vänstra och nedre högra hörn cellsamling).
- Med hjälp av bildprogram, fånga bilden (s) i hela celluppsamlingsområdet inom start- och slutpunkt. Säkerställa en 20% från sida till sida och uppifrån och ned överlappning between alla angränsande bilder.
- Spara filer med hjälp av den inbyggda mikroskop filformatet eller ett okomprimerat filformat (t.ex. * .raw, * .tiff).
- Generera slutliga panoramabild med hjälp av automatiserad sömmar programvara val (t.ex. Adobe Photoshop Elements). Använd referensbilder tagna vid steg 5.2.5) för att bekräfta riktigheten i den automatiska sömmar i den slutliga bilden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cellodlingsmembranet sträckte sig över plasthållaren är ett praktiskt verktyg för handhållna samling av epitelceller från locket torkarbindhinna. Denna metod eliminerar behovet av ytterligare steriliserade instrument som typiskt används för att förbereda och hantera IC membran. Figur 1 visar den IC av locket torkarområdet med hjälp av en cellodlingsinsats. Vi optimerat två olika färgningsprotokoll som kompletterar varandra för att karakterisera epitelceller från locket torkarområdet på ett nytt sätt. Fluorescerande immuncytokemiska färgämnen avslöjar esterasaktivitet, en indikator på cellviabilitet, och nukleinsyror, färgningen av som återspeglar cellmembranet kompromiss, såsom visas i figur 2. Den cytologiska färgningsprotokollet tillåter en fin åtskillnad mellan keratinisering grader. Figur 3 visar övergången mellan låg keratinisering i böjd bindhinnan och avancerad keratinsering i locket torkarbind och epidermis. Panorama avbildning av cytologi-färgade cellsamlingar medger analys av hela uppsamlingsområdet, i motsats till ett valt område av intresse. Bildupplösningen är tillräckligt för att zooma kärn nivå; cellmorfologin kan bestämmas med precision. Figur 4 visar den slutliga bilden av en cytologiskt färgade cellsamling, sytt ihop med ca. 100 separata högupplösta filer. Dessa verktyg kan användas för att utvärdera effekterna av friktion och / eller torrt öga på ett nytt sätt.
Figur 1. Impression cytologi av locket torkar området. Impression cytologi som utförs på locket torkarområdet exponeras genom eversion av det övre ögonlocket. Membran som används är Cell Culture Insert, 12 mm, hydrofila PTFE. Observera flikarna på membranhållaren, som kan bibehållas (till skillnad från pregare studier på bulbarkonjunktiva, där de togs bort före applicering) eftersom de inte stör tillämpningen av membranet på den smala ögonlockskanten och kan faktiskt hjälpa inriktning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Fluorescerande Celler från locket Torkar Region. Konfokal laserscanningsmikroskopi visar variationen av cellmorfologi mellan stora skvamösa celler (A) och de mindre kolumnära / kubformig celler (b). Grön fluorescens av kalcein AM indikerar esterasaktivitet i cellkroppen (dvs cellviabilitet). Röd fluorescens av Ethidium avslöjar nukleinsyror, vilket tyder på cellmembranet kompromiss. Få celler visar intensivt grön och ingen röd fluorescens, eventuellt i dicative av cellmembranintegritet (c). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Cytologisk Färgning av IC prov. Celler av locktorkar regionen visar varierande morfologi och olika keratinisering grader. Blå färg av små, kolonn och kuboidala celler med stora kärnor, som finns i marginal / böjd bindhinnan, indikerar ingen keratinisering (a); röd / orange fläck av stora skiv celler med kondenserade kärnor av muko-kutan korsning (MCJ / Marx 'Line) och anuclear celler i överhuden representerar avancerad keratinisering (c). Övergångs färg (röd / blå) och morfologi av celler i locket torkar konjunktival område föreslår begränsad keratinisering (b).g3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. komposit avbildar av lock Torkar Cell Collection. Impression cytologi av locket torkarområdet efter cytologisk färgning. Bild sys ihop med ca. 100 enskilda bilder tagna med ett mikroskop och 20X mål. (A) Små columnar / kuboidala epitelceller i tarsala / marginell konjunktiva. Celler här uppvisar blå / grön / lila färg indikerar ingen keratinisering; (B) celler hos locket torkarbindhinnan, övergångs i morfologi och bets färg mellan regioner (a) och (c); (C) stora skivepitelceller av muko-kutan korsning / Marx linje. Apelsin fläck färg indikerar en viss grad av keratinisering, och röd / rosa indikerar sent stadium skivepitelcancer övergång; (D) Meibum intryck; (E) anuclear, kornifierade cellerna i överhuden; (F) Goblet cell intryck eller tårfilmen muciner. Nedåtpilen visar böjd konjunktival område, uppåt pil indikerar yttre locket. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Impression cytologi utförs typiskt på bulbarkonjunktiva, med hjälp av blandad cellulosaester membran. Prover skärs till storlek från bulkmaterialarken, steriliseras, anbringas och avlägsnas från den konjunktivala ytan med hjälp av pincett. Med användning av samma membranmaterial, var en kolv styrd IC-anordning nyligen utformade för att passa ytan geometri bulbarkonjunktiva och upprätthålla konstant tryck mellan program 13. Dessa metoder är ineffektiva för den smala, tydligt böjda lock torkar region (se Figur 1). Dessutom behöver blandad cellulosaester membran inte ge den nödvändiga öppenheten för konfigurationer där ljusfältsmikroskopi är nödvändigt att anpassa prover före fluorescerande avbildning. Cellodlingsinsatser föreslås i detta protokoll är praktiskt eftersom de är steriliserade, helst storlek och kan hanteras manuellt, utan ytterligare utrustning, vilket garanterar snabba samlingar. Membranen är gjorda avhydrofila PTFE, som ger tillräcklig insyn konfokalmikroskopi analys.
Sammantaget morfologiska egenskaper hos uppsamlade cellerna sammanfaller med tidigare litteraturrapporter 7,8,14,15. Byte av vanligt förekommande (och kromatiskt mycket intensiv) perjodsyra Schiff (PAS) färgning med Alcian blue möjliggör efterföljande Papanicolaou färgämnen för att visa finare kromatisk variation, vilket möjliggör en mer detaljerad perspektiv på cell keratinisering nivå, än vad som rapporterats tidigare 7,8.
Mikroskopisk avbildning av cytologiska prover innebär vanligtvis visuell inspektion genom okularen och hög förstoring fotografi av strukturer som anses "av intresse". Med denna metod kan "större bild" aspekter av hela samlingen förloras. Låg förstoring skott är vanligtvis av sämre optisk kvalitet (på grund av vinjettering, avvikelser, etc.) och upplösningen är otillräcklig för att skildra cellulära detaljers. Panorama sömmar protokoll här, medan något mer tidskrävande, är fördelaktigt, eftersom det ger en översikt av hela membranet, liksom förmågan att zooma in till kärn detalj, allt i en bild. Kvantitativa variabler som till exempel cellräkning, kan kärn cytoplasma (NC) förhållandet 16 och avstånden beräknas här.
Det finns tre viktiga steg i det protokoll som kräver särskild uppmärksamhet: en korrekt tillämpning av membranet på bindhinnan (avsnitt 2.4), tiden mellan prov processteg (avsnitt 2.6 och 3 till 5) och konsekventa imaging parametrar för optimal panorama stygn (avsnitt 5.2 0,6 - 5.2.8). Till skillnad från den relativt flacka bulbarkonjunktiva, locket torkar regionen har en uttalad krökning, som spänner över en smal bredd på endast 1-2 mm mellan epidermis och böjd sulcus. Det är väsentligt att membranet anbringas i rätt vinkel, eftersom detta kan kraftigt påverka den typ av celler som samlats in. För det andra, membrane trycket borde vara konsekvent mellan applikationer. Utredaren ska därför utveckla nödvändig skicklighet för att säkerställa repeterbara samlingar. När proverna samlas in med hjälp intrycket cytologi tekniken blir tidpunkten för behandlingen avgörande. Prover bör aldrig tillåtas att torka ut, det vill säga membranet bör inte bli opaka (avsnitt 2.6, 3 till 5). Medan provet genomgå cytologisk färgning kan lämnas i fixativ under en längre tid (20 min - 2 h), bör immunocytokemiska fläckar sättas och avbildas utan dröjsmål, för att bedöma cellviabilitet så exakt som möjligt. Konsekvens av timing är också viktigt för jämförbara resultat mellan prover; en bör sträva efter att hålla fäst och färgnings gånger lika för alla prover som skall jämföras. Slutligen, för att få kvalitativa panoramabilder av cytologi provet alla avbildningsparametrar (mikroskop ljusintensitet, kamera exponering, kontrast, vitbalans, etc.)bör kalibreras till ett representativt område av provet med den högsta mångfald av funktioner av intresse (dvs celltyper), och alla automatiserade mätning inaktiveras för efterföljande skott (avsnitt 5.2.6). Utredaren ska också sträva efter att orientera insamling cellen i linje med antingen X eller Y-axeln av mikroskop scenen. Detta kommer att underlätta bildtagning och sömnad process. Sikta på att hitta och använda särdrag på provet (t.ex. cell lappar, meibum, skräp, etc.) i de överlappande områdena mellan intilliggande bilder. Mikroskopet Fokus bör vara den enda justering som ska korrigeras mellan skotten.
Begränsningen av denna teknik ligger i variationen av cellsamlingar, som ursprungligen observerats av Jalbert 8, som rapporterade en 67% framgång i att erhålla sammanflytande fläckar av lock torkar celler. Ansökan vinkel bestämmer antalet och typen av celler som samlats in. I detta skede är det osäkert whether samling kvalitet (dvs antalet celler på provet) är korrelerad med okulär hälsa. Kliniska prövningar med större provstorlekar är nödvändiga för att bevisa giltigheten av denna teknik. En ytterligare nackdel ligger i den inneboende invasions av IC-tekniken i sig. De överlägsna cellskikt är kraftfullt bort från bindhinnan och detta kan orsaka skada. Medan immunocytokemiska fläckar är avsedda att spegla cellviabilitet (och esterasaktivitet finns i alla samlingar), är det oklart vad den röda fluorescens av cellkärnor i våra samlingar visar. Ibland, meibum (dvs lipider utsöndrade på lockets marginal) och andra komponenter från den okulära ytan eller tårfilm kommer att tendera att täcka cellulära funktioner och göra analys svår eller omöjlig. Protokollet kan ändras med en extra sköljning i Xylen att avlägsna meibum lipider. Slutligen är effekten av anestesi droppar på konjunktivala celler okänd.
Erhålla data i cellstrukturen hos locktorkarområdet kommer att hjälpa kontrollera sambandet mellan friktionen som uppstår mellan dessa celler och den okulära ytan, och subjektivt komfort. Detta kommer att ge värdefull kunskap och möjliggöra framtida kliniska prövningar för att utforska de cellulära särdragen hos kontaktlinsbärare, patienter med lock torkar epitheliopathy, torra ögon eller torrhet symptom, till skillnad från asymptomatiska försökspersoner, förhoppningsvis belysa ämnet okulära obehag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue, 1% in 3% Acetic Acid | Sigma | B8438-250ML | |
| Hematoxylin, Gill 1 | Sigma | GHS116-500ML | |
| Papanicolaou stain, OG-6 | Sigma | HT40116-500 ml | |
| Papanicolaou stain, Modified EA | Sigma | HT40232-1L | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies | L-3224 | contains ethidium homodimer-1 and Calcein AM dyes |
| Alcaine (0.5% proparacaine hydrochloride) | Alcon | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | EMD Millipore | PICM01250 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
References
- Barbato, G., et al. Diurnal variation in spontaneous eye-blink rate. Psychiatry Res. 93, 145-151 (2000).
- Korb, D. R., et al. Lid-Wiper Epitheliopathy and Dry-Eye Symptoms in Contact Lens Wearers. Eye & Contact Lens. 28, 211-216 (2002).
- Dumbleton, K., Woods, C. A., Jones, L. W., Fonn, D. The impact of contemporary contact lenses on contact lens discontinuation. Eye & Contact Lens. 39, 93-99 (2013).
- Roba, M., Duncan, E., Hill, G., Spencer, N., Tosatti, S. Friction measurements on contact lenses in their operating environment. Tribol Lett. 44, 387-397 (2011).
- Sickenberger, W., Pult, H., Sickenberger, B. LIPCOF and contact lens wearers: a new tool to forecast subjective dryness and degree of comfort of contact lens wearers. Contactologia. 22, 74-79 (2000).
- Pult, H., Purslow, C., Berry, M., Murphy, P. J. Clinical tests for successful contact lens wear: relationship and predictive potential. Optom Vis Sci. 85, E924-E929 (2008).
- Doughty, M. J. Morphological features of cells along Marx's line of the marginal conjunctiva of the human eyelid. Clin Exp Optom. 96, 76-84 (2013).
- Jalbert, I., et al. Assessing the human lid margin epithelium using impression cytology. Acta Ophthalm. 90, e547-e552 (2012).
- Nelson, J. D. Impression cytology. Cornea. 7, 71-81 (1988).
- Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. A simple conjunctival biopsy. Am J Ophthalmol. 84, 798-801 (1977).
- Wilson, T. Confocal microscopy. , Academic Press. London. 1-64 (1990).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Tomlins, P., Roy, P., Curnow, J., Rauz, S. Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival Impression for Flow Cytometry. Invest Ophthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).
- Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Res Proj Dry Eye Syn. 45, 108-122 (2010).
- Knop, E., et al. The lid wiper and muco-cutaneous junction anatomy of the human eyelid margins: an in vivo confocal and histological study. J Anat. 218, 449-461 (2011).
- Christensen, J. A., Skaarland, E. Nuclear and cell area measurements in the cytological evaluation of pleural effusions: a study of subjective assessments and morphometric measurements. Diag Cytopathol. 3, 50-54 (1987).
