Summary
Dette manuskriptet tilveiebringer en teknisk fremgangsmåte som kan brukes til å karakterisere C1498 cellekulturer in vitro og akutt leukemi indusert i mus etter deres injeksjon. Fenotypiske og funksjonelle analysene er utført ved hjelp av flowcytometri, immunfluorescens mikroskopi, cytochemistry og May-Grünwald Giemsa farging.
Abstract
Den intravenøse injeksjon av C1498-celler inn i syngeniske eller congenic mus har blitt utført siden 1941. Disse injeksjoner resultere i utvikling av akutt leukemi. Imidlertid er naturen av denne sykdommen har ikke vært godt dokumentert i litteraturen. Her gir vi en teknisk protokoll for å karakterisere C1498-celler in vitro og for å bestemme arten av den induserte leukemi in vivo. Den første delen av denne prosedyren er fokusert på å bestemme blodkreft avstamning og stadium av differensiering av dyrket C1498 celler. For å oppnå dette blir multi-parametriske strømningscytometrisk farging anvendes for å detektere hematopoetiske cellemarkører. Immunfluorescens-mikroskopi, cytochemistry og en May-Grünwald Giemsa-farging blir deretter utført for å vurdere ekspresjonen av myeloperoxydase, aktiviteten av esteraser og cellulær morfologi, respektivt. Den andre delen av denne protokollen er dedikert til å beskrive den leukemi sykdom som er indusert ivivo. Det sistnevnte kan oppnås ved å bestemme frekvensene for leukemiske og iboende celler i blodet, hematopoietiske organer (for eksempel, benmarg og milt) og ikke-lymfoid vev (for eksempel lever og lunger) ved hjelp av spesifikk farging og flowcytometri analyser. Naturen av leukemi er deretter bekreftet ved hjelp av May-Grünwald Giemsa farging og farging for spesifikke esterase i benmargen. Her presenterer vi resultatene som ble oppnådd ved bruk av denne protokollen i alderstilpassede C1498- og PBS-injiserte mus.
Introduction
Akutt myeloid leukemi (AML) er karakterisert ved ukontrollert spredning av hematopoetiske myeloide celler som er blokkert ved forskjellige stadier av modning. Denne feilregulering kan påvirke granulocystisk, monocytic, erythrocytisk eller megaryocytic differensierings trasé 1. AML-celler samler seg i benmargen, som fører til svekket hematopoiesis, noe som resulterer i trombopeni, lymfopeni og anemi. De leukemiske celler også invadere blod og ikke-lymfoide organer.
Den C1498 musemodell har vært brukt i flere tiår som en modell for akutt leukemi siden kreftceller ble isolert fra en leukemisk 10-måneder gamle C57BL / 6 (H-2b) hunnmus i 1941. Litteraturen beskriver invasjon i blodet , blodkreft organer (f.eks, milt og lymfeknuter) og ikke-hematopoietiske organer (for eksempel leveren, lungene, eggstokker og nyrer) ved høyt proliferative C1498 celler etter at de ble injisert via en innetravenous, subkutan eller intra-peritoneal rute inn mottakelige mus 2-4. Men denne musen modellen ble rapportert å indusere enten granulocytic 2,5 eller myelomonocytic 6 leukemi. Mer nylig en studie publisert i 2002 beskrev denne typen kreft som murine NKT celle leukemi 7. Således skiller litteraturen vedrørende arten av denne cellelinje C1498 og den tilhørende leukemi det induserer i mus. Disse avvikene er hovedsakelig på grunn av mangel på detaljert og oppdatert publisert informasjon om celler og leukemi sykdommen generelt, fordi mange studier ble utført i 1950 - 70-tallet.
Her har vi gi en detaljert protokoll for å beskrive hvordan å karakterisere C1498-celler og analysere arten av den leukemiske sykdom som er indusert ved sin intravenøs injeksjon i mus. Den første delen av denne protokollen er dedikert til en beskrivelse av C1498 celler som har blitt dyrket in vitro. fluorescent antilegemer rettet mot overflaten og intracellulære hematopoietiske markører ble anvendt for å bestemme deres fenotype ved hjelp av flow cytometri. Tilstedeværelsen av myeloperoxidase ble vurdert ved hjelp av immunfluorescens mikroskopi, ble deres blodkreft avstamning og differensiering scenen evaluert med cytochemistry å vurdere aktiviteten av esteraser, og May-Grünwald Giemsa farging ble utført. De C1498-celler ble deretter injisert i mus, og den akutt leukemi sykdommen som ble indusert, er beskrevet i den andre delen av dette manuskriptet. De samme teknikker ble anvendt for å bestemme frekvensene og de fenotyper av leukemiske og iboende celler i benmarg, perifert blod, milt og ikke-hematopoietiske organer (lever og lunger).
Denne protokollen er svært reproduserbare, og de data som presenteres her vil hjelpe forskere til å vurdere virkningene av nye terapeutiske strategier. Denne leukemi musemodell har allerede blitt brukt til å teste en immunterapi nærmer segnd ulike kreftcellegifter 8,9. Deres effekt ble evaluert ved å bestemme utviklingen av tumorbelastning og overlevelse. Denne protokollen kan brukes til å gi ytterligere informasjon om fordeling og livsopphold av leukemiske og andre blodkreft cellepopulasjoner under behandlingen.
Protocol
Animal boliger og alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av den lokale Animal Care Etisk Komité, CEEA.NPDC (avtale no.512012), og alle forsøk ble utført i samsvar med de franske og europeiske retningslinjer for omsorg og bruk av forsøksdyr.
1. In vitro karakterisering av den cellelinje C1498
- In vitro-kultur av C1498-celler
- Forbered komplett RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640-medium med tilsetning av 50 ml føtalt bovint serum (FBS), 5 ml av penicillin (100 U / ml) -streptomycin (100 ug / ml), 500 pl av 50 mM β-merkaptoetanol , 5 ml N-2-hydroksyetylpiperazin-N-2-etansulfonsyre (HEPES), 5 ml, ikke-essensielle aminosyrer og 5 ml natriumpyruviat til 500 ml med RPMI medium.
- Grow C1498 cellelinje i fullstendig RPMI. Høste cellene i suspensjon ved pipettering, og overføre cellene til en 50 ml tube. Sentrifuger ved 350 xg i 10 minutter, og fjern supernatant.
- Tilsett 20 ml fosfat-bufret saltvann (PBS) (1x) løsning, sentrifuger ved 350 xg i 10 min, og fjern supernatanten.
- Resuspender cellene i 10 ml av fluorescens-aktivert cellesorterer (FACS) buffer (2,5 g bovint serumalbumin (BSA) pulver og 2 ml 0,5 M etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) oppløsning i 500 ml PBS-oppløsning). Tell cellene ved hjelp av en celle Thoma tellekammer etter farging av cellene med trypan blå.
- Fenotypisk karakterisering av C1498 cellelinje ved hjelp av farging og flowcytometri analyse
- Celleoverflaten farging
- Forbered FACS buffer.
- Juster de høstede cellene i FACS-buffer til 10 7 celler / ml og dispenser 10 6-celler (100 ul) for hvert eksperiment farging inn i flowcytometri rør.
- Merke cellene med 100 ul av de følgende antistoffer eller deres tilknyttede isotype kontroller fortynnet i FACS-buffer:
- for markers av forløper og differensierte celler, merke cellene med anti-CD11b / anti-CD18 (1), anti-Ly-6G (1), anti-CD19, anti-B220 (2), anti-NK1.1, anti- CD49b, anti-CD4 (1), anti-CD8 (2), anti-CD3 (3), anti-CD21 / 35, anti-CD115 og anti-TCRVβ antistoffer.
- For hematopoetiske stilk / stamceller markører, bruker en kombinasjon av anti-CD34 / anti-CD117 / anti-Sca-1, anti-CD150 / anti-CD117 / anti-Sca-1, anti-CD117 / anti-CD127 eller anti- CD16 / 32-biotin antistoffer alene.
- For markører for cellefunksjoner (f.eks vedheft, antigen presentasjon, co-stimulerende molekyler og reseptorer), flekker cellene med anti-CD18 (2) / anti-CD11, anti-MHC klasse I, anti-MHC klasse II, anti- CD31, anti-CD44, anti-CD80-biotin, anti-CD86 og anti-CD274 antistoff.
- Inkuber alle av flowcytometri rørene ved 4 ° C i 30 minutter.
- Vask cellene to ganger ved tilsetning av 2 ml FACS-buffer til hvert rør, sentrifuger ved 350 xg i 5 minutter og fjerne supernatanten. Tilsett 100 ul FACS-buffer til hvert rør og videre til sekundærfarging ved å tilsette 100 ul fluorescerende streptavidin (1/100 i FACS-buffer til en endelig fortynning på 1/200) til det biotinylerte-konjugerte antistoffer. Inkuber rørene ved 4 ° C i 30 minutter.
- Vask cellene to ganger som følger: tilsett 2 ml FACS-buffer til hvert rør, sentrifugeres rørene ved 350 xg i 5 minutter og fjerne supernatanten ved pipettering.
- Resuspender cellene i 500 ul kald PBS og plassere cellene på is, holde dem i mørket ved hjelp av aluminiumsfolie for å dekke rørene. Analyser resultater ved hjelp av en cytometer 10.
- intracellulær farging
- Forbered fiksering buffer ved tilsetning av 125 ml av en 4% paraformaldehyd (PFA) oppløsning til 375 ml PBS-oppløsning.
MERK: For å forberede 500 ml 4% PFA, varme 400 ml PBS løsning til ca 60 ° C på et rør plate i en ventilert hette. Tilsett 20 g av PFA-pulver, og heve pHtil PFA er oppløst. La løsningen avkjøles, justere pH til 6,9, og gjøre opp volumet til 500 ml med PBS. - Klargjør permeabilizing buffer ved tilsetning av 0,5 g saponin og 0,5 g BSA til 500 ml PBS-oppløsning.
- Juster de høstede cellene i FACS-buffer til 10 7 celler / ml og fordele 10 6 av de celler (100 ul) for hver farge eksperiment inn i flowcytometri rør. Sentrifuger cellene ved 350 xg i 5 minutter og fjerne supernatanten.
- Fiksere cellene i 200 pl 1% PFA-løsning og inkuberes i 10 min ved 4 ° C.
- Tilsett 2 ml permeabilizing buffer til hvert rør, sentrifugeres rørene ved 350 xg i 5 minutter og fjerne supernatanten ved pipettering. Tilsett 100 permeabilizing buffer til hvert rør.
- Merke cellene med 100 ul av de følgende antistoffer eller deres tilsvarende isotype kontrollene etter fortynning dem i permeabilizing buffer: anti-CD3 (2) / anti-CD8 (1), anti-CD3 (3) / aNTI-CD4 (2), anti-CD107b og anti-CD3 (3) / anti-TCRVβ.
- Inkuber cellene ved 4 ° C i 30 minutter.
- Vask cellene to ganger ved tilsetning av 2 ml permeabilizing buffer til hvert rør. Sentrifuger rørene ved 350 xg i 5 minutter og fjerne supernatanten.
- Tilsett 100 permeabilizing buffer til cellene. Fortsett til sekundær flekker ved å legge 100 mL av fluorescerende streptavidin fortynnet i permeabilizing buffer til biotinylert-konjugerte antistoffer. Inkuber rørene ved 4 ° C i 30 minutter.
- Tilsett 2 ml permeabilizing buffer til hvert rør, sentrifugere rørene ved 350 xg i 5 minutter og fjerne supernatanten. Gjenta dette trinnet en gang til.
- Suspender cellene i 500 ul kald PBS, og deretter plassere cellene på is i mørket. Analyser resultatene med et flowcytometer 10.
- Forbered fiksering buffer ved tilsetning av 125 ml av en 4% paraformaldehyd (PFA) oppløsning til 375 ml PBS-oppløsning.
- Celleoverflaten farging
- Utarbeidelse av en cellesuspensjon på lysbilder for mikroskopi
- Vask 10 6 av hårvested C1498-celler (oppnådd i trinn 1.1.4) med 5 ml kald FACS-buffer to ganger, og fortynn cellene i 1 ml kald FACS-buffer. Plasser rørene på is.
- Plasser glir inn engangs kamre med pre-festet filterkort og plassere disse i en cytosentrifuge.
- Tilsett 100 ul FACS-buffer til hvert kammer og filter-kort, og spinne dem i 2 min ved 4,52 x g.
- Tilsett 100 ul av celler til hvert kammer og filter-kort, og spinne cellene ved 4,52 xg i 2 min.
- Fjern forsiktig lysbilder fra kamrene og luft-tørke lysbildene før farging dem med myeloperoksidase (trinn 1.4), esteraser (trinn 1.5) eller May-Grünwald Giemsa (trinn 1.6).
- Myeloperoxidase farging for immunfluorescens
- Fiksere cellene på lysbildene ved å dyppe objektglassene i en kald metanol: aceton (1: 1) oppløsning i 2 minutter, og deretter luft-tørket skinnene.
- For å begrense den væske som befinner seg i glide som inneholder cellene, tegne en cisirkel med rundt cellene ved hjelp av en vannavvisende penn.
- Rens cellene i 200 ul kald PBS-løsning i 10 min.
- Blokkere celler i 200 ul 3% BSA / PBS-buffer inneholdende 10 ul av normal esel serum og 10 ug / ml av renset anti-CD16 / 32 antistoffer.
- Anvende 200 ul av anti-mus myeloperoksidase (fortynnet til 20 ug / ml i 3% BSA / PBS-buffer). Inkuber cellene O / N ved 4 ° C i et fuktighetskammer.
- Vask cellene med 200 ul kald 0,1% BSA / PBS.
- Påfør 200 mL av anti-geit IgG antistoffer utvannet 1/250 i 3% BSA / PBS buffer. Cellene inkuberes i 2 timer ved romtemperatur i et fuktighetskammer.
- Vask cellene 3 ganger med 200 ul 0,1% BSA / PBS-buffer og to ganger i kald PBS.
- Flekk cellekjerner med 200 ul Hoechst fortynnet til 1 / 1.000 i PBS (til en endelig konsentrasjon på 1 pg / ml) i 2 min ved RT.
- Vask lysbildene med vann og la dem lufttørke før mounting. Påfør en dråpe monteringsmedium 1 til cellene, plassere en kant av en dekkglass på lysbildet, og senk den ned cellene ved hjelp av tang. Trykk forsiktig på dekkglass for å fjerne eventuelle luftbobler.
- esterase cytochemistry
Merk: Pre-varme alle reagenser til RT.- Fixative forberedelse
- For å fremstille Citrat-aceton-formaldehyd (CAF) løsning, tilsett 2,5 ml citrat-oppløsning, 6,5 ml aceton og 0,8 ml 37% formaldehyd til en glassflaske. Bland forsiktig og oppbevar ved 4 ° C.
- Naftol AS-D kloracetat esterase (CAE) aktivitetsanalyse
- Varmt avionisert vann til 37 ° C.
- I et 50 ml rør, tilsett 1 ml av natriumnitritt-løsning til 1 ml av fargestoff oppløsning. Bland forsiktig og la stå i 2 min. Legg 40 ml forvarmet deionisert vann, 5 ml pH 6,3 buffer konsentrat og 1 ml Naphthol AS-D-kloracetat løsning. Bland og overføre til en Coplin krukke.
- Fest cellene ut motlysbilder (se avsnitt 1.3) i 30 sek med CAF-løsning (se trinn 1.5.1.1), og vask lysbildene i 45 sek med avionisert vann.
- Overfør glir inn i løsningen som ble fremstilt i trinn 1.5.2.2, og inkuber objektglassene ved 37 ° C i 30 minutter i et fuktighetskammer som er beskyttet mot lys.
- Tørk lysbilder og skyll dem via nedsenking i avionisert vann i 2 min.
- Counterstain cellene ved å tilsette noen få dråper av Hematoxylin-løsning og inkubere dem i 1 min.
- Vask lysbildene med nøytral vann (pH 7) og la dem lufttørke. Påfør en dråpe monteringsmedium 2 til cellene, plassere en kant av en dekkglass på lysbildet og senk den ned cellene ved hjelp av tang. Trykk forsiktig på dekkglass for å fjerne eventuelle luftbobler.
- Alpha-Naphthyl butyrate esterase (NBE) aktivitetsanalyse
- Varm α-naftyl-butyrat løsning til 37 ° C før bruk.
- Fortynn en tablett av natrium nitrite i 6,25 ml deionisert vann.
- I et 50 ml rør, tilsett 1,5 ml av en natriumnitritt tablett oppløsning og 1,5 ml av en løsning pararosanilin. Bland forsiktig og la løsningen stå i 5 minutter. Supplere oppløsningen med 40 ml fosfat-bufret oppløsning. Bring til pH 6 ved forsiktig tilsetning av 10 N NaOH dråpevis. Tilsett 5 ml av α-naftyl- butyrat-oppløsning, blande den hele løsningen, og overføre den til en Coplin krukke.
- Fest cellene på lysbildene i 10 sek ved hjelp av CAF løsningen på RT og skyll i 45 sek med avionisert vann.
- Overføring glir inn i Coplin krukke inneholdende den løsningen som ble fremstilt i trinn 1.5.3.2 og inkuberes sammen i 1 time ved 37 ° C i et fuktighetskammer under beskyttelse mot lys.
- Skyll lysbildene i 2 min i nøytral vann (pH 7) og lufttørke.
- Counterstain cellene med metylen blå løsning ved å legge noen dråper på lysbildet og inkuberes i 4 min.
- Fordype lysbildene i deioinnregnet vann i 2 min og la dem lufttørke. For å montere lysbildene, påfør en dråpe monteringsmedium 2 til cellene, plasserer den ene kanten av dekkglass på lysbildet, og senk den ned cellene ved hjelp av tang. Trykk forsiktig på dekkglass for å fjerne eventuelle luftbobler.
- Fixative forberedelse
- May-Grünwald Giemsa (MGG) farging
- Flekk cellene (utarbeidet i avsnitt 1.3) ved å dyppe lysbildene i en Coplin krukke inneholder May-Grünwald løsning for 3 min.
- Overfør de glir inn i en Coplin krukke inneholdende pH 6,8 bufferløsning i 1 min.
- Flekk lysbildene ved å plassere dem i en Coplin krukke inneholdende Giemsa R løsningen (fortynnet til 1/20 i pH 6,8 bufferløsning) i 10 minutter. Vask objektglassene med nøytralt vann (pH 7) i 10 sek.
- Hell av vannet og luft-tørke lysbildene. Monter lysbildene ved å bruke en dråpe monteringsmedium 2 på cellene. Plasser den ene kanten av dekkglass på lysbildet og senk den påtil cellene ved hjelp av tang. Trykk forsiktig på dekkglass for å fjerne eventuelle luftbobler.
2. In vivo Utvikling og karakterisering av akutt leukemi
MERK: Fire ukers gamle kvinnelige congenic C57BL / 6J-Ly5.1 mus ble opprettholdt under patogenfrie forhold (dvs. i et sterilt miljø). Musene ble injisert da de var mellom 5 og 6 uker gamle.
- Intravenøs injeksjon med C1498 celler
- Høste dyrkede C1498 celler i suspensjon ved pipettering. Overfør cellene til et 50 ml rør og sentrifuger ved 350 xg i 10 min. Vask cellene i 10 ml kald PBS to ganger, og fremstille en cellesuspensjon av 10 7 celler / ml i PBS. Plasser mobil suspensjon på is før du utfører injeksjonen.
- Plasser musen i en rainer og utføre injeksjonen under sterile forhold i en laminær hette.
- Bruke en 29g nål med en sprøyte til å injisere cellene inn ihalevenen. Ta tak i halen ved den distale ende, og desinfisere det med et gasbind svamp dyppet i 70% etanol. Sjekk for å være sikker på at det ikke er luftbobler i sprøyten, og deretter sakte injisere 100 mL av C1498 cellesuspensjonen (10 6 celler) i halevenen.
- Etter injeksjonen, fjernes kanylen fra halen, og kontrollere blødninger ved å legge press med en steril kompress svamp på injeksjonsstedet. Gå tilbake dyret til buret sitt, og nøye sjekke helsen sin i løpet av de neste timene og dagene.
- Retro orbital blodprøvetaking
- Overvåk oppførselen til PBS og C1498-injisert mus for tegn på leukemi sykdom (f.eks piloereksjon, isolert fra gruppen, og redusert eller ingen bevegelser i bur).
MERK: Dette skjer vanligvis mellom 17 til 19 dager etter at cellene blir injisert. - Utfør retro orbital blod samling like før eutanasi (se trinn 2.2.7) under sterile forhold i en laminærhette og under en varmelampe for å hindre nedkjøling.
- For anestesi, bruk ketamin ved 150 mg / kg og xylazin 10 mg / kg. Klargjør bedøvelse løsningen ved fortynning av 1,5 ml av ketamin og xylazin 0,5 ml i 18 ml PBS-oppløsning.
- Bedøve kontroll og leukemiske mus. Fortsette med en intraperitoneal injeksjon av 200 ul av anestesi oppløsning pr 10 g av mus ved anvendelse av en 26G nål og en 1 ml sprøyte. Se etter tapet av pedalen refleks for å bekrefte anestesi.
- Sette inn et kapillarrør i mediale canthus av øyet. Blod vil stige fra den orbitale sinus inn i kapillarrøret. Kontrollere blødningen ved å forsiktig legge press på øyet med en steril kompress svamp.
Merk: Et volum på 100 til 200 ul blod kan samles ved hjelp av denne teknikken. - Samle opp blod inn i et EDTA-rør, og lagre prøven på is før isolering av de mononukleære celler.
- Avlive mus ved hjelp av halshugging, ogfortsette å isolere organer (seksjon 2.3).
- Overvåk oppførselen til PBS og C1498-injisert mus for tegn på leukemi sykdom (f.eks piloereksjon, isolert fra gruppen, og redusert eller ingen bevegelser i bur).
- Organer og celler isolasjon
- organer isolasjon
- Plasser avlives musen på ryggen på en plast bord og bruke nåler til å feste dyrets føtter til rette organ isolasjon. Desinfiser mus med 70% etanol før du utfører en innsnitt.
- Ved hjelp av steril saks, utføre en ventral snitt fra magehuden til halsen. Skjær gjennom bukveggen for å få tilgang til leveren. Skjær gjennom brystkassen og mellomgulvet for å få tilgang til lungene. Flytt tarmen til siden og fjerne milten bruker steril saks og pinsett.
- For å isolere benmargen, kuttet bena på toppen av lårben over skjøten ved hjelp av steril saks. Koble tibia fra femur ved å trekke forsiktig, og ta av hud og muskler fra bein bruker pinsett og saks.
- Plasser hver orgel og bein i en 50 ml tube inneholder kald PBS, og plassere dem på is.
- Isolering av celler fra organer
- Veie milt før forstyrre cellene. Mekanisk forstyrre milten, lungene og leveren ved å presse dem gjennom en 70 um sil ved hjelp av et sprøytestempel i et 50 ml rør, og samle cellene i 30 ml kald PBS.
- Å samle benmargceller, sette lårben og skinnebein i en petriskål på is, kutte ekstremiteter bruker steril saks, og skylle ut benmargen ved å sette inn en 26G nål festet til en 10 ml sprøyte som inneholder 5 ml kald PBS.
- Forstyrre benmargceller ved føring av cellesuspensjonen gjennom nålen / sprøyten, og filtrere cellesuspensjonen gjennom en 70 um sil i et 50 ml rør.
- Sentrifuge alle de rør inneholdende hver av de organer og benmargsceller ved 350 xg i 10 min. Kast supernatanten og resuspender cellene samlet opp fra lungene og benmargen i 2 ml lyseringsbuffer (1x) og cellens isolert fra leveren og milten i 5 ml lyseringsbuffer (1 x) ved forsiktig pipettering av blandingen opp og ned. Fyll rørene til 50 ml med kald PBS.
- Sentrifuger cellene ved 350 xg i 10 min. Resuspender cellene i FACS-buffer for strømningscytometri-analyse eller for å fremstille cellene for mikroskopi. Tell cellene ved hjelp av en celle Thoma tellekammer etter farging med trypanblått dem.
- organer isolasjon
- Celleoverflate-farging av celler isolert fra organene for flowcytometri analyse
- I en strømningscytometri rør, etikett 10 6 celler som ble isolert fra organer med 10 ug / ml av renset anti-CD16 / 32-antistoffer i 100 ul FACS-buffer.
- 10 6 benmargceller, tilsett 100 ul av de følgende antistoffer eller kombinasjoner av antistoffer og deres tilsvarende isotype kontroller fortynnet i FACS-buffer: anti-CD11b / anti-CD3 (1) / anti-Ly6C / anti-Ly6G (2), anti-B220 (1) /anti-CD45.2/anti-CD19, anti-CD115 / anti-CD3 (1) / enti-Ly6C / anti-Ly6G (2), anti-CD45.2, anti-Ly6G (2), anti-CD11b, anti-CD115 eller anti-CD19 alene for kompensasjonsinnstillinger.
- For å splenocytter, tilsett 100 ul av de følgende antistoffer og deres tilsvarende isotype kontroller fortynnet i FACS-buffer: en kombinasjon av anti-CD11b / anti-CD3 (1) / anti-Ly6C / anti-Ly6G (2), anti-B220 (1 ) /anti-CD45.2/anti-CD19, anti-CD45.2, anti-Ly6G (2), anti-CD11b eller anti-CD19 for kompensasjonsinnstillinger.
- Til lunge- og leverceller, tilsett 100 ul av anti-CD45.2 antistoffer og dens tilsvarende isotypekontroll fortynnet 1/100 i FACS-buffer.
- Inkuber alle celle løsninger for 30 minutter ved 4 ° C.
- Vask cellene ved tilsetning av 2 ml FACS-buffer til hvert rør. Sentrifuger rørene i 5 min ved 350 xg og forkaster supernatanten ved pipettering. Gjenta dette trinnet en gang til.
- Suspender merkede celler i 500 ul kald PBS. Hold cellene på is og beskyttet mot lys før du utfører flowcytometri for actakelse og analyse 10.
- Isolering av mononukleære blodceller og immunofluorescerende farging for flowcytometri analyse
- Før start av protokollen, forvarme skille løsningen til RT.
- Overfør blodprøven (100 til 200 ul; oppnådd fra trinn 2.2) inn i et mikrosentrifugerør, og legge til PBS / 1 mM EDTA-løsning inntil løsningen volum er 500 ul. Nøye lag 500 mL av separering løsning under oppløsningen inneholdende blod ved anvendelse av en 30G nål og en 1 ml sprøyte. Ikke bland blod og skille løsning.
- Sentrifuger rørene ved 800 xg (uten brems) i 20 minutter ved RT. Etter sentrifugering, samle celleringen (den ugjennomsiktig hvitt lag) under anvendelse av en pipette. Overfør cellene til et mikrosentrifugerør.
MERK: opakt hvitt lag inneholder lymfocytter samt monocytter og vises mellom det nedre lag - skille løsning - og det øvre laget. - Tilsett 1 mlPBS-oppløsning, og sentrifuger røret ved 350 xg i 10 min. Resuspender cellene i 600 pl FACS-buffer.
- Tilsett 10 ug / ml av rensede anti-CD16 / 32-antistoffer og fordele 100 ul av cellesuspensjonen inn i seks separate rør (100 ul hver).
- Merke cellene med 100 ul av de følgende antistoffer eller deres tilknyttede isotype kontroller fortynnet i FACS-buffer: en kombinasjon av anti-CD3 (1) / anti-B220 (1) /anti-CD45.2 og anti-Ly6C / anti-CD115 /anti-CD45.2 eller anti-CD45.2 og anti-CD115 alene for kompensasjonsinnstillinger.
- Inkuber alle rørene ved 4 ° C i 30 minutter.
- Vask cellene ved tilsetning av 2 ml FACS-buffer til hvert rør, og deretter sentrifugere rørene i 10 minutter ved 350 xg, og kast supernatanten ved hjelp av en pipette.
- Suspender merkede celler i 500 ul kald PBS. Hold cellene på is og beskyttet mot lys før du utfører flowcytometri innsamling og analyse 10.
- Utarbeidelse av beinmargscellesuspensjoner på lysbilder for mikroskopi
- Følg fremgangsmåten som er beskrevet i kapittel 1.3, men i trinn 1.3.1, bruker 10 5 benmargceller, og i trinn 1.3.4, spinne cellene i hvert kammer på 72,26 xg i 10 min.
- Esterase-aktivitetsmålinger ved hjelp av benmargceller
- For å utføre benmargsesterase cytochemistry analyser, fortsett fra trinn 1,5 til 1.5.3.7.
- May-Grünwald Giemsa farging av benmargceller
- Å farge benmargceller, følger protokollen som er beskrevet i kapittel 1.6, men i trinn 1.6.1, inkuber lysbildene i mai-Grünwald løsning i 5 min.
Representative Results
For å karakterisere C1498 musemodell, fortsatte vi med to store skritt. Først ble de C1498-celler, karakterisert for å bestemme deres hematopoietisk avstamning og modningsstadiet in vitro (figur 1). Disse cellene ble deretter injisert inn i congenic mus, og arten av den induserte leukemiske sykdommen ble vurdert for å bestemme forskjellige funksjoner: leukemicelleinfiltrasjon, deres fenotype, en kvantifisering av de hematopoetiske celler (modne og progenitorceller / forløpere) i benmargen, frekvensene av C1498-celler og modne hematopoetiske celler i blodet og en evaluering av organ svelling (i milt, lever og lunger) og cellulære sammensetning.
For å karakterisere de C1498 celle fenotyper in vitro ble cellene merket med antistoffer rettet mot molekyler som er uttrykt av hematopoetiske forløpere og modne celler (Tabell 1), og resultatene ble analysert ved bruk av strømnings cytometry. De C1498-celler var positive for celleoverflate-ekspresjon av Mac-1 (CD11b / CD18) (~ 7%), B220 (> 25%), og de viste intracellulær ekspresjon av CD3ε, T-cellereseptoren (TCR) vp kjeder og Mac -3 (figurene 2A og B). Cellene var negative for celleoverflatemarkører Ly6G, Ly6C, CD115, CD21 / CD35, CD19, CD3, CD4, CD8, NK1.1, og pan-NK-molekyler og for intracellulær ekspresjon av CD4 og CD8 (data ikke vist) . De ble deretter undersøkt for markører for hematopoetiske stamceller og progenitorer (tabell 1). De var også negative for celleoverflate-ekspresjon av CD117, CD34, Sca-1, CD150 og CD16 / 32 (data ikke vist). Disse leukemiske celler ble deretter testet for å bestemme ekspresjonen av adhesjon, antigen presentasjon og ko-stimulerende molekyler. Cellene uttrykte overflatemarkører LFA-1 (CD11a / CD18), CD44, CD31 (PECAM-1), og H-2D b og var negative for MHC klasse II, CD80, CD86 og CD274 (data ikke vist). C1498 celler therefore uttrykte både myeloid (Mac-en, Mac-3) og lymfoide markører (B220, CD3, TCR).
For å bedre karakteristikk av blodkreft avstamning, ble myeloperoxidase uttrykk vurdert ved hjelp av immunfluorescens mikroskopi. Alle cellene var positive for myeloperoksidase, som bekreftet deres myeloid opprinnelse (figur 3A). Et flertall av cellene også farget positivt for α-naftyl butyratproduserende esteraser (figur 3B, venstre panel), og noen av dem farget for naphthol AS-D kloracetat esteraser (svarte piler) (figur 3B, panel høyre). Resultatene indikerer at cellene inneholdt blandinger av monocyttiske og granulocytiske celler. Etter May-Grünwald Giemsa farging ble utført, ble C1498 cellene observert å vise en blast-lignende morfologi med en høy nucleo-cytoplasma ratio, 3 til 5 nucleoli i kjernen, en perinukleær glorie, mange vakuoler og en basophilic cytoplasma (Figur 3C ). thoss, er C1498 cellelinje bestående av monoblasts og myeloblasts.
De C1498-celler (CD45.2 +) ble deretter injisert intravenøst inn i CD45.1 + mus. Musene bukket 17 til 19 dager etter at cellene ble injisert. Disse musene ble avlivet slik at deres leukemi typen kan analyseres før de døde av sykdommen. Kontrollmusene som ble injisert med PBS, ble analysert på de samme tidspunkter for sammenligning. Den C1498 celle-injisert mus viste massiv infiltrasjon av C1498 celler inn i deres benmarg, som demonstrert av eksplosjonen-lignende utseende av cellene etter May-Grünwald Giemsa farging ble utført (figur 4A). De bevart også deres monocytisk og granulocytiske fenotyper (figur 4B og C), noe som viser en opphopning av monoblastisk og myeloblastisk celler som er karakteristisk for akutt myelomonocytisk leukemi.
å determine om marg hematopoetiske celler tallene var lavere etter leukemiceller invasjon, CD45.2 + C1498 celler, B lymfatisk, monocytic og granulocytiske populasjoner (inkludert stamfedre, forløpere og modne celler), ble kvantifisert ved hjelp av immunfluorescens farging og multi-parametrisk flowcytometri analyse. Leukemiske celler som representerte 16-36% av hematopoetiske celler (data ikke vist). De andre celletyper var alle tilstede i betydelig lavere tallene i C1498-injiserte mus enn i PBS-injiserte mus (ved 5-ganger i gjennomsnitt for B-celle-undergrupper, fire ganger i gjennomsnitt for granulocytiske celler og tre ganger i gjennomsnitt for monocyttiske undergrupper) (Figur 5A til C).
En undersøkelse av frekvensene av mononukleære celler i leukemiske og kontroll museblodprøver viste at de inneholdt en tilsvarende prosent av lymfocytter (figur 6A), men en høyere frekvens av monocyttiskog leukemiceller. Disse verdiene er representative for akutt leukemi myelomonocytiske 11 (figur 6B).
Blant de andre funksjonene i akutt myelomonocytisk leukemi 12, de C1498-injisert mus presenteres med hovne lever (hepatomegali), lunger og milt (splenomegali) (figur 7a). Forskjellige frekvenser av CD45.2 + C1498-celler ble påvist i disse organene ved hjelp av immunfluorescens-fargingen og strømningscytometri-analyse (figur 7B). Som splenomegali kan skyldes høye antallet infiltrert monocytter, vi også beregnet at proporsjonene til miltpopulasjoner. Antallet av celler i B-lymfocyttisk, monocytisk og granulocytiske cellefraksjoner var betydelig større, med et gjennomsnitt på 2 ganger, 2,5 ganger og 3 ganger, henholdsvis i leukemiske milter enn i kontroll milter (figur 7C).
tynn-page = "1"> 
Figur 1. Skjematisk fremstilling av protokollen sette opp for å karakterisere in vitro Cultured C1498 cellelinjer og in vivo Beskrivelser av akutt leukemi. Den hematopoietisk avstamning og differensiering scenen av vev-dyrket C1498 celler ble først bestemt. C1498-celler ble deretter injisert inn i congenic mus for å indusere utvikling av akutt leukemi. Isoleringen av benmarg, perifert blod, milt, lever og lunge vev ble utført for å bestemme frekvensene, fenotyper og morfologiske endringer etter C1498 celler infiltrasjon. IV: Intravenøs MGG. May-Grünwald Giemsa Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
ad / 54270 / 54270fig2.jpg "/>
Figur 2. Fenotypisk analyse av C1498 celler etter in vitro-kultur. Representative flowcytometri dot plots og histogrammer av celleoverflate (A) og intracellulær (B) C1498-uttrykte molekyler som var knyttet til hematopoetiske modne celledifferensiering er vist. C1498-celler ble høstet fra kulturer, vasket og merket ved anvendelse av fluorescerende antistoffer som var spesifikke for celleoverflaten CD11b, CD18 og B220 markører eller deres isotype kontroller. For intracellulær farging ble cellene fiksert, permeabilisert og merket ved anvendelse av antistoffer rettet mot Mac-3, CD3ε, og en felles epitop av TCR (T-cellereseptor) vp-kjeden eller deres isotype kontroller. Analysene ble utført ved hjelp av gating med levende celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Funksjonell og Morfologisk karakterisering av kultivert C1498 Cells. C1498-celler ble høstet fra kulturer og sentrifugert på objektglass for mikroskopi. (A) Farging for myeloperoksidase-ekspresjon ble utført ved anvendelse av immunfluorescens. (B) cytokjemiske reaksjoner ble brukt for å analysere α-naftyl-butyrat esterase (NBE) og naftol AS-D-kloracetat esterase (CAE) aktiviteter i C1498-celler. Celler ble ansett for å være positive for hver etikett når brun og rød-lilla, store cytoplasmatiske granulater henholdsvis ble observert. (C) May-Grünwald Giemsa (MGG) farging av C1498 celler. For hvert eksperiment farging, er mikroskopi objektivforstørrelsen indikert. Hvert bilde er representative for tre separate eksperimenter.large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Bone Marrow morfologi i PBS og C1498-injisert mus. Benmargceller ble isolert fra PBS og C1498 celle-injisert mus og sentrifugeres på lysbilder for mikroskopi. (A) May-Grünwald Giemsa (MGG) farging. (B ) α-naftyl butyrate esterase (NBE) og (C) naftol AS-D chloroacetate esterase (CAE) funksjoner ble evaluert ved hjelp cytochemistry. I panel A, bandet (umoden) eller segmentert (modne) nøytrofile er mindre synlige i benmargen av C1498-injiserte mus enn PBS-injiserte mus. Panel B og C indikerer at det var en opphopning av monocyttiske og granulocytiske celler i benmargen leukemiske forhold til tallene som observeres i kontroll benmargen. Allemikroskopiske analyser ble utført ved hjelp av en 100X forstørrelse objektiv. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Kvantitativ analyse av medullær populasjoner i PBS og C1498-injisert mus. Benmargceller ble isolert fra PBS og C1498 celle-injisert mus og beregnet etter celle telling ble utført. Frekvensene av de forskjellige cellepopulasjoner ble bestemt etter farging og levende celle gated strømningscytometri-analyse. (A) B-celleundergrupper inkludert CD19 + B220 + -celler i steg fra pro-B-celler til modne B-lymfocytter (B) granulocytiske celler i CD3 - og CD11b + Ly6G + linjene, som inkluderte forløpere en. nd umodne og modne granulocytter (c) monocyttiske undergrupper ble definert som CD3 - CD115 + og inkludert celler i stamfar til modne monocytter etapper. n = 7 mus / gruppe, og dataene er presentert som histogrammer som viser gjennomsnitt ± SEM. ***, P <0,0001 og **, p <0,01, uparet Students t- test for sammenligning PBS og C1498-injisert mus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Blodanalyse Enkjernede Cell Delsett i PBS og C1498-injisert mus. Representative flowcytometri dot plots av (A) T- og B-lymfocytt-prosenter, som ble definert som henholdsvis CD3 + og B220 + celler i PBS og celle-C1498 injisert. mus (B) monocytic cellefrekvenser i C1498 leukemic og kontroll (PBS) mus ble bestemt ved å analysere CD115 + Ly6C - og CD115 + Ly6C høye celler. Analysen ble utført ved gating levende celler. Å sammenligne leukemiske og kontroll mus, CD45.2 + C1498 celler ble ekskludert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Estimering av Spleniske populasjoner i Leukemi og kontroll mus. (A) Representative bilder av lever, lunge og milt hevelse i leukemi mus i forhold til å styre mus. Milt ble samlet og veid, og splenocytter ble talt følgende vev avbrudd. (B) Histogram representerer leukemiske cellefrekvenser i different organer etter immunfarging ble utført for CD45.2 + celler, og resultatene ble analysert ved hjelp av strømningscytometri. (C) Estimering av milt-B, granulocytiske og monocyttiske celleantall etter farging og flow cytometri analyse gating ble utført for å identifisere levende CD19 + B220 + , CD3 - CD11b + Ly6G +, CD3 - CD11b + Ly6C - og CD3 - CD11b + Ly6C høye celler. Skalaen Strekene for lungene, milt og lever indikerer 1 cm. .. n = 5-8 mus / gruppe, og dataene er representert i histogrammet som gjennomsnitt ± SEM *, p <0,05, **, p = 0,0033, uparet Students t- test for sammenligning PBS og C1498-injiserte mus Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| celle~~POS=TRUNC | Membran eller Intracellulære Molekyler |
| Forløpere og modne celler | |
| NK-celler | NK1.1 +, pan-NK + |
| NKT celler | NK1.1 +, pan-NK +, TCR Vbeta + (8,2), CD3 + |
| T-lymfocytter | TCR Vbeta +, CD3 +, CD4 +, CD8 + |
| B-celler forløpere og B-lymfocytter | B220 +, CD19 +, CD21 / 35 + |
| granulocytiske forløpere og granulocytter | Ly6G +, Mac-en +, CD11b + |
| monocyttiske forløpere og monocytter / makrofager | CD11b +, Mac-en +, Mac-3 +, CD21 / 35 +, CD115 +, Ly6Chi |
| stamfedre | |
| multipotente stamceller | CD117 + Sca-1+ CD34 + (karmene CD150-) |
| lymfoide-primet multipotente stamceller | CD117hi Sca-1hi CD127 + (karmene) |
| vanlige lymfoide stamceller | CD117lo Sca-1LO CD127 + (karmene) |
| vanlige myeloide stamceller | CD16 / 32lo CD117 + CD34int (karmene Sca-1-) |
| granulocytt-makrofag forfedre | CD16 / 32hi CD117 + CD34hi (karmene Sca-1-) |
| megakaryocytt-erytroide stamfedre | CD16 / 32lo CD117 + CD34lo (karmene Sca-1-) |
| Blodkreft stamceller | CD117 + Sca-1 + CD150 + (karmene CD34-) |
Tabell 1. Markører hematopoietiske Cell linjene og differensiering.
CD: klynge av differensiering; Lin: markører for modne celler; lo:lav uttrykk; hei: høy uttrykk; int: mellom uttrykk; NK: naturlige drepeceller; TCR: T-celle-reseptor.
Discussion
I tidligere studier ble C1498 cellelinje beskrevet som induserer akutt granulocystisk 5, myelomonocytisk 6 eller NKT 7 celle leukemi. Men demonstrative data i litteraturen var enten fraværende eller mangelfull. Protokollen som presenteres her bruker forskjellige teknikker, slik som strømningscytometri, immunfluorescens, MGG-farging og cytokjemiske analyser, for å karakterisere dyrkede C1498-celler, og for å bestemme arten av leukemi som er indusert i mus etter at de er injisert.
Når vi fenotypiseres in vitro dyrket C1498-celler etter farging og flowcytometri analyser ble utført, ble det observert noen begrensninger fordi disse cellene uttrykte noen få celleoverflatemarkører hematopoetiske som tidligere har blitt beskrevet i litteraturen 6,7. Etter avtale med våre resultater, gjorde Labelle et al. Ikke observere celleoverflaten uttrykk for modne TCR på C1498 celler ved hjelp av flyt cytometry farging. Men regnet de dem til å være en NKT cellelinje etter at de oppdaget CD3ε og TCRVβ8.2 mRNA 7. Vi har også observert den intracellulære uttrykk for TCRVβ kjeder og CD3ε molekyler i de fleste av cellene (> 70%), men deres blodkreft linjene kunne ikke fastslås fordi det var også samtidig intracellulær uttrykk for Mac-3-molekylet.
Myeloperoxidase, MGG farging og vurderinger for å analysere funksjonelle esterases bruker cytochemistry vist at C1498 cellelinjen hadde en myeloid opprinnelse og var sammensatt av monoblasts og myeloblasts. Disse resultatene er overensstemmende med hvor mange prosent av Mac-3 + celler som ble oppnådd i flowcytometri fargingsanalyse. Selv om det ikke er kvantitative, denne fremgangsmåten utgjør viktige eksperimenter som skal utføres. Faktisk, de forblir så langt, den beste eksisterende metoder for å karakterisere avstamning og differensiering scenen av hematopoetiske celler som uttrykker ingen eller few spesifikke fenotypiske markører.
Flowcytometri farging var nyttig for å demonstrere utvikling av akutt leukemi i mus etter congenic C1498-celler ble injisert intravenøst. De CD45.2 + C1498 celler som infiltrerte inn i det perifere blod og forskjellige organer ble isolert, og deres frekvenser ble bestemt. Kvantifisering ble også utført for å analysere iboende medullær og miltceller etter immunfenotyping. Begrensninger ble påtruffet når C1498 cellefenotyp ble undersøkt i organer som de uttrykte noen blodkreft markører (bare noen få av dem var B220 +). For å klargjøre innholdet av den observerte akutt leukemi, May-Grünwald Giemsa flekker og en analyse av virksomheten i monocytic og granulocytiske esteraser ble utført ved hjelp av benmarg. Resultatene viste at C1498 celler bevart sin myeloblastisk og monoblastisk morfologi og funksjon, avslører utbruddet av myelomonocytic leukemi.
eksempel blod, benmarg, og miltceller) bør holdes på is under prosedyren. Hvis ingen farging observert i flowcytometri eller / og immunfluorescens eksperimenter, referanse av antistoffene, deres lagring reutmerkelser og deres fortynninger bør sjekkes. Referansene er spesifisert i materialer / utstyr tabellen er valgt for flowcytometri eller immunfluorescens applikasjoner. De primære / sekundære antistoffer eller deres konjugerte fluorophores kanskje har mistet sin aktivitet på grunn av feil lagring (for eksempel eksponering for lys eller varme), feil fortynning, omfattende frysing / tining eller bruken av forurensede buffere. Kjør positive kontroller for å sikre at de fungerer som de skal. Bruk musen benmarg eller milt-deriverte celler som er kjent for å uttrykke proteiner av interesse. For å unngå høy bakgrunn og ikke-spesifikk farging, sørg for at cellene blir vasket skikkelig og holdt ved høy luftfuktighet (for immunfluorescens) og at antistoffene fortynnes som anvist. Bruk samme konsentrasjon og fortynning for isotype kontroll-antistoff og det primære antistoff for å nøyaktig bestemme bakgrunnsnivået i prøven. For esterase cytochemistry eksperimentene,Reagensene kan testes ved hjelp av positive og negative kontrollobjektglass inneholdende rensede musemilt granulocytisk (Ly6G +) og monocyttisk (CD115 +) celler.
Fremgangsmåten beskrevet i denne studien viste at mange av de leukemiske egenskaper ble observert hos mus etter injeksjon av C1498-celler deles felles kjennetegn med human akutt leukemi myelomonocytisk 11,12. De invaderte leukemiceller resulterte i en reduksjon av modne og umodne (stamfedre og forløpere) marg hematopoetiske celler. C1498-celler er tilstede med høy frekvens (> 20%) i det perifere blod, som er monocyttiske celler. Hepatomegali og splenomegali ble observert å skyldes infiltrering av leukemiske celler, og betydelige økninger i B-lymfocytter og myeloide celler ble også observert å følge splenomegali. Trombopeni ble også observert når blodplater tall ble beregnet ved hjelp av en hematologimaskin.
Det var showetn, ved hjelp av in vitro-eksperimenter, at C1498 celler inhibere normal hematopoese murin ved å skille løselige faktorer 13. I flere tumor musemodeller, har umodne myeloide celler (inkludert monocytisk og granulocytiske celler) også blitt vist å migrere fra benmargen til milten, hvor de inhiberer antitumorspesifikke T-celle-aktivering og proliferasjon 14. Således er reduksjonen i hematopoetiske celler som ble observert i benmargen kunne ha resultert fra enten en mangel på hematopoiesis og / eller fra deres utvandring. Denne sistnevnte mekanisme kan forklare tilstedeværelsen av monocytose i perifert blod eller observasjon av forstørrede myeloid fraksjoner i milten. Det er også tenkelig at disse cellene kan ha blitt avledet fra forbedret milt hematopoiesis. Faktisk, under konstante betingelser, enkelte undergrupper av milt-B-celler ble identifisert som forløpere til modne B-lymfocytter 15. Videre under inflammatoriske tilstander, MEDullary stilk og stamfedre celler har vist seg å flytte til milten for å indusere produksjon av modne monocytter 16. Denne protokollen tillater oss ikke å trekke konklusjoner om hvilke mekanismer som er involvert i utvikling av leukemi, og flere funksjonelle samt molekylære analyser bør være ansatt for å gjøre det. Men disse dataene inkluderer detaljert informasjon om kliniske kjennetegn akutt myelomonocytisk leukemi og vil hjelpe forskere til å vurdere og forstå effekten av nye terapeutiske midler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C1498 cell line | ATCC | TIB 49 | |
| C57BL/6J-Ly5.1 | Charles River | B6.SJL-Ptprc a Pep3 b/BoyCrl | |
| Cells culture reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol, Gibco | ThermoFisher Scientific | 21985 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10270 | |
| HEPES, Gibco (1 M) | ThermoFisher Scientific | 15630 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution, Gibco | ThermoFisher Scientific | 11140 | |
| Penicillin-Streptomycin, Gibco | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
| RPMI 1640 Medium (Gibco, GlutaMAX Supplement) | ThermoFisher Scientific | 61870 | |
| Sodium Pyruvate, Gibco (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360 | |
| Flow cytometry staining reagents | |||
| anti-mouse B220 APC (1) | ebiosciences | 17-0452 | clone RA3-6B2, final dilution 1/100 |
| anti-mouse B220 biotin (2) | ebiosciences | 13-0452 | clone RA3-6B2, 1/400 |
| anti-mouse CD3 eFluor450 (1) | ebiosciences | 48-0032 | clone 17A2, 1/100 |
| anti-mouse CD3 PE (2) | BD biosciences | 555275 | clone 17A2, 1/100 |
| anti-mouse CD3 PE-Cy5 (3) | ebiosciences | 15-0031 | clone 145-2C11, 1/100 |
| anti-mouse CD4 APC (1) | ebiosciences | 17-0041 | clone GK1.5, 1/500 |
| anti-mouse CD4 PE (2) | ebiosciences | 12-0041 | clone GK1.5, 1/200 |
| anti-mouse CD8 biotin (1) | ebiosciences | 13-0081 | clone 53-6.7, 1/100 |
| anti-mouse CD8 eFluor450 (2) | ebiosciences | 48-0081 | clone 53-6.7, 1/500 |
| anti-mouse CD11a biotin | ebiosciences | 13-0111 | clone M17/4, 1/100 |
| anti-mouse CD11b PE | ebiosciences | 12-0112 | clone M1/70, 1/200 |
| anti-mouse CD16/32 biotin | ebiosciences | 13-0161 | clone 93, 1/400 |
| purified anti-mouse CD16/32 (FcR blocking) | BD biosciences | 553141 | clone 2.4G2 |
| anti-mouse CD18 biotin (1) | ebiosciences | 13-0181 | clone M18/2, 1/100 |
| anti-mouse CD18 FITC (2) | ebiosciences | 11-0181 | clone M18/2, 1/50 |
| anti-mouse CD19 PE | ebiosciences | 12-0193 | clone 1D3, 1/200 |
| anti-mouse CD21/35 PE | ebiosciences | 12-0211 | clone 8D9, 1/50 |
| anti-mouse CD31 PE | ebiosciences | 12-0311 | clone 390, 1/100 |
| anti-mouse CD34 eFluor660 | ebiosciences | 50-0341 | clone RAM34, 1/20 |
| anti-mouse CD44 PE | BD biosciences | 553134 | clone IM7, 1/50 |
| anti-mouse CD45.2 FITC | ebiosciences | 11-0454 | clone 104, 1/100 |
| anti-mouse CD49b/Pan NK PE | BD biosciences | 553858 | clone DX5, 1/50 |
| anti-mouse CD80 biotin | ebiosciences | 13-0801 | clone 16-10A1, 1/200 |
| anti-mouse CD86 biotin | ebiosciences | 13-0862 | clone GL1, 1/200 |
| anti-mouse CD107b (Mac-3) PE | ebiosciences | 12-5989 | clone M3/84, 1/40 |
| anti-mouse CD115 PE | ebiosciences | 12-1152 | clone AFS98, 1/100 |
| anti-mouse CD117 eFluor450 | ebiosciences | 48-1171 | clone 2B8, 1/100 |
| anti-mouse CD127 PE | ebiosciences | 12-1271 | clone A7R34, 1/100 |
| anti-mouse CD150 APC | ebiosciences | 17-1501 | clone 9D1, 1/20 |
| anti-mouse CD274 (PD-L1) biotin | ebiosciences | 13-5982 | clone MIH5, 1/200 |
| anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE | ebiosciences | 12-5981 | clone D7, 1/100 |
| anti-mouse Ly-6C APC | ebiosciences | 17-5932 | clone HK1.4, 1/200 |
| anti-mouse Ly-6G (Gr-1) biotin (1) | ebiosciences | 13-5931 | clone RB6-8C5, 1/400 |
| anti-mouse Ly-6G FITC (2) | ebiosciences | 11-9668 | clone 1A8, 1/50 |
| anti-mouse MHC class I (H-2Db) biotin | ebiosciences | 13-5999 | clone 28-14-8, 1/50 |
| anti-mouse MHC class II (I-A/I-E) PE-Cy5 | ebiosciences | 15-5321 | clone M5/114.15.2, 1/1000 |
| anti-mouse NK1.1 PE | BD biosciences | 557391 | clone PK136, 1/50 |
| anti-mouse TCRVb FITC | BD biosciences | 553170 | clone H57-597, 1/50 |
| streptavidin PE-Cy5 | ebiosciences | 15-4317 | 1/200 |
| Immunofluorescence staining reagents | |||
| Anti-mouse myeloperoxidase (heavy chain antibody) | Santa Cruz Biotechnology | sc-16129 | 1/10 (20 µg/ml) |
| anti-goat IgG (Texas Red coupled antibody) | Jackson Immunoresearch | 705-076-147 | 1/250 |
| Normal donkey serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-001 | |
| Hoechst solution | BD Biosciences | 561908 | 1/1000 |
| Mounting medium 1 (Fluoromount) | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Acetone | VWR | 20066 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| Esterase cytochemical staining reagents | |||
| Naphtol AS-D chloroacetate solution | Sigma-Aldrich | 911 | |
| Dye solution (Fast Red Violet LB Base solution) | Sigma-Aldrich | 912 | |
| pH6.3 buffer concentrate (TRIZMAL) | Sigma-Aldrich | 913 | |
| Sodium nitrite solution | Sigma-Aldrich | 914 | |
| Citrate solution | Sigma-Aldrich | 915 | |
| Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | GHS3 | |
| Acetone | VWR | 20066 | |
| Formaldehyde solution, 37% | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| α-naphthyl butyrate solution | Sigma-Aldrich | 1801 | |
| Phosphate buffer solution | Sigma-Aldrich | 1805 | |
| Sodium nitrite Tablet | Sigma-Aldrich | 1809 | |
| Pararosaniline solution | Sigma-Aldrich | 1804 | |
| Methylene blue solution | Sigma-Aldrich | 1808 | 1/10 |
| mounting medium 2 (Clearmount) | Invitrogen | 00-8010 | |
| May-Grünwald Giemsa staining reagents | |||
| May-Grünwald solution | RAL Diagnostics | 320070 | |
| Giemsa R solution | RAL Diagnostics | 320310 | 1/20 |
| pH 6.8 buffer solution | RAL Diagnostics | 330368 | |
| Others materials, reagents and equipment | |||
| Ketamine 1000 (100 mg/ml) | VIRBAC | 3597132111010 | |
| Xylazine SEDAXYLAN (20 mg/ml) | CEVA | ||
| Bovin albumin serum (BSA) powder | ThermoFisher Scientific | BP671 | |
| PBS solution (1x concentrate) | ThermoFisher Scientific | 14190 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Ultra Pure 0.5 M EDTA solution, pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | 15575 | |
| Separating solution (Pancoll Mouse) | PANBIOTECH | P04-64100 | |
| Lysis buffer (Red Blood Cells Lysing Buffer) (10x) | BD Biosciences | 555899 | 1/10 |
| NaOH 10 N | ThermoFisher Scientific | SS267 | |
| Trypan blue solution (0.4 %) | ThermoFisher Scientific | 15250-061 | 1/2 |
| 50 ml tube (Falcon) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 70 µm Cell Strainer (Falcon) | Corning Life Sciences | 352350 | |
| Chamber & filter card (EZ Cytofunnel Shandon) | Thermo Scientific | A78710003 | |
| Microscope Cover Glasses, 24 x 24mm | Knittel Glass | VD1 2424 Y100 | |
| Slides (Starfrost - ground edges 90) | Knittel Glass | VS1137# 077FKB | |
| EDTA Tube | Greiner Bio-One | 454034 | |
| Pasteur Pipette 150 mm (capillary tube) | Fisherbrand | 1154-6963 | |
| 26 G needle | Terumo | NN-2613R | |
| insulin syringe and needle 29 G | Terumo | BS05M2913 | |
| 30 G needle | Becton & Dickinson | 304000 | |
| Flow cytometry tubes (blue) | Beckman Coulter | 2523749 | |
| Water-repellent pen (Dakopen) | Dako | S200230 | |
| Sharp sterile scissors | Nessi-care | SCI-01 | |
| Sterile forceps | Dominique Dutscher | 956506 | |
| Thoma cell counting chamber | VWR | 631-0397 | |
| Petri Dishes (Fisherbrand Plastic) | ThermoFisher Scientific | S33580A | |
| Microcentrifuge tube (1.5 ml) | ThermoFisher Scientific | 05-408-129 | |
| Cylindrical Restrainer 15 - 30 gm | Stoelting | 51338 | |
| Shandon Cytospin 3 Cytocentrifuge | ThermoFisher Scientific | ||
| 10 ml syringe | Terumo | SS-10L | |
| 1 ml syringe | Terumo | SS-01T | |
| Ethanol | Merck | 1.08543 | |
| Sterile gauze sponges | URGO | 501580 |
References
- Forthun, R. B., Hinrichs, C., Dowling, T. H., Bruserud, Ø, Selheim, F. The past, present and future subclassification of patients with acute myeloid leukemia. Curr. Pharm. Biotechnol. 17 (1), 6-19 (2016).
- Goldie, H., Butler, C. H., Anderson, M. M., Maxwell, M. C., Hahn, P. F. Growth characteristics of free C1498 (granulocytic leukemia) tumor cells in the peritoneal fluid and the blood of C57 mice. Cancer Res. 13 (2), 125-129 (1953).
- Tanaka, K. K., Roberts, E. Biological studies of E.L.4 lymphoma and C Leukemia in susceptible (C57BL) and resistant (B10.D2) mice. Cancer Res. 24 (1498), 1785-1797 (1964).
- Law, L. W. Characterization of an influence affecting growth of transplantable leukemias in mice. Cancer Res. 4, 257-260 (1944).
- Graham, J. D., McMahon Welch, C., Patchen, M. L. Studies of an implanted murine myelogenous leukemia C1498. Ohio J. Sci. 75 (4), 202-208 (1975).
- Boyer, M. W., Orchard, P. J., Gorden, K. B., Anderson, P. M., Mclvor, R. S., Blazar, B. R. Dependency on intercellular adhesion molecule recognition and local interleukin-2 provision in generation of an in vivo CD8+ T-cell immune response to murine myeloid leukemia. Blood. 85 (9), 2498-2506 (1995).
- Labelle, J. L., Truitt, R. L. Characterization of a murine NKT cell tumor previously described as an acute myelogenous leukemia. Leuk. Lymphoma. 43 (8), 1637-1644 (2002).
- Bradner, W. T., Pindell, M. H. Myeloid leukemia as a screen for cancer chemotherapeutic agents. Cancer Res. 26 (4), Pt 2 375-390 (1966).
- Lin, J. M., Li, B., Rimmer, E., VanRoey, M., Jooss, K. Enhancement of the anti-tumor efficacy of a GM-CSF-secreting tumor cell immunotherapy in preclinical models by cytosine arabinoside. Exp. Hematol. 36 (3), 319-329 (2008).
- Robinson, J. P. Handbook of Flow Cytometry Methods. , Wiley-Liss, Inc. New York, NY. (1993).
- Xu, Y., McKenna, R. W., Wilson, K. S., Karandikar, N. J., Schultz, R. A., Kroft, S. H. Immunophenotypic identification of acute myeloid leukemia with monocytic differentiation. Leukemia. 20 (7), 1321-1324 (2006).
- Hassan, K., Qureshi, M., Shafi, S., Ikram, N., Akhtar, M. J. Acute myeloid leukemia-FAB classification and its correlation with clinico-haematological features. J. Pak. Med. Assoc. 43 (10), 200-203 (1993).
- Quesenberry, P. J., Rappeport, J. M., Fountebouni, A., Sullivan, R., Zuckerman, K., Ryan, M. Inhibition of normal murine hematopoiesis by leukemic cells. N.Engl.J. Med. 299 (2), 71-75 (1978).
- Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Immunol. 181 (8), 5791-5802 (2008).
- Loder, F., et al. B cell development in the spleen takes place in discrete steps and is determined by the quality of B cell receptor-derived signals. J. Exp. Med. 190 (1), 75-89 (1999).
- Robbins, C. S., et al. Extramedullary hematopoiesis generates Ly-6C(high) monocytes that infiltrate atherosclerotic lesions. Circulation. 125 (2), 364-374 (2012).
