Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Genetiske og Biokemiske metoder til Published: July 27, 2016 doi: 10.3791/54271
Automatic Translation
1, 1, 1
1Wales Heart Research Institute, Cardiff University School of Medicine, College of Biomedical and Life Sciences

Introduction

Skelet- og hjertemuskel sammentrækning udløses af reticulum Ca 2+ frigivelse medieret af RyR. Der er tre mammale Ryr isoformer med den funktionelle kanal bestående af fire identiske underenheder. Hver RyR subunit består af et stort cytoplasmatisk regulatorisk N-terminale del og en lille C-terminale del indeholdende de transmembrane domæner, der danner en høj konduktans Ca2 + pore. Unormal intra- og inter-subunit interaktioner ligger til grund RyR kanal dysfunktion og resultere i neuromuskulære og hjertesygdomme 1. Identifikation og karakterisering af specifikke domæner involveret i RyR struktur: function forhold er derfor afgørende for forståelsen af ​​RyR patofysiologi.

Traditionelle biokemiske protein-protein-interaktion teknikker kræver betydelige mængder oprenset protein, ofte produceres i bakterier. Dette er ikke muligt i tilfælde af RyR, en meget stor membran protein består af ~ 5000 aminosyrer, hvorimod dens rekombinante fragmenter er ikke let modtagelig for bakteriel ekspression og oprensning. Således er alternative ekspressionssystemer omfatter eukaryote værtsceller kræves for mammale integrale membranproteiner. Vi har tidligere beskæftiget Y2H, co-IP og cross-linking assays til kollektivt vise, at N-terminale tetrameriseringsdomæne er et strukturelt træk, der er bevaret på tværs af tre pattedyr RyR isoformer 2,3. Vigtigere er, har vi fundet, at en enkelt punktmutation forbundet med arytmier hjertesygdom afbryder N-terminus selvassociering og resulterer i en dysfunktionel RyR kanal 4. Vi har også anvendt disse teknikker til at oligomeriserende undersøgelser af RyR cytoplasmatiske C-terminale hale 5 samt den N-terminale ende af det homologe intracellulær Ca2 + udgivelseskanalen, inositol 1,4,5 triphosphat receptor 2.

I Y2H assay interactipå mellem to proteiner (X og Y) måles ved rekonstituering af et funktionelt transkriptionsfaktor (GAL4) og den efterfølgende aktivering af reportergener 6-9. To forskellige kloningsvektorer bruges til at generere fusioner af de to testede proteiner med de to fysisk adskillelige, uafhængige domæner af GAL4: DNA-bindende domæne (DNA-BD) / protein X fusion (lokkemad) og aktiverende domæne (AD) / protein Y fusion (mål). Den Y2H kan bruges til at teste, om et protein interagerer med sig selv ved at generere GAL4 DNA-BD og AD fusioner af det samme protein. Genetisk modificerede Y2H stammer GAL4 og GAL80 deficiente (den GAL80-proteinet er en repressor af GAL4), samt TRP1 og LEU2 deficient (for at tilvejebringe ernæringsmæssig selektion for agn og prey plasmider, henholdsvis). I gæren kernen, er de rekombinante DNA-BD og AD peptider bringes i tæt fysisk nærhed for at frembringe en hybrid GAL4 transkriptionsfaktor kun gennem deres fusioner 'X: Y interaction. Denne fremgangsmåde muliggør hurtig genetisk screening til påvisning af protein-protein-interaktioner gennem den parallelle transkriptionel aktivering af prototrofisk (HIS3 kodende for et enzym er nødvendigt for histidin-biosyntese) og kromogen (LacZ koder for β-galactosidase (β-Gal)) reportergener. Den største fordel ved Y2H er, at det er en in vivo assay, der detekterer selv svage eller forbigående protein-protein interaktioner. Endvidere detektion involverer simpel brug af udvælgelse vækst (i medier, der mangler histidin) eller af et kolorimetrisk (β-Gal) assay uden behov for oprensning af agn og målproteiner eller genereringen af ​​specifikke antistoffer. Derudover kan Y2H anvendes til at screene en samling af tilfældige ukendte kloner (cDNA-bibliotek kloner fusioneret til GAL4 AD) til hidtil ukendte bindingspartnere af en lokkemad protein, også giver direkte adgang til cDNA'et af biblioteket protein.

At udvide Y2H observationer, uafskellige biokemiske teknikker kan anvendes. Co-IP og cross-linking analyser kombineret med immunoblotting anvendes til at opdage protein foreninger i komplekse prøve blandinger metoder, f.eks., Helcellelysater 10. Deres største fordel er, at de rapporterer om protein-protein interaktioner fra nativt væv, i modsætning til andre metoder, der kræver brug af rekombinante proteiner. Rekombinante proteiner kan også anvendes, typisk udtrykt i en mammal cellelinie, hvor de sandsynligvis vil have deres korrekte konformation og posttranslationelle modifikationer, såvel som subcellulære lokalisering. Da co-IP og tværbinding er in vitro-assays, der gør brug af homogeniserede celler, er det nødvendigt at bekræfte, om de to proteinpartnere co-lokaliseret i den intakte celle 11. Vi anvender rutinemæssigt transfektion af mammale HEK293-celler til transient udtrykker pattedyr-integral membran og cytosoliske proteiner under anvendelse af calciumphosphatpræcipitationsfremgangsmåden 2-4,12-14, Beskrives her i detaljer. Dette er en billig måde til effektivt at levere plasmid-DNA'et i celler, men den er afhængig af den særlige cellelinie anvendes, og celle konfluens, samt renheden af plasmid-DNA'et 11,15.

Co-IP assay involverer isolering af det native eller rekombinant protein af interesse fra cellelysater under ikke-denaturerende betingelser, der muliggør co-oprensning af formodede interaktionspartnere 10,16. Den kræver anvendelse af to uafhængige antistoffer, den immunpræcipitering antistof til isolering af protein X, og immunoblotting antistof til påvisning af protein partner Y. Det kan bruges til at teste, om et protein interagerer med sig selv ved at generere to forskellige fusioner med to forskellige epitop tags (f.eks., HA og cMyc). Den immunpræcipitering antistof er bundet gennem sin Fc-region på protein-A (eller protein-G, afhængigt af dyrearten, hvor antistoffet blev rejst), somer konjugeret til agarose (eller sepharose) harpiks. Protein X udfældes ved antistof: Protein-A harpiks efter inkubation med cellelysatet, nemlig detergent-opløselige fraktion af homogeniserede celler. Protein-immuno-komplekser elueres med SDS-holdig buffer og efterfølgende analyseret ved SDS-PAGE og immunoblotting under anvendelse af et antistof til påvisning af tilstedeværelsen af protein Y 17. Co-IP bør udføres med detergent-opløselige proteiner for at undgå overdreven ikke-specifik binding. Valget af vaskemiddel og dets koncentration, samt antal vask, bør optimeres for hver X: Y pair 10,16,18.

Tværbinding anvendes til at bestemme støkiometrien af ​​den oligomere proteinkompleks. Den er baseret på en kemisk reaktion til at skabe covalente bindinger mellem tilstødende interagerende protomerer, og derfor er det muliggør bevarelse af proteinets oligomere status under SDS-PAGE separation. Der er talrige tværbinding ReageNTS af forskellig længde og kemi målrettet forskellige reaktive grupper på proteiner, typisk primære aminer, carboxyl- eller thiolgrupper. Her beskriver vi anvendelsen af glutaraldehyd (OHC (CH2) 3 CHO), en homo-bifunktionelle tværbindingsmiddel med to aldehydgrupper i begge ender, der reagerer med frie aminogrupper til stede i lysinrester 19,20. Tværbinding følges i en koncentrations- eller tidsafhængig måde resulterer i adduktdannelse. Glutaraldehyd Reaktionen standses med hydrazin (H 2 NNH 2) og protein Derefter analyseres prøverne ved SDS-PAGE og immunoblotting 17 at evaluere deres oligomerisering tilstand. Vi bør bemærke, at cross-linking ikke inducerer oligomerisering men blot skaber stabile broer mellem allerede eksisterende proteinkomplekser. Vigtige overvejelser, når udfører tværbindingsforsøg omfatter valg af cross-linker, dens koncentration og reaktionstid 19,20.

Protocol

1. Gær to-hybrid

  1. gær Transformation
    1. Forbered følgende medier og buffere:
      1. Forbered gær komplet gærekstrakt-pepton-dextrose (YPD) medium ved at blande 20 g / l pepton, 10 g / l gærekstrakt, 2% w / v glucose (tilsat efter autoklavering) og 20 g / l agar (for plader kun) ; steriliseres ved autoklavering og bruge frisk på dagen for forsøget.
      2. Forbered gær minimal syntetisk defineret (SD) medium (uden leucin og tryptophan at holde selektivt tryk på begge agn og target plasmider) ved at blande 6,7 g / l gærnitrogenbase, 1,6 g / l Dropout supplement uden leucin og tryptophan, 2% vægt / v glucose (tilsat efter autoklavering) og 20 g / l agar (for plader kun); steriliseres ved autoklavering og bruge frisk på dagen for forsøget.
      3. Forbered 50% vægt / volumen PEG (polyethylenglycol) 3350; sterilisere gennem et 0,2 um filter og opbevar ved stuetemperatur.
      4. Forbered 100 mM Tris / 10 mM EDTA (10x TE), justerpH til 7,5, sterilisere gennem et 0,2 um filter og opbevar ved stuetemperatur.
      5. Forberede 1 M lithiumacetat (10x LiAc); pH indstilles til 7,5 med CH3COOH, sterilisere gennem et 0,2 um filter og opbevar ved stuetemperatur.
    2. Genoplive Y2H stamme (fx Y190) ved at udstryge en lille mængde af den frosne glycerolstamopløsning på en YPD-plade. Inkuber ved 30 ° C, indtil gærkolonier nå ~ 2 mm i diameter (normalt 3 - 5, dage, afhængigt af gærstammen).
    3. Pode 0,5 ml YPD (i et 1,5 ml rør) med en enkelt, stor (2 - 3 mm i diameter) koloni. Vortex kraftigt i ~ 2 min at dispergere eventuelle klumper.
    4. Overfør cellesuspension i en 500 ml kolbe indeholdende 50 ml YPD-medium. Inkuber ved 30 ° C i 16 - 18 timer med omrystning ved 250 rpm i gær for at nå stationær fase.
    5. Overførsel 4. - 5. ml overnatskulturen i 200 ml YPD (i en 1 I konisk kolbe) for at fremstille en optisk densitet ved 600 nm (OD600 måltanvendelse af et spektrofotometer) på 0,2 - 0,3 (200 ml vil være nok til 20 transformationer).
    6. Inkuber ved 30 ° C under omrystning ved 250 rpm, indtil cellerne er i midt-log-fase, dvs., OD600 = 0,5 - 0,6 (sædvanligvis 2 - 3 i timer).
    7. Harvest gær ved centrifugering (i 50 ml rør) ved 1.500 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten fjernes, resuspenderes hver pellet i 5 ml sterilt H2O og pool sammen.
    8. Re-centrifuge ved 1.500 xg i 5 minutter ved stuetemperatur og kassér supernatanten. Resuspender gær pellet i 1 ml frisklavet, sterilt 1x LiAc / TE.
      BEMÆRK: Brug kompetente gærceller inden for 1 time forberedelse.
    9. Forbered plasmid prøver (i 1,5 ml rør) ved tilsætning af 200 ng plasmid-DNA til enkelt- transformationer, eller 0,5 - 1 ug af hvert plasmid-DNA til co-transformationer, og 100 ug af sild testikler bærer-DNA (kogt i 20 minutter og afkølet på is lige før brug).
      BEMÆRK: Medtag en positiv kontrol, fx gær.co-transformeret med pVA3 (koder for GAL4-DNA-BD fusion med p53-protein) og pTD1 (koder for GAL4 AD fusion med SV40 stort T-antigen).
    10. Tilsæt 100 ul af frisklavet, kompetent gærsuspension (trin 1.1.8) og 600 pi 1x LiAc / PEG-opløsning (8 ml lager PEG 3350, 1 ml lager TE, 1 ml lager LiAc) og vortex til ~ 30 sek. Inkuber ved 30 ° C i 30 minutter under omrystning ved 200 rpm.
    11. Der tilsættes 80 pi dimethylsulfoxid (10% volumen / volumen slutkoncentration) og blandes godt ved forsigtig vending. Varmechok i 15 minutter i et 42 ° C vandbad under blanding hver 2 - 3 i min.
    12. Chill cellesuspensionen på is i 2 minutter og centrifugeres ved 14.000 xg i 15 sekunder ved stuetemperatur til at inddrive gær.
    13. Resuspender cellepelleten i 100 ul 1x TE og plade på passende minimal SD medium-plader til selektiv vækst (medium uden leucin og tryptophan at holde selektivt pres på begge agn og mål plasmider).
    14. Pladerne inkuberes up-side-down ved 30° C, indtil kolonier er ~ 2 mm i diameter (som regel 4 - 5 dage). Plader kan lagres ved 4 ° C i 2 - 3 uger for længere opbevaring gør glycerol aktier og opbevares ved -80 ° C.
      BEMÆRK: Kontroller, at bait og målproteiner udtrykkes i gær ved immunoblotting 17, og at de ikke har autonom reportergenaktivering når separat udtrykkes i gær (ved β-Gal-assay som beskrevet i afsnit 1.3).
  2. Koloni-lift filterpapir β-Gal-assay
    1. Forbered følgende buffere:
      1. Forbered Z puffer indeholdende 100 mM Na 2 HPO 4, 40 mM NaH 2 PO4, 10 mM KCI, 1 mM MgSO4; justere pH til 7,4. Der steriliseres i autoklave og opbevares ved stuetemperatur.
      2. Forbered X-Gal puffer ved opløsning 5-brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid ved 20 mg / ml i N, N-dimethylformamid og opbevares i mørke ved -20 ° C. Forbered Z puffer / X-Gal-opløsning. Lav bufferfør anvendelse ved blanding af X-Gal på 0,33 mg / ml og β-mercaptoethanol ved 0,27% vol / vol i Z buffer. Brug 2,5 ml per prøve.
    2. Tilsættes 2,5 ml frisk fremstillet Z buffer / X-Gal-opløsning i en ren 100 mm plade og sted inde i et cellulose filtrerpapir.
    3. Placere en ny filtrerpapir over overfladen af ​​pladen med gærkolonier skal analyseres. Gnid forsigtigt filtrerpapiret på pladen med en pincet og orlov til ~ 5 min for kolonier at vedhæfte.
      BEMÆRK: Behandl den positive kontrol parallelt, dvs. gær co-transformeret med pVA3 og pTD1..
    4. Løft filtrerpapir og oversvømme det (med en pincet) i en pulje af flydende nitrogen i 30 sek (flydende kvælstof skal håndteres med forsigtighed, altid bære tykke handsker og beskyttelsesbriller). Lad det frosne filtrerpapir tø op ved stuetemperatur i ~ 2 min.
    5. Filtret (koloni opad) oven på det præ-gennemblødt filterpapir inde i 100 mm plade, og inkuber ved 30 ° C.
    6. periodevis(Hver ~ 30 min) for udseendet af blå kolonier. Gær Y190 co-transformeret med de positive kontrol plasmider (pVA3 + pTD1) bliver blå i 60 min (upublicerede observationer).
      BEMÆRK: Svag agn: target interaktioner kan tage flere timer at producere et positivt blå signal (undgå langvarig inkubation (> 8 timer), som kan give falske positive resultater). For de bedste resultater ved at bruge frisk co-transformerede kolonier, dvs., dyrket ved 30 ° C i 4 -. Fem dage, ~ 2 mm i diameter.
  3. Flydende kultur β-Gal-assay
    1. Forbered følgende buffere:
      1. Forbered Z puffer indeholdende 100 mM Na 2 HPO 4, 40 mM NaH 2 PO4, 10 mM KCI, 1 mM MgSO4; justere pH til 7,4, steriliseres ved autoklavering og opbevares ved stuetemperatur.
        1 M Na 2 CO 3; opbevares ved stuetemperatur.
      2. Forbered Z puffer / β-mercaptoethanol. Gør buffer før brug ved tilsætning af β-mercaptoethanol ved 0,27% v /v i Z puffer; bruge 700 pi per prøve. Forbered Z puffer / ONPG opløsning. Gør buffer før brug ved at blande ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactopyranosid) ved 4 mg / ml og β-mercaptoethanol ved 0,27% vol / vol i Z puffer; bruge 160 pi per prøve.
    2. Brug en enkelt koloni til at pode 5 ml minimalt SD-medium (uden leucin og tryptophan at holde selektivt tryk på begge agn og target plasmider) og inkuber ved 30 ° C i 16 - 18 timer med omrystning ved 250 rpm.
      BEMÆRK: Assay fem separate kolonier co-transformeret med de samme agn og mål plasmider.
    3. Overfør nok af overnatskulturen i 10 ml frisk SD medium til frembringelse af en OD600 = 0,2 - 0,3. Inkuber ved 30 ° C under omrystning ved 250 rpm, indtil cellerne er i midt-log-fase (OD600 = 0,5 - 0,6).
    4. Overfør 0,5 ml gærkultur i et 1,5 ml rør og centrifugeres ved 14.000 xg i 2 minutter ved stuetemperatur. Registrere det nøjagtige OD600 når høste ceLLS. Resuspender pellet i 100 pi af Z-buffer; dette vil resultere i en 5-fold koncentration faktor.
    5. Placer røret i flydende nitrogen for ~ 1 min (flydende kvælstof skal håndteres med forsigtighed, altid bære tykke handsker og beskyttelsesbriller) og derefter i et 37 ° C vandbad i 3 minutter at tø. Gentag denne fryse-tø-cyklus to gange mere for at sikre cellerne brydes åben.
    6. Opsætning af en blank rør med 100 ul Z buffer.
    7. Tilføj 700 pi Z puffer / β-mercaptoethanol og 160 pi Z puffer / ONPG til prøven og datoer rør; starte timeren og sted i en 30 ° C inkubator.
    8. Tjek jævnligt for gul farve til at udvikle. Der tilsættes 400 pi 1 M Na 2 CO 3 for at standse farveudviklingen og registrere forløbet tid i minutter. Gær Y190 co-transformeret med de positive kontrol plasmider (pVA3 + pTD1) bliver gul indenfor 60 min ..
      BEMÆRK: Svag agn: target interaktioner kan tage flere timer at producere et positivt gul signal For bedst resultaterne, benyttes frisk co-transformerede kolonier, dvs. dyrket ved 30 ° C i 4 -. 5 dage gammel ~ 2 mm i diameter.
    9. Centrifuger ved 14.000 xg i 5 minutter ved stuetemperatur for at pelletere cellerester og overføre supernatanten i en ren cuvette.
    10. Ved hjælp af et spektrofotometer, måle absorbansen ved 420 nm (A 420) af prøverne i forhold til de tomme (værdier bør være mellem 0,02 til 1,0).
    11. Beregn β-galactosidase-enheder, med 1 enhed defineres som den mængde, der hydrolyserer 1 umol af ONPG til o-nitrophenol og D-galactose pr minut pr celle, ifølge den følgende formel:
      ligning 1 = β-galactosidase-enheder
      Hvor: t: forløbet tid for inkubation (i minutter); . cf: koncentrationen faktor fra trin 1.4.8, dvs, jf = 5; OD 600: når cellerne blev høstet.

2. proteinekspression i en pattedyrcellelinje

  2. Forbered følgende medier og buffere:
    1. Forbered vækstmedium ved blanding DMEM med 4,5 g / l glucose, 10% vol / vol føtalt bovint serum og 2 mM L-glutamin; sterilisere gennem et 0,2 um filter og opbevares ved 4 ° C.
    2. Forbered 2x Hepes-saltvand (2x HBS) ved blanding af 280 mM NaCl, 10 mM KCI, 1,5 mM Na 2 HPO 4, 12 mM glucose, 50 mM Hepes; pH indstilles til 7,05, sterilisere gennem et 0,2 um filter og opbevares ved -20 ° C. Forbered 2,5 M CaCl 2. Steriliser gennem et 0,2 um filter og opbevares ved -20 ° C.
  3. En dag før transfektion seed 1 - 2 x 10 6 HEK293 celler i en 100 mm petriskål for at være 60-70% konfluente den følgende dag. Kultur i 16 - 18 timer ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO2.
  4. På dagen for transfektion, fjerne de gamle medium og foder-celler med 10 ml frisk vækstmedium.
    NOTE: Antibiotika er udeladt fra dyrkningsmediet under transfektion, fordi de kan øge celledød.
  5. Fortynd 24 ug plasmid-DNA (for co-transfektioner, en lige molære forhold mellem de to plasmider) og 60 pi 2,5 M CaCl2 i 600 pi totalvolumen (fremstillet med sterilt deioniseret H2O) inde i et 1,5 ml rør; vortex at blande.
    BEMÆRK:. For højeste transfektion effektivitet bør plasmid-DNA være af højeste renhed, dvs har en Abs 260 / Abs 280 ratio = ~ 1.8.
  6. Tilsæt plasmid DNA / calciumopløsning dråbevis i et 50 ml rør indeholdende 600 pi 2x HBS mens konstant og kraftig blanding ved hvirvelblanding. Inkuber i 20 minutter ved stuetemperatur for at tillade dannelse af calcium phosphat / plasmid-DNA-komplekser.
  7. Efter 20 minutters inkubation, vortex kortvarigt og tilsæt opløsningen dråbevis på cellerne til at dække hele overfladearealet af 100 mm petriskål.
  8. Inkuber cellerne ved 37 ° C i 5% CO
  9. Cellerne høstes 24 timer efter transfektion ved centrifugering ved 1.000 x g i 3 minutter ved stuetemperatur og kassér supernatanten. Cellepellets kan opbevares ved -80 ° C indtil brug.
    BEMÆRK: Ekspression plejer at toppe 24 - 72 hr post-transfektion.
  • Cell Homogenisering
    1. Forbered følgende buffere:
      1. Forbered Co-IP homogeniseringsbuffer ved blanding 150 mM NaCl, 20 mM Tris; pH indstilles til 7,4, og opbevares ved 4 ° C.
      2. Forbered Tværbinding homogeniseringsbuffer ved blanding 5 mM Hepes, 0,3 M saccharose; pH indstilles til 7,4, og opbevares ved 4 ° C (filter før brug for at fjerne eventuelle partikler). Supplere med proteaseinhibitorer før anvendelse.
    2. Tilsættes 250 pi glasperler (425 - 600 mikron) inde i et 1,5 ml rør og vask med 500 pi homogeniseringsbuffer. Pellet glasperler ved en kort centrifugeringpuls (1000 xg i 5 sek), og fjern supernatanten. Gentag dette vasketrin gang mere.
    3. Resuspender cellepelleten (fra trin 2.1.8) i 500 pi iskold homogeniseringsbuffer og overføre cellesuspensionen i glasperler-holdige rør.
    4. Homogenisere celler på is med 20 passager gennem en fin nål (23 g, 0,6 x 30 mm) er fastgjort til en 1 ml sprøjte. Med røret hætten lukket, gennembore gennem det med nålen og sprede cellesuspensionen ihærdigt ved glasperlerne.
    5. Centrifuger ved 1.500 xg i 10 minutter ved 4 ° C til fjernelse kerner og ubrudte celler og kassér pelleten. Gemme supernatanten repræsenterer post-nukleare fraktion og fortsætte direkte til co-IP eller tværbinding efter behov.

    • 3. In vitro biokemiske metoder

    1. Co-immunpræcipitering
      1. Forbered følgende buffere:
        1. Forbered Co-IP homogenisering buffer som beskrevet i sfdeling 2.2.1.1. Forbered IP buffer ved at blande 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% (w / v) CHAPS, 2 mM dithiothreitol (valgfri; dithiothreitol kan inkluderes for at reducere proteinaggregater der kan være dannet på grund af luftoxidation); pH indstilles til 7,4, og opbevares ved 4 ° C.
        2. Forbered 2% vægt / volumen CHAPS i co-IP homogeniseringsbuffer; opbevares ved 4 ° C.
        3. Forbered Protein-loading buffer ved at blande 60 mM Tris, 2% vægt / vol SDS, 10% v / v glycerol, 5 mM EDTA, 0,01% vægt / volumen bromphenolblåt, 2% vol / vol β-mercaptoethanol (valgfrit); pH indstilles til 6,8 og opbevares ved stuetemperatur.
      2. Homogenisere cellerne fra et konfluent 100 mm petriskål (~ 8 x 10 6 celler, hvis HEK293, talt ved anvendelse af et hæmocytometer) som beskrevet i afsnit 2.2.
      3. Solubilisere post-nukleare subcellulær fraktion med 0,5% CHAPS (ved hjælp af 2% stamopløsning) og inkubation i ≥2 timer ved 4 ° C under konstant blanding. Centrifuger ved 20.000 xg i 10 min ved 4 ° C for at pelletere det uopløselige material og kassér pillen. Gemme supernatanten betegnet cellelysat.
        BEMÆRK: Optagelsen af ​​et detergent og fjernelse af det uopløselige materiale er absolut nødvendigt for at minimere ikke-specifik binding. . Mellemliggende detergenter, f.eks CHAPS eller Triton X-100, ved en koncentration på 0,2 - 1%, er de mest almindeligt anvendte.
      4. Forbered to separate 1,5 ml rør, og der tilsættes ~ 20 pi (afhængigt IgG-bindingskapacitet) på 6 mg / ml protein-A eller protein-G agarose (eller sepharose) perler. Vask med 200 pi IP-buffer.
        BEMÆRK: Vælg den relevante Ig-bindende harpiks afhængigt af dyreart, der anvendes til at hæve immunpræcipitering antistof. Protein-G binder en bredere vifte af Ig-undertyper sammenlignet med protein-A.
      5. Recover perler ved centrifugering ved 1.500 x g i 2 minutter ved 4 ° C. Gentag vask en gang mere med IP puffer, derefter resuspendere perlerne i 200 pi IP-buffer.
      6. Tilsæt 1 ug (5 ng / pl) af immunpræcipitering antistof eller ikke-immunt IgG (tiltjene som negativ kontrol) i de to separate Protein-A / G med rør. Inkuber i ≥2 timer ved 4 ° C under konstant blanding.
        BEMÆRK: behandle Altid en negativ kontrol med anvendelsen af ​​ikke-immunt IgG rejst i den samme dyreart som immunpræcipitering antistof.
      7. Recover perler ved centrifugering ved 1.500 x g i 2 minutter ved 4 ° C og omhyggeligt supernatanten fjernes ved pipettering.
      8. Overfør 200 ul cellelysat (fra trin 3.1.3) til hver af de to rør med antistof, og protein-A / G-perler. Inkuber i ≥2 timer ved 4 ° C under konstant blanding for at tillade antigen-antistof-binding.
      9. Genoprette perler og vask med 200 pi IP buffer; inkuberes i 10 minutter ved 4 ° C under blanding. Genoprette perler og vask to gange mere (undgå flere skylninger, som vil reducere både de specifikke og ikke-specifik binding). kassere forsigtigt supernatanten ved pipettering.
      10. Tilsæt 30 pi protein-ladningsbuffer til eluering immunoprecipitated proteiner. Centrifuger ved 1.500 xg i 2 min ved 4 ° C, kasseres perlerne og gem supernatanten indeholdende den eluerede co-IP prøve.
      11. At verificere vellykket protein X nedbør, indlæse en lille mængde (1/10, 3 pi) af co-IP prøve på en SDS-PAGE-gel, der skal analyseres ved immunblotting 17 med antistof specifikt for protein X. omfatter en portion af cellelysat at verificere protein X ekspression i din prøve.
      12. For at teste for tilstedeværelsen af co-præcipiteret protein Y, indlæse resten (9/10 th, 27 ul) af co-IP prøve på en separat SDS-PAGE-gel, der skal analyseres ved immunblotting 17 med antistof specifikt for protein Y. omfatter en portion af cellelysatet at verificere protein Y ekspression i din prøve.
    2. Kemisk tværbinding
      1. Forbered følgende buffere:
        1. Cross-linking homogenisering buffer som beskrevet i afsnit 2.2.1.1.
        2. Forbered 5x protein-loading buffer ved at blande 300 mM Tris, 10% vægt / vol SDS, 50% v / v glycerol, 25 mM EDTA, 0,05% vægt / volumen bromphenolblåt, 10% v / v β-mercaptoethanol (valgfrit); justere pH til 6,8 og opbevares ved stuetemperatur; varm ved 50 ° C før brug.
      2. Homogenisere cellerne fra et konfluent 100 mm petriskål (~ 8 x 10 6 celler, hvis HEK293, talt ved anvendelse af et hæmocytometer) som beskrevet i afsnit 2.2.
        BEMÆRK: Saccharose (ved 0,3 M) anvendes til at skabe en iso-osmotisk buffer. Salt, f.eks, 120 - 150 mM NaCl eller KCl kan bruges i stedet, afhængigt af den oligomere proteinkompleks af interesse.
      3. Centrifugeres post-nukleare subcellulær fraktion ved 20.000 xg i 10 min ved 4 ° C for at pelletere proteinaggregater og gem supernatanten. Tage otte portioner af 20 pi hver (typisk ~ 20 ug protein) i separate 0,5 ml rør.
      4. Tilføj 0,0025% v / v glutaraldehyd til alle prøver og starte timeren. Lad hver af de otte prøver reagerer med glutaraldehyde ved stuetemperatur i: 0, 2, 5, 10, 15, 20, 30, 60 min.
        BEMÆRK: Glutaraldehyd har to aldehydgrupper, der reagerer med frie aminer. Undgå at bruge pH buffere eller andre stoffer med primære aminogrupper, fordi de vil standse glutaraldehyd reaktionen.
      5. Stop glutaraldehyd reaktion på det angivne tidspunkt med 2% v / v hydrazin og tilsættes 5 pi 5x protein-loading buffer til at denaturere proteiner.
      6. Fortsæt til SDS-PAGE og immunoblotting 17.

    Representative Results

    I Y2H systemet, agn: er byttedyr interaktion oprindeligt testet af gærvækst selektion i medium, der mangler (tryptophan, leucin og) histidin og efterfølgende vurderes ved β-Gal enzymatisk aktivitetsassays (figur 1). Gær dyrket i medium, der mangler histidin har langsom vækst, der afhænger af styrken af ​​agn: prey protein interaktion. Den β-Gal assayet udføres i gær (dyrket i medium, der mangler kun tryptofan og leucin) enten vokser på fast underlag (agarplader) eller i flydende kultur, med de sidstnævnte ydende kvantitative resultater. Vi har med succes brugt Y2H at identificere domæne-domæne interaktioner inden for RyR2 samt nye protein partnere 2-4,12,21,22. For eksempel har vi screenet en række overlappende konstruktioner spænder over hele længden af ​​RyR2 peptidsekvensen for interaktion med et N-terminalt fragment (AD4L: RyR2 resterne 1 - 906 fusioneret med GAL4 AD). 3 Colony-lift filtrerpapir β-gal assays producerede levende blåfarvet gærkolonier kun for BT4L: AD4L par (figur 2A), hvilket viser, at AD4L interagerer med sig selv, nemlig BT4L konstruktion (RyR2 resterne 1 - 906 fusioneret med GAL4 DNA-BD). blev påvist lyseblå kolonier for BT8: AD4L par antyder en sekundær svagere association med den ekstreme C-terminale domæne (BT8), hvorimod gær co-transformeret med nogen anden konstruktion blev hvid og derfor negativ for agn: prey-protein interaktion. Kvantitative resultater, der er opnået ved flydende β-Gal-analyser (figur 2B), angivne robust BT4L: AD4L interaktion svarer i styrke til den kendte sammenhæng mellem p53-proteinet (pVA3) og SV40 stort T-antigen (pTD1), mens BT8: AD4L interaktion blev betydeligt svagere (<10% i forhold til kontrol).

    Vi rutinemæssigt udføre co-IP eksperimenter (figur 3) following transient ekspression i en mammal cellelinie (HEK293), som en selvstændig biokemisk assay at styrke Y2H resultater 2-4,12-14,21-24. At verificere RyR2 N-terminus selv-interaktion, to separate plasmider kodende for RyR2 resterne 1 - 906 tagget med enten cMyc eller HA peptidepitop (BT4L og AD4L henholdsvis), blev co-transficeret i HEK293-celler under anvendelse af calciumphosphatpræcipitationsfremgangsmåden 3. Den post-nukleare fraktion af homogeniserede celler blev solubiliseret med detergent CHAPS, og det uopløselige materiale blev fjernet ved centrifugering for at fremstille cellelysat. Cellelysatet, behandlet med reduktionsmidlet dithiothreitol, blev derefter inkuberet med Ab HA og protein-A sepharose-perler til at immunpræcipitere HA-mærkede AD4L. Co-IP prøver, der er elueret med SDS-holdig buffer, blev fyldt på to separate SDS-PAGE geler (1/10 og 9/10 th split) og analyseret ved immunblotting med Ab HA og Ab cMyc, respectively. Vellykket direkte IP af AD4L (~ 100 kDa) ved Ab HA blev verificeret ved immunoblotting, men ikke i den negative kontrol ved hjælp af ikke-immun kanin IgG (figur 4A). Vigtigere, cMyc-tagget BT4L (~ 100 kDa) blev udvundet kun i Ab HA IP, og ikke i den negative kontrol i fravær af immunopræcipiteret AD4L (figur 4B).

    Y2H og co-IP-analyser forudsat samstemmende beviser for RyR2 N-terminal selv-interaktion, men de havde ikke informere om oligomerisering status N-terminale domæne, nemlig om det danner kun dimerer eller højere komplekser. Det skal bemærkes, at komplekser vil dissociere og kun omfatter underenheder vil blive detekteret ved SDS-PAGE på grund af SDS-og varmeinduceret proteindenaturering ophævelse protein-protein interaktioner. For at overvinde dette, bruger vi krydsbinding (figur 5), som kemisk og stabilt i konjunktion eksisterende Protein oligomerer, hvis molekylmasse kan derefter undersøges ved SDS-PAGE størrelse separation 2-5. F.eks HEK293 cellehomogenat udtrykker cMyc-BT4L, behandlet med reduktionsmidlet dithiothreitol, omsat med glutaraldehyd og analyseret ved SDS-PAGE og immunoblotting under anvendelse af Ab cMyc (figur 6). Ud over den monomer (~ 100 kDa), et højmolekylært proteinbånd på ~ 400 kDa blev påvist på en tidsafhængig måde, hvilket indikerer RyR2 N-terminus tetramer formation 3. Især tetramer var den fremherskende oligomere arter, med minimal dimer og trimer bånd observeret. For at bestemme den tilsyneladende molekylmasse blev BT4L oligomer adskilt til 4 - 15% gradient SDS-PAGE-geler 3. Vi producerede den molekylære masse / gelretardering standardkurve under anvendelse proteinstandarder med en række på 30 - 460 kDa, og vi beregnet oligomeren til at være 358 kDa 15 (n = 4). Denne tilsyneladende molekylvægt er i overensstemmelse med en BT4L tetramer anbragt i enlukket cirkulær måde frem for i lineær form, som forventet ud fra arrangementet af fire subunits inden det native RyR2 kanal.

    figur 1
    Figur 1. Y2H Flowchart. Gær, co-transformeret med agn og mål plasmider, der er valgt til vækst i medium, der mangler histidin og / eller analyseret for β-Gal enzymatisk aktivitet. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 2
    Figur 2. Y2H foreslår RyR2 N-terminal Domain Self-interaktion. (A) Skematisk skildrer (lokkemad) serie af humane RyR2 overlappende protein fragmenter testet i Y2H system interaktion med RyR2 N-terminale AD4L (bytte) konstrukt. Kvalitative resultater opnået ved koloni-lift filtrerpapir β-gal assays er angivet i "+" multipla eller "-" for negativ vekselvirkning (B) Kvantitativ flydende β-gal assays normaliseret mod den positive kontrol (pVA3 koder for GAL4-DNA-BD. fusion med p53-protein; pTD1 koder for GAL4 AD fusion med SV40 stort T-antigen). Modificeret fra 3. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 3
    Figur 3. Co-IP flowchart. Pattedyrceller, co-transficeret med plasmider X og Y, er homogeniseret og detergent-opløseliggjort til frembringelse af cellelysatet anvendt i co-IP-assayet efterfulgt af SDS-PAGE og immunoblotting.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 4
    Figur 4. Co-IP Angiver RyR2 N-terminus Domain Self-interaktion i pattedyrceller. HEK293-celler blev co-transficeret til transient co-ekspression af cMyc-mærkede (BT4L) og HA-mærkede (AD4L) RyR2 N-terminus domæne ( resterne 1 - 906). AD4L blev immunpræcipiteret med Ab HA fra CHAPS-opløste og dithiothreitol behandlet HEK293 lysat, mens som negative kontrol, co-IP-analyser blev udført med ikke-immunt kanin IgG. Immunopræcipiterede proteiner blev opvarmet ved 85 ° C i 5 minutter og løses ved 20 mA i 3 timer gennem separate 6% SDS-PAGE geler lastet med 1/10 eller 9/10 th af IP prøver. Efter protein overførsel ved 80 V i 2 timer på polyvinylidene difluorid membran, blev immunoblotting-analyse udført ved anvendelse (1: 1.000 fortynding) Ab HA (A) eller Ab cMyc (B), henholdsvis, efterfulgt af peberrodsperoxidase-konjugeret anti-muse-IgG (1: 10.000 fortynding) og forøget kemiluminescens detektion (1 min eksponering). En alikvot af cellelysat, 1/50 th af den mængde forarbejdet i IP prøver, blev også indbefattet for at tjene som molekylmasse standard. Modificeret fra 3. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 5
    Figur 5. Tværbinding flowchart. Mammale celler, transfekteret med plasmid X, homogeniseres og underkastet reaktion med glutaraldehyd i den tværbindende assay, efterfulgt af SDS-PAGE og immunoblotting. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 6
    Figur 6. Tværbinding Indikerer RyR2 N-terminus Domain Tetramer Formation HEK293-celler blev transficeret til transient ekspression af cMyc-mærkede (BT4L) RyR2 N-terminale domæne (resterne 1 - 906).. Cellehomogenatet, behandlet med reduktionsmidlet dithiothreitol, blev inkuberet med glutaraldehyd for de angivne tidspunkter. Prøver blev opvarmet ved 85 ° C i 5 minutter og opløst ved SDS-PAGE (6% gel) ved 20 mA i 3 timer. Efter protein overførsel ved 80 V i 2 timer på polyvinylidendifluoridmembran, blev immunoblotting-analyse udført ved anvendelse (1: 1.000 fortynding) Ab cMyc, efterfulgt af peberrodsperoxidase-konjugeret anti-muse-IgG (1:10.000 fortynding) og forøget kemiluminescens-detektion (1 min eksponering). Monomer (M: ~ 100 kDa) og tetramere (T) former er angivet med pilene. Modificeret fra 3. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Discussion

    Dannelsen af protein homo-oligomerer er en fundamental biologisk proces, der regulerer aktiviteten af transkriptionsfaktorer, enzymer, ionkanaler og receptorer 25,26. Vigtigere, protein oligomerisering har også patologiske implikationer herunder neurodegeneration og arytmier hjertesygdom 4,27. De metoder, der er skitseret i denne artikel anvendes til at identificere domæne-domæne interaktioner medierer protein selvstændig forening og oligomerisering. Nedenfor vi peger på kritiske trin i hver protokol, og vi diskuterer vigtige overvejelser, begrænsninger og fejlfinding.

    Det Y2H Systemet kan anvendes først til at screene for potentielle interagerende protein partnere på grund af sin relativt høje throughput screening, brugervenlighed og højt reproducerbare resultater. Y2H procedurer gennemføres i en mikrobiologiske laboratorium med standard (plade eller shaker) inkubatorer og rum inddæmning faciliteter. Anvendelsen af ​​freshly forberedt kompetente celler (trin 1.1.8) er afgørende for høj effektivitet gær transformation, mens der for de bedste resultater i β-Gal-analyser, frisk dyrket gær kolonier (op til 5 dage gammel) bør anvendes (trin 1.2.3). Systemer baseret på andre end GAL4 og / eller yderligere / alternative reportergener transkriptionsfaktorer er til rådighed, og derfor agn og bytte plasmider skal matches med passende Y2H stamme.

    Nogle stammer bør være dyrket i nærvær af 3-amino-1,2,4-triazol, en kompetitiv inhibitor af HIS3 proteinet, for at quenche eventuelt konstitutiv ekspression af HIS3-reportergenet 7,8. Angivelse af agn og target fusionsproteiner skal kontrolleres ved immunblotting 17. I tilfælde agn / byttedyr fusionsproteiner er giftige for gær, kunne lavere tolerable proteinniveauer opnås ved kloning i forskellige vektorer, hvor agn / bytte ekspression drives af en anden promotor. Endvidere er det vigtigt at sikre that agn / bytte fusionsproteiner ikke vise autonom reporter gen aktivitet. Autonome reportergenaktivering kan reddes ved at ændre konstruktionen til at fjerne den ansvarlige region, eller ved at bytte den GAL4 DNA-BD og AD fusioner for de to testede proteiner. Desuden er transmembrane domæner bedre udeladt fra agn / prey konstruktioner, fordi de kan inducere misfoldning eller mislocalization af fusionsproteiner i intracellulære membran rum. Faktisk største ulempe ved Y2H system er, at agn og målproteiner er lokaliseret i gæren kernen væk fra deres fysiologiske subcellulære lokalisering og potentielt mangler specifikke post-translationelle modifikationer, hvilket resulterer i falsk-positive eller falsk-negative interaktioner 6-9 .

    Mammale heterologe ekspressionssystemer er bedre egnet til undersøgelse af mammale integrale membranproteiner med hensyn til konformation posttranslationelle modifikationer og subcellulær lokalisering.En af de mest udbredte celle transfektion metoder er calciumphosphat nedbør, primært på grund af den minimale udstyr og reagenser krævede 11,15. Alternative metoder, nemlig elektroporering, liposomer, kationiske lipider og polymerer, kan give højere transfektionseffektivitet afhængigt af cellelinjen og konstruere brugte. I almindelighed er de primære faktorer, der påvirker transfektionseffektivitet er plasmid-DNA kvalitet og celle sundhed / levedygtighed. De bedste resultater opnås, når der anvendes plasmid-DNA af højeste renhed (260 nm / 280 nm absorbans forholdet ~ 1.8) og aktivt delende celler. Celler bør derfor transficeres på intet over 60 - 70% konfluens (trin 2.1.2), fordi evnen til at optage fremmed DNA er relateret til overfladearealet af cellen udsættes for mediet 11. Derudover er optagelsen af antibiotika i dyrkningsmediet under transfektion (trin 2.1.3) ikke anbefales på grund af øget celledød 15.

    Feller calciumphosphatpræcipitation især omhyggelig forberedelse og pH-justering (til 7,05 præcist) i 2x HBS opløsning (trin 2.1.1), og korrekt dannelse af plasmid-DNA / calcium / phosphat komplekser ved kraftig blanding (trin 2.1.5) er kritiske trin for højeffektiv transfektion. Typisk proteinekspression ved forbigående transfektionsforsøg toppe indenfor 24 - 72 timer.

    Når celler høstes, skal efterfølgende procedurer udføres ved 4 ° C for at minimere proteaseaktivitet, og anbefales tilsætning af proteaseinhibitorer. Celle homogenisering bør efterfølges af en centrifugering til fjernelse kerner fordi kromosomalt DNA kan øge opløsningens viskositet og fremme ikke-specifik binding. Således er homogenisering ved mekaniske midler i en iso-osmotisk buffer foretrækkes, sædvanligvis i (0,3 M) saccharose eller (150 mM) NaCl. I almindelighed er saccharose-baserede buffere kendt for at forstærke proteinstabilitet og reducere potentielle ikke-native protein aggregation, men på grund af preferentiel hydrering på proteinet overfladen, er elektrostatiske protein-protein interaktioner begunstiget. Omvendt saltbaserede buffere påvirker nettoladning ladet aminosyre sidegrupper på proteinet overflade og har således en bias i retning af mere hydrofobe-baserede interaktioner 28.

    Co-IP er den mest almindeligt anvendte biokemisk assay til at vurdere protein-protein interaktioner især fra nativt væv. Dets vigtigste ulempe er kravet om meget specifikke antistoffer valideret til brug i IP og immunblotting 10,16,18. Således er rekombinante proteiner ofte mærket med en peptidepitop, f.eks., Influenza hemagglutinin (YPYDVPDYA) eller humant cMyc (EQKLISEEDL), for hvilke specifikke antistoffer med høj affinitet er kommercielt tilgængelige. Om ønsket kan den immunpræcipitering antistoffet være kemisk konjugeret på protein A harpiks for at undgå dets eluering og detektion under immunoblotting fase, der kan tilsløre co-udfældede protein 16; at opnå dette, har vi med succes brugt det kemiske cross-linker 3,3'-dithiobis (sulfosuccinimidylpropionat) 24. Det er bydende nødvendigt, at en passende detergent er inkluderet i undersøgelsesperioden buffer og det uopløselige materiale af homogeniserede celler fjernes ved centrifugering for at minimere ikke-specifik binding (trin 3.1.3). Valget og koncentrationen af ​​detergent er vigtige overvejelser: stærkere detergenter og / eller højere koncentrationer vil væsentligt reducere ikke-specifik binding, men kan også afskaffe X: Y protein-interaktion, hvorimod lavere koncentrationer eller mildere detergenter kan tillade en svag interaktion, der skal overholdes, men kan resultere i overdreven ikke-specifik binding. Mellemliggende styrke detergenter foretrækkes, fx Triton X-100 0.5 -. 1% koncentration. For yderligere at reducere ikke-specifik binding, en neutral protein (fx okseserumalbumin ved 100 ug / ml) kan indgå i undersøgelsesperioden puffer, og / eller cellelysatet kan præ-Cleared med forudgående inkubation med protein-A-harpiks alene. Antal vask bør optimeres for X: Y pair testet, typisk tre 10-minutters vaske med IP puffer (trin 3.1.9). Under alle omstændigheder bør en co-IP prøve med ikke-immunt IgG som immunpræcipitering antistof altid behandles parallelt for at tjene som negativ kontrol (trin 3.1.6).

    Den største fordel ved kemisk tværbinding er, at den informerer om den støkiometriske sammensætning af proteinet homo-oligomer. Glutaraldehyd er et almindeligt anvendt tværbinder fordi det kræver ingen specialudstyr og det genererer termisk og kemisk stabile tværbindinger mellem interagerende proteiner 19,20. Forbindelser med frie aminogrupper bør udelades fra assay buffere (trin 3.2.1), fordi de vil udslukke den kemiske reaktion. Glutaraldehydkoncentrationen og reaktionstiden (trin 3.2.4) optimeres for den oligomere proteinkompleks af interesse. Den største ulempe ved denne teknik, especiallierede når udført på helcellepræparater, er den ikke-specificitet af den kemiske reaktion, der kunne give kunstige proteinaggregater, der mangler biologisk betydning.

    Alternativ in vivo (f.eks., Fluorescensresonansenergioverførsel, bi-molekylære fluorescens eller luminescens komplementering) og in vitro-teknikker (f.eks., Gelpermeationskromatografi, analytisk ultracentrifugering, isotermisk titrering kalorimetri) er tilgængelige til karakterisering af protein selvassociering og vurdering af oligomerisering støkiometri 29,30. Hver metode har sine egne fordele og ulemper, og det kan være mere egnet til studiet af et specifikt protein, afhængigt af proteinoprensning / stabilitet og tilgængelighed udstyr / reagens. De tre komplementære fremgangsmåder beskrevet her i detaljer, nemlig Y2H, co-IP og tværbinding, er blevet anvendt i kombination til at tilvejebringe overbevisende dokumentation for RyR2 homo-oligomer dannelse i isolation og i en levende celle.

    Disclosures

    Forfatterne har ikke noget at erklære.

    Acknowledgments

    Dette arbejde blev støttet af British Heart Foundation stipendier til SZ (FS / 08/063 og FS / 15/30/31494).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    PART 1 yeast two-hybrid
    Plate incubator Hereaus B6120 Used at 30 °C
    Orbital shaker incubator New Brunswick Scientific INNOVA 4300 Used at 30 °C with shaking at 230 - 250 rpm
    Spectrophotometer Perkin Elmer Lambda Bio+ To measure OD600 of yeast culture; to measure Absorbance at 420 nm in liquid b-Gal assay
    Matchmaker Two-Hybrid System 2 Kit Takara Clontech K1604-1 Contains bait vector pGBKT7, prey vector pACT2  and yeast strain Y190 
    Yeast Nitrogen Base Sigma-Aldrich Y0626 To prepare minimal SD growh medium 
    Dropout supplement lacking leucine and tryptophan Sigma-Aldrich Y0750 To prepare minimal SD growh medium 
    Dropout supplement lacking leucine, tryptophan, histidine Sigma-Aldrich Y2001 To prepare minimal SD growh medium 
    Herring testes carrier DNA  Takara Clontech 630440 For yeast transformation
    Whatman filter paper Grade 5  Sigma-Aldrich WHA1005070 for use in colony-lift filter paper b-Gal assay
    X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) Sigma-Aldrich B4252 for use in colony-lift filter paper b-Gal assay
    ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside) Sigma-Aldrich N1127 for use in liquid b-Gal assay
    PART 2. Protein expression in a mammalian cell line
    HEK293 cell line ATCC ATCC® CRL-1573™
    Humidified incubator (5% CO2, 37 °C) SANYO MCO-18AIC To culture mammalian cells
    DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium) Invitrogen (ThermoFisher) 41966 To prepare growth medium for mammalian cells
    Fetal Bovine Serum Invitrogen (ThermoFisher) 10500 To prepare growth medium for mammalian cells
    Glass beads Sigma-Aldrich G8772 To homogenise cells
    Needle 23 G (0.6 x 30 mm) BD Microlance 300700 To homogenise cells
    Protease inhibitor cocktail (Complete)  Roche 11873508001 To prevent proteolysis
    PART 3. In vitro biochemical methods 
    Mini-PROTEAN Tetra Cell (SDS-PAGE system) Bio-Rad 1658000EDU  For polyacrylamide gel electrophoresis
    Trans-Blot SD (Semi-dry transfer system) Bio-Rad 1703940 For electrophoretic transfer
    Compact X-ray film processor Xograph X4 For use in immunoblotting
    Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882 For use in chemical cross-linking
    Protein-A sepharose beads  GE Healthcare Life Sciences 17-5280-01  For use in co-IP assay
    Anti-HA (Y-11 rabbit polyclonal IgG) Santa Cruz Biotechnology sc-805 For use in co-IP assay
    Non-immune rabbit IgG Santa Cruz Biotechnology  sc-2027 For use in co-IP assay
    Anti-cMyc (9E10 mouse monoclonal IgG) Santa Cruz Biotechnology  sc-40 For use in immunoblotting
    Anti-HA (16B12 mouse monoclonal IgG) Covance MMS-101P For use in immunoblotting
    Anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz Biotechnology sc-2005 For use in immunoblotting
    Hyperfilm ECL GE Healthcare Life Sciences 28906836 For use in immunoblotting
    ECL Western Blotting Substrate Pierce (ThermoFisher) 32106 For use in immunoblotting

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Seidel, M., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. Structural and functional interactions within ryanodine receptor. Biochem Soc Trans. 43 (3), 377-383 (2015).
    2. Zissimopoulos, S., Marsh, J., Stannard, L., Seidel, M., Lai, F. A. Amino-terminus oligomerisation is conserved in intracellular calcium release channels. Biochem J. 459 (2), 265-273 (2014).
    3. Zissimopoulos, S., et al. N-terminus oligomerization regulates the function of cardiac ryanodine receptors. J Cell Sci. 126 (Pt 21), 5042-5051 (2013).
    4. Seidel, M., Thomas, N. L., Williams, A. J., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. Dantrolene rescues aberrant N-terminus inter-subunit interactions in mutant pro-arrhythmic cardiac ryanodine receptors. Cardiovasc Res. 105 (1), 118-128 (2015).
    5. Stewart, R., Zissimopoulos, S., Lai, F. Oligomerization of the cardiac ryanodine receptor C-terminal tail. Biochem J. 376, 795-799 (2003).
    6. Deane, C. M., Salwinski, L., Xenarios, I., Eisenberg, D. Protein interactions: two methods for assessment of the reliability of high throughput observations. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 349-356 (2002).
    7. Fashena, S. J., Serebriiskii, I., Golemis, E. A. The continued evolution of two-hybrid screening approaches in yeast: how to outwit different preys with different baits. Gene. 250 (1-2), 1-14 (2000).
    8. Stynen, B., Tournu, H., Tavernier, J., Van Dijck, P. Diversity in genetic in vivo methods for protein-protein interaction studies: from the yeast two-hybrid system to the mammalian split-luciferase system. Microbiol Mol Biol Rev. 76 (2), 331-382 (2012).
    9. Yang, M., Wu, Z., Fields, S. Protein-peptide interactions analyzed with the yeast two-hybrid system. Nucleic Acids Res. 23 (7), 1152-1156 (1995).
    10. Elion, E. A. Chapter 8, Detection of protein-protein interactions by coprecipitation. Curr Protoc Immunol. , (2007).
    11. Kingston, R. E., Chen, C. A., Rose, J. K. Chapter 9, Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Mol Biol. , (2003).
    12. Lam, A. K., Galione, A., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. Hax-1 identified as a two-pore channel (TPC)-binding protein. FEBS letters. , (2013).
    13. Zissimopoulos, S., Lai, F. Interaction of FKBP12.6 with the cardiac ryanodine receptor C-terminal domain. J Biol Chem. 280, 5475-5485 (2005).
    14. Zissimopoulos, S., Thomas, N. L., Jamaluddin, W. W., Lai, F. A. FKBP12.6 binding of ryanodine receptors carrying mutations associated with arrhythmogenic cardiac disease. Biochem J. 419 (2), 273-278 (2009).
    15. Jordan, M., Wurm, F. Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate. Methods. 33 (2), 136-143 (2004).
    16. Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods Mol Biol. 424, 349-364 (2008).
    17. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
    18. Yang, W., Steen, H., Freeman, M. R. Proteomic approaches to the analysis of multiprotein signaling complexes. Proteomics. 8 (4), 832-851 (2008).
    19. Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37 (5), 790-796 (2004).
    20. Wine, Y., Cohen-Hadar, N., Freeman, A., Frolow, F. Elucidation of the mechanism and end products of glutaraldehyde crosslinking reaction by X-ray structure analysis. Biotechnol Bioeng. 98 (3), 711-718 (2007).
    21. Zissimopoulos, S., Lai, F. Central domain of the human cardiac muscle ryanodine receptor does not mediate interaction with FKBP12.6. Cell Biochem Biophys. 43, 203-220 (2005).
    22. Zissimopoulos, S., West, D., Williams, A., Lai, F. Ryanodine receptor interaction with the SNARE-associated protein snapin. J Cell Sci. 119, 2386-2397 (2006).
    23. Zissimopoulos, S., Docrat, N., Lai, F. Redox sensitivity of the ryanodine receptor interaction with FK506-binding protein. J Biol Chem. 282, 6976-6983 (2007).
    24. Zissimopoulos, S., Seifan, S., Maxwell, C., Williams, A. J., Lai, F. A. Disparities in the association of the ryanodine receptor and the FK506-binding proteins in mammalian heart. J Cell Sci. 125. 125 (Pt 7), 1759-1769 (2012).
    25. Ali, M. H., Imperiali, B. Protein oligomerization: how and why. Bioorg Med Chem. 13 (17), 5013-5020 (2005).
    26. Hashimoto, K., Panchenko, A. R. Mechanisms of protein oligomerization, the critical role of insertions and deletions in maintaining different oligomeric states. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20352-20357 (2010).
    27. Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 101-112 (2007).
    28. Chi, E. Y., Krishnan, S., Randolph, T. W., Carpenter, J. F. Physical stability of proteins in aqueous solution: mechanism and driving forces in nonnative protein aggregation. Pharm Res. 20 (9), 1325-1336 (2003).
    29. Gell, D. A., Grant, R. P., Mackay, J. P. The detection and quantitation of protein oligomerization. Adv Exp Med Biol. 747, 19-41 (2012).
    30. Kaczor, A. A., Selent, J. Oligomerization of G protein-coupled receptors: biochemical and biophysical methods. Curr Med Chem. 18 (30), 4606-4634 (2011).

    Tags

    Molecular Biology kemisk tværbinding co-immnoprecipitation pattedyrscelle transfektion oligomerisering ryanodine receptor selv-association gær to-hybrid
    Genetiske og Biokemiske metoder til<em&gt; In vivo</em&gt; og<em&gt; In vitro</em&gt; Vurdering af Protein Oligomerisering: Den Ryanodine Receptor Case Study
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Stanczyk, P. J., Lai, F. A.,… More

    Stanczyk, P. J., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study. J. Vis. Exp. (113), e54271, doi:10.3791/54271 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter