Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.
Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by β-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.
Skelet- og hjertemuskel sammentrækning udløses af reticulum Ca 2+ frigivelse medieret af RyR. Der er tre mammale Ryr isoformer med den funktionelle kanal bestående af fire identiske underenheder. Hver RyR subunit består af et stort cytoplasmatisk regulatorisk N-terminale del og en lille C-terminale del indeholdende de transmembrane domæner, der danner en høj konduktans Ca2 + pore. Unormal intra- og inter-subunit interaktioner ligger til grund RyR kanal dysfunktion og resultere i neuromuskulære og hjertesygdomme 1. Identifikation og karakterisering af specifikke domæner involveret i RyR struktur: function forhold er derfor afgørende for forståelsen af RyR patofysiologi.
Traditionelle biokemiske protein-protein-interaktion teknikker kræver betydelige mængder oprenset protein, ofte produceres i bakterier. Dette er ikke muligt i tilfælde af RyR, en meget stor membran protein består af ~ 5000 aminosyrer, hvorimod dens rekombinante fragmenter er ikke let modtagelig for bakteriel ekspression og oprensning. Således er alternative ekspressionssystemer omfatter eukaryote værtsceller kræves for mammale integrale membranproteiner. Vi har tidligere beskæftiget Y2H, co-IP og cross-linking assays til kollektivt vise, at N-terminale tetrameriseringsdomæne er et strukturelt træk, der er bevaret på tværs af tre pattedyr RyR isoformer 2,3. Vigtigere er, har vi fundet, at en enkelt punktmutation forbundet med arytmier hjertesygdom afbryder N-terminus selvassociering og resulterer i en dysfunktionel RyR kanal 4. Vi har også anvendt disse teknikker til at oligomeriserende undersøgelser af RyR cytoplasmatiske C-terminale hale 5 samt den N-terminale ende af det homologe intracellulær Ca2 + udgivelseskanalen, inositol 1,4,5 triphosphat receptor 2.
I Y2H assay interactipå mellem to proteiner (X og Y) måles ved rekonstituering af et funktionelt transkriptionsfaktor (GAL4) og den efterfølgende aktivering af reportergener 6-9. To forskellige kloningsvektorer bruges til at generere fusioner af de to testede proteiner med de to fysisk adskillelige, uafhængige domæner af GAL4: DNA-bindende domæne (DNA-BD) / protein X fusion (lokkemad) og aktiverende domæne (AD) / protein Y fusion (mål). Den Y2H kan bruges til at teste, om et protein interagerer med sig selv ved at generere GAL4 DNA-BD og AD fusioner af det samme protein. Genetisk modificerede Y2H stammer GAL4 og GAL80 deficiente (den GAL80-proteinet er en repressor af GAL4), samt TRP1 og LEU2 deficient (for at tilvejebringe ernæringsmæssig selektion for agn og prey plasmider, henholdsvis). I gæren kernen, er de rekombinante DNA-BD og AD peptider bringes i tæt fysisk nærhed for at frembringe en hybrid GAL4 transkriptionsfaktor kun gennem deres fusioner 'X: Y interaction. Denne fremgangsmåde muliggør hurtig genetisk screening til påvisning af protein-protein-interaktioner gennem den parallelle transkriptionel aktivering af prototrofisk (HIS3 kodende for et enzym er nødvendigt for histidin-biosyntese) og kromogen (LacZ koder for β-galactosidase (β-Gal)) reportergener. Den største fordel ved Y2H er, at det er en in vivo assay, der detekterer selv svage eller forbigående protein-protein interaktioner. Endvidere detektion involverer simpel brug af udvælgelse vækst (i medier, der mangler histidin) eller af et kolorimetrisk (β-Gal) assay uden behov for oprensning af agn og målproteiner eller genereringen af specifikke antistoffer. Derudover kan Y2H anvendes til at screene en samling af tilfældige ukendte kloner (cDNA-bibliotek kloner fusioneret til GAL4 AD) til hidtil ukendte bindingspartnere af en lokkemad protein, også giver direkte adgang til cDNA'et af biblioteket protein.
At udvide Y2H observationer, uafskellige biokemiske teknikker kan anvendes. Co-IP og cross-linking analyser kombineret med immunoblotting anvendes til at opdage protein foreninger i komplekse prøve blandinger metoder, f.eks., Helcellelysater 10. Deres største fordel er, at de rapporterer om protein-protein interaktioner fra nativt væv, i modsætning til andre metoder, der kræver brug af rekombinante proteiner. Rekombinante proteiner kan også anvendes, typisk udtrykt i en mammal cellelinie, hvor de sandsynligvis vil have deres korrekte konformation og posttranslationelle modifikationer, såvel som subcellulære lokalisering. Da co-IP og tværbinding er in vitro-assays, der gør brug af homogeniserede celler, er det nødvendigt at bekræfte, om de to proteinpartnere co-lokaliseret i den intakte celle 11. Vi anvender rutinemæssigt transfektion af mammale HEK293-celler til transient udtrykker pattedyr-integral membran og cytosoliske proteiner under anvendelse af calciumphosphatpræcipitationsfremgangsmåden 2-4,12-14, Beskrives her i detaljer. Dette er en billig måde til effektivt at levere plasmid-DNA'et i celler, men den er afhængig af den særlige cellelinie anvendes, og celle konfluens, samt renheden af plasmid-DNA'et 11,15.
Co-IP assay involverer isolering af det native eller rekombinant protein af interesse fra cellelysater under ikke-denaturerende betingelser, der muliggør co-oprensning af formodede interaktionspartnere 10,16. Den kræver anvendelse af to uafhængige antistoffer, den immunpræcipitering antistof til isolering af protein X, og immunoblotting antistof til påvisning af protein partner Y. Det kan bruges til at teste, om et protein interagerer med sig selv ved at generere to forskellige fusioner med to forskellige epitop tags (f.eks., HA og cMyc). Den immunpræcipitering antistof er bundet gennem sin Fc-region på protein-A (eller protein-G, afhængigt af dyrearten, hvor antistoffet blev rejst), somer konjugeret til agarose (eller sepharose) harpiks. Protein X udfældes ved antistof: Protein-A harpiks efter inkubation med cellelysatet, nemlig detergent-opløselige fraktion af homogeniserede celler. Protein-immuno-komplekser elueres med SDS-holdig buffer og efterfølgende analyseret ved SDS-PAGE og immunoblotting under anvendelse af et antistof til påvisning af tilstedeværelsen af protein Y 17. Co-IP bør udføres med detergent-opløselige proteiner for at undgå overdreven ikke-specifik binding. Valget af vaskemiddel og dets koncentration, samt antal vask, bør optimeres for hver X: Y pair 10,16,18.
Tværbinding anvendes til at bestemme støkiometrien af den oligomere proteinkompleks. Den er baseret på en kemisk reaktion til at skabe covalente bindinger mellem tilstødende interagerende protomerer, og derfor er det muliggør bevarelse af proteinets oligomere status under SDS-PAGE separation. Der er talrige tværbinding ReageNTS af forskellig længde og kemi målrettet forskellige reaktive grupper på proteiner, typisk primære aminer, carboxyl- eller thiolgrupper. Her beskriver vi anvendelsen af glutaraldehyd (OHC (CH2) 3 CHO), en homo-bifunktionelle tværbindingsmiddel med to aldehydgrupper i begge ender, der reagerer med frie aminogrupper til stede i lysinrester 19,20. Tværbinding følges i en koncentrations- eller tidsafhængig måde resulterer i adduktdannelse. Glutaraldehyd Reaktionen standses med hydrazin (H 2 NNH 2) og protein Derefter analyseres prøverne ved SDS-PAGE og immunoblotting 17 at evaluere deres oligomerisering tilstand. Vi bør bemærke, at cross-linking ikke inducerer oligomerisering men blot skaber stabile broer mellem allerede eksisterende proteinkomplekser. Vigtige overvejelser, når udfører tværbindingsforsøg omfatter valg af cross-linker, dens koncentration og reaktionstid 19,20.
Dannelsen af protein homo-oligomerer er en fundamental biologisk proces, der regulerer aktiviteten af transkriptionsfaktorer, enzymer, ionkanaler og receptorer 25,26. Vigtigere, protein oligomerisering har også patologiske implikationer herunder neurodegeneration og arytmier hjertesygdom 4,27. De metoder, der er skitseret i denne artikel anvendes til at identificere domæne-domæne interaktioner medierer protein selvstændig forening og oligomerisering. Nedenfor vi peger på kritiske trin i hver protokol, og vi diskuterer vigtige overvejelser, begrænsninger og fejlfinding.
Det Y2H Systemet kan anvendes først til at screene for potentielle interagerende protein partnere på grund af sin relativt høje throughput screening, brugervenlighed og højt reproducerbare resultater. Y2H procedurer gennemføres i en mikrobiologiske laboratorium med standard (plade eller shaker) inkubatorer og rum inddæmning faciliteter. Anvendelsen af freshly forberedt kompetente celler (trin 1.1.8) er afgørende for høj effektivitet gær transformation, mens der for de bedste resultater i β-Gal-analyser, frisk dyrket gær kolonier (op til 5 dage gammel) bør anvendes (trin 1.2.3). Systemer baseret på andre end GAL4 og / eller yderligere / alternative reportergener transkriptionsfaktorer er til rådighed, og derfor agn og bytte plasmider skal matches med passende Y2H stamme.
Nogle stammer bør være dyrket i nærvær af 3-amino-1,2,4-triazol, en kompetitiv inhibitor af HIS3 proteinet, for at quenche eventuelt konstitutiv ekspression af HIS3-reportergenet 7,8. Angivelse af agn og target fusionsproteiner skal kontrolleres ved immunblotting 17. I tilfælde agn / byttedyr fusionsproteiner er giftige for gær, kunne lavere tolerable proteinniveauer opnås ved kloning i forskellige vektorer, hvor agn / bytte ekspression drives af en anden promotor. Endvidere er det vigtigt at sikre that agn / bytte fusionsproteiner ikke vise autonom reporter gen aktivitet. Autonome reportergenaktivering kan reddes ved at ændre konstruktionen til at fjerne den ansvarlige region, eller ved at bytte den GAL4 DNA-BD og AD fusioner for de to testede proteiner. Desuden er transmembrane domæner bedre udeladt fra agn / prey konstruktioner, fordi de kan inducere misfoldning eller mislocalization af fusionsproteiner i intracellulære membran rum. Faktisk største ulempe ved Y2H system er, at agn og målproteiner er lokaliseret i gæren kernen væk fra deres fysiologiske subcellulære lokalisering og potentielt mangler specifikke post-translationelle modifikationer, hvilket resulterer i falsk-positive eller falsk-negative interaktioner 6-9 .
Mammale heterologe ekspressionssystemer er bedre egnet til undersøgelse af mammale integrale membranproteiner med hensyn til konformation posttranslationelle modifikationer og subcellulær lokalisering.En af de mest udbredte celle transfektion metoder er calciumphosphat nedbør, primært på grund af den minimale udstyr og reagenser krævede 11,15. Alternative metoder, nemlig elektroporering, liposomer, kationiske lipider og polymerer, kan give højere transfektionseffektivitet afhængigt af cellelinjen og konstruere brugte. I almindelighed er de primære faktorer, der påvirker transfektionseffektivitet er plasmid-DNA kvalitet og celle sundhed / levedygtighed. De bedste resultater opnås, når der anvendes plasmid-DNA af højeste renhed (260 nm / 280 nm absorbans forholdet ~ 1.8) og aktivt delende celler. Celler bør derfor transficeres på intet over 60 – 70% konfluens (trin 2.1.2), fordi evnen til at optage fremmed DNA er relateret til overfladearealet af cellen udsættes for mediet 11. Derudover er optagelsen af antibiotika i dyrkningsmediet under transfektion (trin 2.1.3) ikke anbefales på grund af øget celledød 15.
Feller calciumphosphatpræcipitation især omhyggelig forberedelse og pH-justering (til 7,05 præcist) i 2x HBS opløsning (trin 2.1.1), og korrekt dannelse af plasmid-DNA / calcium / phosphat komplekser ved kraftig blanding (trin 2.1.5) er kritiske trin for højeffektiv transfektion. Typisk proteinekspression ved forbigående transfektionsforsøg toppe indenfor 24 – 72 timer.
Når celler høstes, skal efterfølgende procedurer udføres ved 4 ° C for at minimere proteaseaktivitet, og anbefales tilsætning af proteaseinhibitorer. Celle homogenisering bør efterfølges af en centrifugering til fjernelse kerner fordi kromosomalt DNA kan øge opløsningens viskositet og fremme ikke-specifik binding. Således er homogenisering ved mekaniske midler i en iso-osmotisk buffer foretrækkes, sædvanligvis i (0,3 M) saccharose eller (150 mM) NaCl. I almindelighed er saccharose-baserede buffere kendt for at forstærke proteinstabilitet og reducere potentielle ikke-native protein aggregation, men på grund af preferentiel hydrering på proteinet overfladen, er elektrostatiske protein-protein interaktioner begunstiget. Omvendt saltbaserede buffere påvirker nettoladning ladet aminosyre sidegrupper på proteinet overflade og har således en bias i retning af mere hydrofobe-baserede interaktioner 28.
Co-IP er den mest almindeligt anvendte biokemisk assay til at vurdere protein-protein interaktioner især fra nativt væv. Dets vigtigste ulempe er kravet om meget specifikke antistoffer valideret til brug i IP og immunblotting 10,16,18. Således er rekombinante proteiner ofte mærket med en peptidepitop, f.eks., Influenza hemagglutinin (YPYDVPDYA) eller humant cMyc (EQKLISEEDL), for hvilke specifikke antistoffer med høj affinitet er kommercielt tilgængelige. Om ønsket kan den immunpræcipitering antistoffet være kemisk konjugeret på protein A harpiks for at undgå dets eluering og detektion under immunoblotting fase, der kan tilsløre co-udfældede protein 16; at opnå dette, har vi med succes brugt det kemiske cross-linker 3,3'-dithiobis (sulfosuccinimidylpropionat) 24. Det er bydende nødvendigt, at en passende detergent er inkluderet i undersøgelsesperioden buffer og det uopløselige materiale af homogeniserede celler fjernes ved centrifugering for at minimere ikke-specifik binding (trin 3.1.3). Valget og koncentrationen af detergent er vigtige overvejelser: stærkere detergenter og / eller højere koncentrationer vil væsentligt reducere ikke-specifik binding, men kan også afskaffe X: Y protein-interaktion, hvorimod lavere koncentrationer eller mildere detergenter kan tillade en svag interaktion, der skal overholdes, men kan resultere i overdreven ikke-specifik binding. Mellemliggende styrke detergenter foretrækkes, fx Triton X-100 0.5 -. 1% koncentration. For yderligere at reducere ikke-specifik binding, en neutral protein (fx okseserumalbumin ved 100 ug / ml) kan indgå i undersøgelsesperioden puffer, og / eller cellelysatet kan præ-Cleared med forudgående inkubation med protein-A-harpiks alene. Antal vask bør optimeres for X: Y pair testet, typisk tre 10-minutters vaske med IP puffer (trin 3.1.9). Under alle omstændigheder bør en co-IP prøve med ikke-immunt IgG som immunpræcipitering antistof altid behandles parallelt for at tjene som negativ kontrol (trin 3.1.6).
Den største fordel ved kemisk tværbinding er, at den informerer om den støkiometriske sammensætning af proteinet homo-oligomer. Glutaraldehyd er et almindeligt anvendt tværbinder fordi det kræver ingen specialudstyr og det genererer termisk og kemisk stabile tværbindinger mellem interagerende proteiner 19,20. Forbindelser med frie aminogrupper bør udelades fra assay buffere (trin 3.2.1), fordi de vil udslukke den kemiske reaktion. Glutaraldehydkoncentrationen og reaktionstiden (trin 3.2.4) optimeres for den oligomere proteinkompleks af interesse. Den største ulempe ved denne teknik, especiallierede når udført på helcellepræparater, er den ikke-specificitet af den kemiske reaktion, der kunne give kunstige proteinaggregater, der mangler biologisk betydning.
Alternativ in vivo (f.eks., Fluorescensresonansenergioverførsel, bi-molekylære fluorescens eller luminescens komplementering) og in vitro-teknikker (f.eks., Gelpermeationskromatografi, analytisk ultracentrifugering, isotermisk titrering kalorimetri) er tilgængelige til karakterisering af protein selvassociering og vurdering af oligomerisering støkiometri 29,30. Hver metode har sine egne fordele og ulemper, og det kan være mere egnet til studiet af et specifikt protein, afhængigt af proteinoprensning / stabilitet og tilgængelighed udstyr / reagens. De tre komplementære fremgangsmåder beskrevet her i detaljer, nemlig Y2H, co-IP og tværbinding, er blevet anvendt i kombination til at tilvejebringe overbevisende dokumentation for RyR2 homo-oligomer dannelse i isolation og i en levende celle.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af British Heart Foundation stipendier til SZ (FS / 08/063 og FS / 15/30/31494).
1. PART 1 yeast two-hybrid | |||
Plate incubator | Hereaus | B6120 | Used at 30°C |
Orbital shaker incubator | New Brunswick Scientific | INNOVA 4300 | Used at 30°C with shaking at 230-250 rpm |
Spectrophotometer | Perkin Elmer | Lambda Bio+ | To measure OD600 of yeast culture; to measure Absorbance at 420 nm in liquid b-Gal assay |
Matchmaker Two-Hybrid System 2 Kit | Takara Clontech | K1604-1 | Contains bait vector pGBKT7, prey vector pACT2 and yeast strain Y190 |
Yeast Nitrogen Base | Sigma-Aldrich | Y0626 | To prepare minimal SD growh medium |
Dropout supplement lacking leucine and tryptophan | Sigma-Aldrich | Y0750 | To prepare minimal SD growh medium |
Dropout supplement lacking leucine, tryptophan, histidine | Sigma-Aldrich | Y2001 | To prepare minimal SD growh medium |
Herring testes carrier DNA | Takara Clontech | 630440 | For yeast transformation |
Whatman filter paper Grade 5 | Sigma-Aldrich | WHA1005070 | for use in colony-lift filter paper b-Gal assay |
X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) | Sigma-Aldrich | B4252 | for use in colony-lift filter paper b-Gal assay |
ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside) | Sigma-Aldrich | N1127 | for use in liquid b-Gal assay |
PART 2. Protein expression in a mammalian cell line | |||
HEK293 cell line | ATCC | ATCC® CRL-1573™ | |
Humidified incubator (5% CO2, 37 °C) | SANYO | MCO-18AIC | To culture mammalian cells |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium) | Invitrogen (ThermoFisher) | 41966 | To prepare growth medium for mammalian cells |
Fetal Bovine Serum | Invitrogen (ThermoFisher) | 10500 | To prepare growth medium for mammalian cells |
Glass beads | Sigma-Aldrich | G8772 | To homogenise cells |
Needle 23G (0.6 x 30mm) | BD Microlance | 300700 | To homogenise cells |
Protease inhibitor cocktail (Complete) | Roche | 11873508001 | To prevent proteolysis |
PART 3. In vitro biochemical methods | |||
Mini-PROTEAN Tetra Cell (SDS-PAGE system) | Bio-Rad | 1658000EDU | For polyacrylamide gel electrophoresis |
Trans-Blot SD (Semi-dry transfer system) | Bio-Rad | 1703940 | For electrophoretic transfer |
Compact X-ray film processor | Xograph | X4 | For use in immunoblotting |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | For use in chemical cross-linking |
Protein-A sepharose beads | GE Healthcare Life Sciences | 17-5280-01 | For use in co-IP assay |
Anti-HA (Y-11 rabbit polyclonal IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-805 | For use in co-IP assay |
Non-immune rabbit IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | For use in co-IP assay |
Anti-cMyc (9E10 mouse monoclonal IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | For use in immunoblotting |
Anti-HA (16B12 mouse monoclonal IgG) | Covance | MMS-101P | For use in immunoblotting |
Anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | For use in immunoblotting |
Hyperfilm ECL | GE Healthcare Life Sciences | 28906836 | For use in immunoblotting |
ECL Western Blotting Substrate | Pierce (ThermoFisher) | 32106 | For use in immunoblotting |