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Biology

के लिए आनुवंशिक और जैव रासायनिक दृष्टिकोण Published: July 27, 2016 doi: 10.3791/54271
Automatic Translation
1, 1, 1
1Wales Heart Research Institute, Cardiff University School of Medicine, College of Biomedical and Life Sciences

Introduction

कंकाल और हृदय की मांसपेशी संकुचन sarcoplasmic जालिका सीए 2 RYR द्वारा मध्यस्थता रिलीज से शुरू हो रहा है। वहाँ तीन कार्यात्मक चार समान सब यूनिटों से बना चैनल के साथ स्तनधारी RYR isoforms हैं। प्रत्येक RYR सबयूनिट एक बड़ी cytoplasmic नियामक एन टर्मिनल हिस्सा है और एक छोटी सी सी टर्मिनल हिस्सा transmembrane डोमेन है कि एक उच्च चालकता सीए 2 ताकना रूप से युक्त होते हैं। असामान्य अंतर और अंतर-सबयूनिट बातचीत RYR चैनल रोग आबाद और neuromuscular और हृदय संबंधी विकार 1 में परिणाम। पहचान और विशिष्ट RYR संरचना में शामिल डोमेन के लक्षण वर्णन: समारोह संबंध इसलिए RYR pathophysiology की समझ के लिए महत्वपूर्ण है।

पारंपरिक जैव रासायनिक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत तकनीक शुद्ध प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा में, अक्सर बैक्टीरिया में उत्पादन की आवश्यकता है। इस RYR, एक बहुत बड़ी झिल्ली पी के मामले में संभव नहीं हैrotein, ~ 5000 अमीनो एसिड से बना है, जबकि इसकी पुनः संयोजक टुकड़े आसानी से बैक्टीरियल अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए उत्तरदायी नहीं हैं। इस प्रकार, वैकल्पिक अभिव्यक्ति यूकेरियोटिक मेजबान कोशिकाओं से जुड़े सिस्टम स्तनधारी अभिन्न झिल्ली प्रोटीन के लिए आवश्यक हैं। हम पहले Y2H, सह आईपी और पार से जोड़ने assays कार्यरत है सामूहिक रूप से प्रदर्शित करने के लिए है कि एन टर्मिनस tetramerization एक संरचनात्मक विशेषता यह है कि संरक्षित है भर में तीन स्तनधारी RYR isoforms 2,3 है। महत्वपूर्ण बात है, हमने पाया कि एक बिंदु arrhythmogenic हृदय रोग के साथ जुड़े उत्परिवर्तन बाधित एन टर्मिनस स्वयं संघ और एक बेकार RYR चैनल 4 में परिणाम है। हम यह भी RYR cytoplasmic सी टर्मिनल पूंछ 5 के साथ-साथ मुताबिक़ intracellular सीए 2 रिलीज़ चैनल के एन टर्मिनस, inositol 1,4,5 trisphosphate रिसेप्टर 2 की oligomerization पढ़ाई करने के लिए इन तकनीकों को लागू किया है।

Y2H परख में, interactiपर बीच दो प्रोटीन (एक्स और वाई) एक कार्यात्मक प्रतिलेखन कारक (GAL4) और रिपोर्टर जीन 6-9 की आगामी सक्रियण के पुनर्गठन से मापा जाता है। डीएनए बाध्यकारी डोमेन (डीएनए-बी) / प्रोटीन एक्स संलयन (चारा) और सक्रियण डोमेन (ई) / प्रोटीन Y: दो अलग अलग क्लोनिंग वैक्टर GAL4 के दो शारीरिक रूप से पृथक करने, स्वतंत्र डोमेन के साथ दो परीक्षण किया प्रोटीन के मिश्रण उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं संलयन (लक्ष्य)। Y2H एक प्रोटीन GAL4 डीएनए बी.डी. और एक ही प्रोटीन की ई fusions उत्पन्न करके खुद के साथ सूचना का आदान प्रदान के लिए कि क्या परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। आनुवंशिक रूप से संशोधित Y2H उपभेदों Gal4 और GAL80 कर रहे हैं की कमी (GAL80 प्रोटीन GAL4 की एक repressor है), के रूप में अच्छी तरह से TRP1 और LEU2 की कमी के रूप में (चारा और शिकार plasmids के लिए पोषण चयन प्रदान करने के लिए, क्रमशः)। खमीर नाभिक में, पुनः संयोजक डीएनए बी और ई पेप्टाइड्स बंद शारीरिक निकटता में लाया जाता है तो केवल अपने fusions 'एक्स के माध्यम से एक संकर GAL4 प्रतिलेखन कारक उत्पादन करने के लिए: वाई interaction। इस दृष्टिकोण और रिपोर्टर जीन (β-galactosidase (β-लड़की) के लिए lacZ एन्कोडिंग) chromogenic (एक एंजाइम हिस्टिडीन जैवसंश्लेषण के लिए आवश्यक लिए HIS3 एन्कोडिंग) prototrophic की समानांतर transcriptional सक्रियण के माध्यम से प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए तेजी से आनुवंशिक स्क्रीनिंग सक्षम बनाता है। Y2H का मुख्य लाभ यह है कि यह एक विवो परख है कि यहां तक कि कमजोर या क्षणिक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाता है। इसके अलावा, पता लगाने सरल विकास चयन की (मीडिया कमी हिस्टिडीन में) चारा और लक्ष्य प्रोटीन की शुद्धि या विशिष्ट एंटीबॉडी की पीढ़ी के लिए कोई जरूरत के साथ उपयोग या एक वर्णमिति की (β-लड़की) परख शामिल है। इसके अतिरिक्त, Y2H यादृच्छिक अज्ञात क्लोन (सीडीएनए पुस्तकालय GAL4 ईसवी से जुड़े हुए क्लोन) एक चारा प्रोटीन के उपन्यास बंधन भागीदारों भी पुस्तकालय प्रोटीन की सीडीएनए तक सीधी पहुंच देने के लिए का एक संग्रह स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Y2H टिप्पणियों का विस्तार करने के लिए, independईएनटी जैव रासायनिक तकनीक नियोजित किया जा सकता है। सह-आईपी और immunoblotting के साथ संयुक्त पार से जोड़ने assays जटिल नमूना मिश्रण में प्रोटीन संघों का पता लगाने के तरीकों का इस्तेमाल किया है, उदाहरण।, पूरे सेल lysates 10 हैं। उनका मुख्य लाभ यह है कि वे देशी ऊतकों से प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पर रिपोर्ट, अन्य तरीकों पुनः संयोजक प्रोटीन के उपयोग की आवश्यकता है कि विपरीत है। पुनः संयोजक प्रोटीन भी इस्तेमाल किया जा सकता है आम तौर पर एक स्तनधारी सेल लाइन, जहां वे अपने सही रचना और बाद translational संशोधनों की संभावना है, साथ ही subcellular स्थानीयकरण में व्यक्त किया। हालांकि, बाद से सह-आईपी और पार से जोड़ने विट्रो assays homogenized कोशिकाओं का इस्तेमाल करने में कर रहे हैं, यह आवश्यक है कि क्या इस बात की पुष्टि करने के लिए दो प्रोटीन के भागीदारों बरकरार सेल 11 में सह-स्थानीय कर रहे हैं है। हम नियमित रूप से स्तनधारी HEK293 कोशिकाओं के अभिकर्मक का उपयोग क्षणिक स्तनधारी अभिन्न झिल्ली और साइटोसोलिक प्रोटीन व्यक्त करने के लिए कैल्शियम फास्फेट वर्षा विधि 2 का उपयोग-4,12-14, विस्तार में यहाँ का वर्णन किया। यह एक सस्ता तरीका कुशलता से कोशिकाओं के अंदर प्लास्मिड डीएनए वितरित करने के लिए है, लेकिन यह प्रयोग किया जाता विशेष सेल लाइन और सेल संगम, साथ ही प्लास्मिड डीएनए 11,15 की शुद्धता पर निर्भर है।

सह-आईपी परख गैर अप्राकृतिकरण की स्थिति ख्यात बातचीत भागीदारों के 10,16 के सह-शुद्धि को सक्षम करने के तहत सेल lysates से ब्याज की देशी या पुनः संयोजक प्रोटीन के अलगाव शामिल है। यह दो अलग अलग मिलान के साथ दो अलग fusions उत्पन्न करके एक प्रोटीन के साथ ही सूचना का आदान कि क्या परीक्षण करने के लिए दो स्वतंत्र एंटीबॉडी का उपयोग करते हैं, प्रोटीन एक्स के अलगाव के लिए immunoprecipitating एंटीबॉडी, और प्रोटीन साथी वाई का पता लगाने के लिए immunoblotting एंटीबॉडी यह प्रयोग किया जा सकता है की आवश्यकता टैग (उदा।, हा और cMyc)। immunoprecipitating एंटीबॉडी, प्रोटीन एक पर अपनी एफसी क्षेत्र के माध्यम से ही है (प्रोटीन जी, जानवरों की प्रजातियों में जहां एंटीबॉडी उठाया गया था पर निर्भर करता है या) जोagarose के लिए (या sepharose) राल संयुग्मित है। सेल lysate, homogenized कोशिकाओं के अर्थात् डिटर्जेंट में घुलनशील अंश के साथ ऊष्मायन के बाद प्रोटीन एक राल: प्रोटीन एक्स एंटीबॉडी से उपजी है। प्रोटीन इम्युनो-परिसरों बफर एसडीएस युक्त है और बाद में एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण किया और प्रोटीन की उपस्थिति Y 17 पता लगाने के लिए एक एंटीबॉडी का उपयोग immunoblotting साथ eluted हैं। सह-आईपी अत्यधिक गैर विशिष्ट बंधन से बचने के लिए डिटर्जेंट में घुलनशील प्रोटीन के साथ बाहर किया जाना चाहिए। Y जोड़ी 10,16,18: डिटर्जेंट और अपनी एकाग्रता की पसंद है, साथ ही साथ washes की संख्या, प्रत्येक एक्स के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।

पार से जोड़ने oligomeric प्रोटीन परिसर के stoichiometry निर्धारित करने के लिए कार्यरत है। यह आसन्न बातचीत protomers के बीच सहसंयोजक बांड बनाने के लिए एक रासायनिक प्रतिक्रिया पर आधारित है, और इसलिए, यह एसडीएस पृष्ठ जुदाई के दौरान प्रोटीन के oligomeric स्थिति के संरक्षण के लिए सक्षम बनाता है। कई पार से जोड़ने Reage रहे हैंविभिन्न लंबाई और रसायन शास्त्र प्रोटीन, आम तौर पर प्राथमिक amines, कार्बोक्जिलिक या thiol समूहों पर विभिन्न प्रतिक्रियाशील समूहों को निशाना बनाने का एनटीएस। यहाँ, हम glutaraldehyde के उपयोग का वर्णन (OHC (सीएच 2) 3 चो), एक होमोसेक्सुअल द्वि-कार्यात्मक दोनों छोर कि लाइसिन अवशेषों 19,20 में मौजूद मुक्त अमीनो समूहों के साथ प्रतिक्रिया पर दो एल्डिहाइड समूहों के साथ पार linker। पार से जोड़ने की एक एकाग्रता या समय पर निर्भर ढंग अभिवर्तन गठन में जिसके परिणामस्वरूप में पीछा किया जाता है। Glutaraldehyde प्रतिक्रिया hydrazine (एच 2 NNH 2) और प्रोटीन के नमूने तो एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण किया और उनके oligomerization स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए 17 immunoblotting रहे हैं के साथ बंद कर दिया है। हम उस पार से जोड़ने oligomerization प्रेरित नहीं करता नोट करना चाहिए लेकिन केवल पहले से मौजूद प्रोटीन परिसरों के बीच स्थिर पुलों बनाता है। महत्वपूर्ण विचार जब पार से जोड़ने प्रयोगों से बाहर ले जाने के पार linker, अपनी एकाग्रता और प्रतिक्रिया समय 19,20 की पसंद में शामिल हैं।

Protocol

1. खमीर दो संकर

  1. खमीर परिवर्तन
    1. निम्नलिखित मीडिया और buffers तैयार:
      1. 20 ग्राम / एल peptone, 10 ग्राम / एल खमीर निकालने, 2% w / v ग्लूकोज (autoclaving के बाद जोड़ा) और 20 ग्राम / एल अग्रवाल के मिश्रण से खमीर पूरा खमीर निकालने-peptone-डेक्सट्रोज (YPD) के माध्यम से तैयार (प्लेटों के लिए केवल) ; autoclaving द्वारा बाँझ और प्रयोग के दिन पर ताजा का उपयोग करें।
      2. 6.7 जी / खमीर नाइट्रोजन बेस के एल, 1.6 जी / एल छोड़ने वालों के पूरक कमी leucine और नियासिन, 2% w के मिश्रण से (दोनों चारा और लक्ष्य plasmids पर चयनात्मक दबाव बनाए रखने के लिए की कमी leucine और नियासिन) खमीर न्यूनतम सिंथेटिक परिभाषित (एसडी) के माध्यम से तैयार / वी ग्लूकोज (केवल प्लेटों के लिए) (autoclaving के बाद जोड़ा) और 20 ग्राम / एल अगर; autoclaving द्वारा बाँझ और प्रयोग के दिन पर ताजा का उपयोग करें।
      3. 50% w तैयार / वी खूंटी (पॉलीथीन ग्लाइकोल) 3350; आरटी पर 0.2 माइक्रोन फिल्टर और दुकान के माध्यम से बाँझ।
      4. 100 मिमी Tris / 10 मिमी EDTA (10x ते) तैयार करें, समायोजित7.5 पीएच, आरटी पर 0.2 माइक्रोन फिल्टर और दुकान के माध्यम से बाँझ।
      5. 1 एम लिथियम एसीटेट (10x LiAc) तैयार करें; साथ CH 3 COOH 7.5 पीएच को समायोजित आरटी पर 0.2 माइक्रोन फिल्टर और दुकान के माध्यम से बाँझ।
    2. एक YPD थाली पर जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक की एक छोटी राशि streaking द्वारा Y2H तनाव (जैसे, Y190) जिला। 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं जब तक खमीर कालोनियों तक पहुंचने के व्यास में ~ 2 मिमी (आमतौर पर 3 - 5 दिन, खमीर तनाव पर निर्भर करता है)।
    3. कॉलोनी - (3 व्यास में 2 मिमी) एक एकल, बड़े के साथ YPD के 0.5 मिलीलीटर (एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में) टीका लगाना। भंवर सख्ती ~ 2 मिनट के लिए किसी भी गुच्छों को तितर-बितर करने के लिए।
    4. एक 500 मिलीलीटर 50 मिलीलीटर YPD मध्यम युक्त कुप्पी में सेल निलंबन स्थानांतरण। खमीर के लिए 250 rpm पर मिलाते स्थिर चरण तक पहुंचने के लिए के साथ 18 घंटा - 16 के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    5. स्थानांतरण 4 - (1 एल शंक्वाकार फ्लास्क में) YPD की 200 मिलीलीटर में रातोंरात संस्कृति के 5 मिलीलीटर 600 एनएम (600 आयुध डिपो में एक ऑप्टिकल घनत्व का उत्पादन करने के लिए, मापा0.2 की एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर) का उपयोग कर - 0.3 (200 मिलीलीटर 20 परिवर्तनों के लिए पर्याप्त होगा)।
    6. 250 rpm पर झटकों के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं जब तक कोशिकाओं मध्य लॉग चरण, यानी, 600 आयुध डिपो = 0.5 में हैं - 0.6 (आमतौर पर 2 - 3 घंटा)।
    7. centrifugation द्वारा हार्वेस्ट खमीर आरटी पर 5 मिनट के लिए 1,500 XG पर (50 मिलीलीटर ट्यूब)। सतह पर तैरनेवाला त्यागें, एक साथ बाँझ एच 2 ओ और पूल के 5 मिलीलीटर में प्रत्येक गोली resuspend।
    8. पुनः सेंट्रीफ्यूज आरटी पर 5 मिनट के लिए 1,500 XG पर और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। हौसले से तैयार, बाँझ 1x LiAc / ते के 1 मिलीलीटर में Resuspend खमीर गोली।
      नोट: तैयार करने के लिए 1 घंटे के भीतर सक्षम खमीर कोशिकाओं का प्रयोग करें।
    9. प्लाज्मिड नमूने (1.5 मिलीलीटर ट्यूब में) एकल परिवर्तनों के लिए प्लास्मिड डीएनए के 200 एनजी, या 0.5 जोड़कर तैयार करें - 1 सह परिवर्तनों के लिए प्रत्येक प्लास्मिड डीएनए के माइक्रोग्राम, और मछली वृषण के 100 माइक्रोग्राम वाहक डीएनए (20 मिनट के लिए उबला हुआ और पर ठंडा बर्फ बस का उपयोग करने से पहले)।
      नोट: एक सकारात्मक नियंत्रण, जैसे, खमीर शामिल करें।सह-बदल pVA3 और pTD1 (SV40 बड़ी टी प्रतिजन के साथ GAL4 ई संलयन के लिए एन्कोडिंग) (p53 प्रोटीन के साथ GAL4 डीएनए बी.डी. संलयन के लिए एन्कोडिंग) के साथ।
    10. 100 (शेयर ते के 1 मिलीलीटर शेयर के 8 मिलीलीटर खूंटी 3350, शेयर LiAc के 1 मिलीलीटर) के लिए हाल में तैयार, सक्षम खमीर निलंबन (कदम 1.1.8) के μl और 1x LiAc / खूंटी समाधान के 600 μl, और भंवर जोड़े ~ 30 सेकंड। 200 rpm पर झटकों के साथ 30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    11. डाइमिथाइल sulfoxide (10% v / v अंतिम एकाग्रता) के 80 μl जोड़ें और कोमल उलटा द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं। 3 मिनट - एक 42 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 15 मिनट के लिए गर्मी झटका, जबकि हर 2 मिश्रण।
    12. बर्फ पर सेल निलंबन आरटी पर 15 सेकंड के लिए 14,000 XG पर 2 मिनट और सेंट्रीफ्यूज के लिए ठंडा खमीर ठीक करने के लिए।
    13. 1x ते के 100 μl में Resuspend सेल गोली और उचित न्यूनतम एसडी मध्यम प्लेटों पर प्लेट चयनात्मक विकास के लिए (मध्यम leucine और नियासिन की कमी दोनों चारा और लक्ष्य plasmids पर चयनात्मक दबाव रखने के लिए)।
    14. ऊपर की ओर नीचे 30 प्लेटें सेतेसी ° तक कालोनियों कर रहे हैं ~ 2 व्यास में मिमी (आमतौर पर 4 - 5 दिन)। प्लेट्स 2 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता - 3 सप्ताह; अब भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर ग्लिसरॉल शेयरों और स्टोर कर सकते हैं।
      नोट: सत्यापित करें कि चारा और लक्ष्य प्रोटीन खमीर में व्यक्त कर रहे 17 immunoblotting द्वारा, और वे स्वायत्त पत्रकार जीन सक्रियण की जरूरत नहीं है कि जब अलग से (धारा 1.3 में वर्णित के रूप में β-लड़की परख द्वारा) खमीर में व्यक्त किया।
  2. कालोनी लिफ्ट फिल्टर पेपर β-लड़की परख
    1. निम्नलिखित बफ़र्स तैयार:
      1. जेड युक्त 100 मिमी ना 2 HPO 4, बफर तैयार 40 मिमी नः 2 पीओ 4, 10 मिमी KCl, 1 मिमी MgSO 4; 7.4 पीएच को समायोजित करें। आरटी पर autoclaving और दुकान से जीवाणुरहित।
      2. भंग द्वारा एक्स-लड़की बफर तैयार 5-ब्रोमो-4-क्लोरो-3-indolyl-β-D-galactopyranoside -20 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में एन, एन dimethylformamide और दुकान में 20 मिलीग्राम / एमएल पर। जेड बफर / एक्स-लड़की समाधान तैयार है। बफर बनाओजेड बफर में 0.27% v / वी पर 0.33 मिलीग्राम / एमएल और β-mercaptoethanol पर मिश्रण एक्स-लड़की द्वारा उपयोग करने से पहले। नमूना प्रति 2.5 मिलीलीटर का प्रयोग करें।
    2. जोड़े एक स्वच्छ 100 मिमी प्लेट और एक सेल्यूलोज फिल्टर पेपर के अंदर जगह में हौसले से तैयार जेड बफर / एक्स-लड़की समाधान के 2.5 मिलीलीटर।
    3. प्लेट की सतह पर एक नया फिल्टर पेपर जगह के साथ खमीर कालोनियों यत्न किया जाएगा। धीरे संदंश के साथ थाली पर फिल्टर पेपर रगड़ और कालोनियों को संलग्न करने के लिए ~ 5 मिनट के लिए छोड़ दें।
      नोट:। समानांतर में सकारात्मक नियंत्रण, यानी, खमीर और pVA3 pTD1 के साथ सह-बदल की प्रक्रिया।
    4. फिल्टर पेपर उठा और यह डूब (संदंश के साथ) 30 सेकंड के लिए तरल नाइट्रोजन का एक पूल में (तरल नाइट्रोजन सावधानी से नियंत्रित किया जाना चाहिए, हमेशा मोटी दस्ताने और काले चश्मे पहन)। ~ 2 मिनट के लिए आरटी पर जमे हुए फिल्टर पेपर पिघलना करते हैं।
    5. फिल्टर पेपर (अप कॉलोनी की ओर) 100 मिमी प्लेट के अंदर पूर्व लथपथ फिल्टर पेपर के शीर्ष पर रखें, और 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    6. समय समय पर जांच(हर ~ 30 मिनट) नीले कालोनियों की उपस्थिति के लिए। खमीर Y190 सह तब्दील सकारात्मक नियंत्रण plasmids (pVA3 + pTD1) के साथ 60 मिनट (अप्रकाशित टिप्पणियों) के भीतर नीले रंग के हो जाएंगे।
      नोट: कमजोर चारा: लक्ष्य बातचीत में कई घंटे लग एक सकारात्मक संकेत नीले रंग का उत्पादन (लंबे समय तक ऊष्मायन (> 8 घंटा) है कि झूठी सकारात्मक परिणाम दे सकता बचने के लिए) के लिए कर सकता है। व्यास में 2 मिमी, 5 दिनों ~ - सर्वोत्तम परिणामों के लिए, हौसले सह तब्दील कालोनियों, IE का उपयोग 4 के लिए 30 डिग्री सेल्सियस से बढ़ी।।
  3. तरल संस्कृति β-लड़की परख
    1. निम्नलिखित बफ़र्स तैयार:
      1. जेड युक्त 100 मिमी ना 2 HPO 4, बफर तैयार 40 मिमी नः 2 पीओ 4, 10 मिमी KCl, 1 मिमी MgSO 4; , 7.4 पीएच को समायोजित आरटी पर autoclaving और दुकान से बाँझ।
        1 एम ना 2 सीओ 3; आरटी पर दुकान।
      2. जेड बफर / β-mercaptoethanol तैयार करें। बफर 0.27% वी पर β-mercaptoethanol जोड़कर उपयोग करने से पहले सुनिश्चित करें /जेड बफर में वि; नमूना प्रति 700 μl का उपयोग करें। जेड बफर / ONPG समाधान तैयार है। बफर से पहले 0.27% v / जेड बफर में वी पर 4 मिलीग्राम / एमएल और β-mercaptoethanol पर ONPG (ओ-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside) के मिश्रण से उपयोग करने के लिए; नमूना प्रति 160 μl का उपयोग करें।
    2. 250 rpm पर झटकों के साथ 18 घंटा - के न्यूनतम एसडी मध्यम 5 मिलीलीटर टीका लगाना (कमी leucine और नियासिन दोनों चारा और लक्ष्य plasmids पर चयनात्मक दबाव रखने के लिए) और 16 के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते एक भी कॉलोनी का प्रयोग करें।
      नोट: परख पांच अलग-अलग कॉलोनियों में एक ही चारा है और लक्ष्य plasmids के साथ सह-बदल दिया।
    3. की ताजा एसडी मध्यम 10 मिलीलीटर में रातोंरात संस्कृति के लिए पर्याप्त स्थानांतरण एक आयुध डिपो के 600 = 0.2 उत्पादन करने के लिए - 0.3। 250 rpm पर झटकों के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं जब तक कोशिकाओं मध्य लॉग चरण (600 आयुध डिपो = 0.5 - 0.6) में हैं।
    4. खमीर संस्कृति के 0.5 मिलीलीटर आरटी पर 2 मिनट के लिए 14,000 XG पर एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब और अपकेंद्रित्र में स्थानांतरण। सटीक 600 आयुध डिपो रिकॉर्ड जब सीई कटाईlls। जेड बफर के 100μl में resuspend गोली; यह एक 5 गुना एकाग्रता कारक का परिणाम देगा।
    5. तरल नाइट्रोजन में जगह ट्यूब ~ 1 मिनट के लिए (तरल नाइट्रोजन सावधानी से नियंत्रित किया जाना चाहिए, हमेशा मोटी दस्ताने और काले चश्मे पहन) और फिर 3 मिनट पिघलना करने के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में। इस फ्रीज पिघलना चक्र दो बार दोहराएँ अधिक सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं खुला टूट रहे हैं।
    6. जेड बफर के 100 μl के साथ एक खाली ट्यूब सेट करें।
    7. जेड बफर / β-mercaptoethanol के 700 μl और नमूना और खाली ट्यूबों के लिए जेड बफर / ONPG के 160 μl जोड़ें; टाइमर और एक 30 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जगह के लिए शुरू।
    8. समय समय पर जांच पीले रंग को विकसित करने के लिए। रंग विकास को रोकने और मिनटों में गुजरे समय रिकॉर्ड करने के लिए 1 एम ना 2 3 सीओ के 400 μl जोड़ें। खमीर Y190 सह तब्दील सकारात्मक नियंत्रण plasmids (pVA3 + pTD1) के साथ 60 मिनट के भीतर पीला हो जाएगा ..
      नोट: कमजोर चारा: लक्ष्य बातचीत में कई घंटे लग सबसे अच्छा पुनः के लिए एक सकारात्मक संकेत पीले रंग का उत्पादन करने के लिए कर सकते हैंsults, हौसले से सह-बदल कालोनियों का उपयोग यानी, 4 के लिए 30 डिग्री सेल्सियस से बढ़ी -। 5 दिन, ~ व्यास में 2 मिमी।
    9. आरटी पर 5 मिनट के लिए 14,000 XG पर अपकेंद्रित्र सेल मलबे गोली और एक साफ क्युवेट में सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण करने के लिए।
    10. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग, नमूने खाली करने के लिए सापेक्ष (- 1.0 मूल्यों 0.02 के बीच होना चाहिए) के 420 एनएम (ए 420) पर absorbance को मापने।
    11. β-galactosidase इकाइयों की गणना, 1 यूनिट राशि है जो ONPG के 1 μmol hydrolyses ओ-nitrophenol और सेल प्रति मिनट प्रति डी-गैलेक्टोज के रूप में परिभाषित साथ, निम्न सूत्र के अनुसार:
      1 समीकरण = Β-galactosidase इकाइयों
      कहां: टी: ऊष्मायन के गुजरे समय (मिनट में); । CF: चरण 1.4.8, अर्थात् से एकाग्रता कारक, सीएफ = 5; आयुध डिपो के 600: जब कोशिकाओं काटा गया।

2. एक स्तनधारी सेल लाइन में प्रोटीन अभिव्यक्ति

  2. निम्नलिखित मीडिया और buffers तैयार:
    1. 4.5 छ / एल ग्लूकोज, 10% वी / वी भ्रूण गोजातीय सीरम और 2 मिमी एल glutamine के साथ DMEM मिश्रण से विकास के माध्यम से तैयार; 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.2 माइक्रोन फिल्टर और दुकान के माध्यम से बाँझ।
    2. मिश्रण 280 मिमी NaCl, 10 मिमी KCl, द्वारा 2x Hepes बफर खारा (2x एचबीएस) तैयार करें 1.5 मिमी ना 2 HPO 4, 12 मिमी ग्लूकोज, 50 मिमी Hepes; , 7.05 पीएच को समायोजित -20 डिग्री सेल्सियस पर 0.2 माइक्रोन फिल्टर और दुकान के माध्यम से बाँझ। -20 डिग्री सेल्सियस पर 0.2 माइक्रोन फिल्टर और दुकान के माध्यम से 2.5 एम CaCl 2. जीवाणुरहित तैयार करें।
  3. एक दिन पहले अभिकर्मक, बीज 1 - क्रम में एक 100 मिमी पेट्री डिश में 2 एक्स 10 6 HEK293 कोशिकाओं 60-70% मिला हुआ अगले दिन होने के लिए। 18 5% सीओ 2 के साथ एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर मानव संसाधन - 16 के लिए संस्कृति।
  4. अभिकर्मक के दिन पर ताजा मध्यम विकास के 10 मिलीलीटर के साथ पुराने मध्यम और चारा कोशिकाओं को हटा दें।
    ध्यान दें: एंटीबायोटिक्स अभिकर्मक के दौरान संस्कृति के माध्यम से छोड़े गए हैं, क्योंकि वे कोशिका मृत्यु वृद्धि हो सकती है।
  5. पतला प्लास्मिड डीएनए के 24 माइक्रोग्राम और 600 μl कुल मात्रा में 2.5 एम 2 CaCl के 60 μl (सह transfections, दो plasmids की एक समान अनुपात दाढ़ के लिए) एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब के अंदर (बाँझ विआयनीकृत एच 2 ओ के साथ बनाया); भंवर मिश्रण करने के लिए।
    नोट:। उच्चतम अभिकर्मक दक्षता के लिए, प्लास्मिड डीएनए उच्चतम शुद्धता, यानी की होनी चाहिए, एक पेट 260 / ABS 280 अनुपात = ~ 1.8 है।
  6. प्लास्मिड डीएनए / कैल्शियम समाधान बूंद 2x HBS के 600 μl युक्त जबकि लगातार और तेजी से vortexing द्वारा मिश्रण एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में बुद्धिमान जोड़ें। आरटी पर 20 मिनट के लिए सेते कैल्शियम फास्फेट / प्लास्मिड डीएनए परिसरों के गठन की अनुमति है।
  7. और 20 मिनट ऊष्मायन, भंवर संक्षिप्त के बाद 100 मिमी पेट्री डिश की पूरी सतह क्षेत्र को कवर करने के लिए कोशिकाओं पर बुद्धिमान समाधान बूंद जोड़ें।
  8. 5% सीओ में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते
  9. आरटी पर 3 मिनट के लिए 1,000 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं 24 घंटा बाद अभिकर्मक फसल और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। सेल छर्रों डिग्री सेल्सियस -80 में संग्रहित किया जा सकता जब तक की जरूरत है।
    नोट: - 72 घंटा बाद अभिकर्मक अभिव्यक्ति आम तौर पर 24 चोटियों।
  • सेल Homogenization
    1. निम्नलिखित बफ़र्स तैयार:
      1. 150 मिमी NaCl, 20 मिमी Tris मिश्रण से सह-आईपी homogenization बफर तैयार करें; 7.4 पीएच को समायोजित करने और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
      2. मिश्रण 5 मिमी HEPES, 0.3 एम सुक्रोज द्वारा homogenization बफर क्रॉस को जोड़ने तैयार करें; 7.4 पीएच को समायोजित करने और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर (उपयोग करने से पहले किसी भी फिल्टर विविक्त दूर करने के लिए)। उपयोग करने से पहले प्रोटीज अवरोधकों के साथ पूरक।
    2. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब के अंदर - (600 माइक्रोन 425) और homogenization बफर के 500 μl से धो लें कांच के मोती के 250 μl जोड़ें। एक संक्षिप्त centrifugation द्वारा गोली कांच के मोतीपल्स (5 सेकंड के लिए 1,000 XG) और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। इस धोने कदम एक बार दोहराएँ।
    3. ठंडा homogenization बफर के 500 μl में (कदम 2.1.8 से) Resuspend सेल गोली और कांच के मोती युक्त ट्यूब में सेल निलंबन हस्तांतरण।
    4. 1 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी एक ठीक सुई के माध्यम से 20 अंश (23 जी, 0.6 x 30 मिमी) से बर्फ पर कोशिकाओं Homogenize। साथ ट्यूब टोपी सुई के साथ बंद हुआ, पियर्स के माध्यम से इसे और कांच के मोती के माध्यम से सख्ती सेल निलंबन को तितर-बितर।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1,500 XG पर अपकेंद्रित्र नाभिक और अटूट कोशिकाओं को हटाने और गोली त्यागें। सतह पर तैरनेवाला के बाद परमाणु अंश का प्रतिनिधित्व करने बचाने के लिए और सीधे सह-आईपी या पार से जोड़ने के रूप में उपयुक्त आगे बढ़ें।

    • 3. इन विट्रो जैव रासायनिक तरीकों

    1. सह immunoprecipitation
      1. निम्नलिखित बफ़र्स तैयार:
        1. एस में वर्णित के रूप में सह-आईपी homogenization बफर तैयारection 2.2.1.1। मिश्रण 20 मिमी Tris, 150 मिमी NaCl, 0.5% से आईपी बफर तैयार (डब्ल्यू / वी) CHAPS, 2 मिमी dithiothreitol (वैकल्पिक dithiothreitol प्रोटीन समुच्चय है कि हवा ऑक्सीकरण की वजह से गठन हो सकता है कम करने के लिए शामिल किया जा सकता है); 7.4 पीएच को समायोजित करने और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
        2. 2% w / सह-आईपी homogenization बफर में वी CHAPS तैयार करें; 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
        3. मिश्रण 60 मिमी Tris, 2% w / v एसडीएस, 10% वी / वी ग्लिसरॉल, 5 मिमी EDTA, 0.01% w / v bromophenol नीले, 2% वी / वी β-mercaptoethanol (वैकल्पिक) द्वारा प्रोटीन लोडिंग बफर तैयार करें; आरटी पर 6.8 पीएच और दुकान को समायोजित।
      2. एक मिला हुआ 100 मिमी पेट्री डिश से कोशिकाओं Homogenize (~ 8 x 10 6 कोशिकाओं यदि HEK293, एक hemocytometer के उपयोग के साथ गिना) की धारा 2.2 में वर्णित है।
      3. लगातार मिश्रण के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर बाद परमाणु उप सेलुलर ≥2 घंटे के लिए 0.5% CHAPS साथ अंश (2% शेयर का उपयोग) और ऊष्मायन solubilize। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 20,000 XG पर अपकेंद्रित्र अघुलनशील materi गोलीअल और गोली त्यागें। सतह पर तैरनेवाला करार दिया सेल lysate बचाओ।
        नोट: एक साबुन और अघुलनशील सामग्री को हटाने के शामिल किए जाने को पूरी तरह से गैर विशिष्ट बंधन को कम करने के लिए आवश्यक है। । इंटरमीडिएट डिटर्जेंट, जैसे, लोग या ट्राइटन X-100, 0.2 की एकाग्रता में - 1%, सबसे अधिक इस्तेमाल कर रहे हैं।
      4. 6 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीन एक या प्रोटीन जी agarose (या sepharose) मोतियों की (आईजीजी बाध्यकारी क्षमता पर निर्भर करता है) के दो अलग 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों तैयार है और 20 μl जोड़ने ~। आईपी ​​बफर के 200 μl के साथ धोएं।
        नोट: उचित पुलिस महानिरीक्षक बाध्यकारी पशु immunoprecipitating एंटीबॉडी बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया प्रजातियों के आधार पर राल चुनें। प्रोटीन-जी पुलिस महानिरीक्षक उपप्रकार का एक व्यापक रेंज बांधता प्रोटीन एक की तुलना में।
      5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 1,500 XG पर centrifugation द्वारा मोती की वसूली। दोहराएँ धोने आईपी बफर के साथ एक बार फिर, तो आईपी बफर के 200 μl में मोती resuspend।
      6. (करने के लिए immunoprecipitating एंटीबॉडी या गैर प्रतिरक्षा आईजीजी के 1 माइक्रोग्राम (5 एनजी / μl) जोड़ेंदो अलग-अलग प्रोटीन-ए / जी युक्त ट्यूबों में के रूप में नकारात्मक नियंत्रण) सेवा करते हैं। लगातार मिश्रण के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर ≥2 घंटे के लिए सेते हैं।
        नोट: हमेशा immunoprecipitating एंटीबॉडी के रूप में ही जानवरों की प्रजातियों में उठाया गैर प्रतिरक्षा आईजीजी के उपयोग के साथ एक नकारात्मक नियंत्रण की प्रक्रिया।
      7. मोती 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 1,500 XG पर centrifugation द्वारा ठीक है और ध्यान pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
      8. एंटीबॉडी और प्रोटीन ए / जी मोतियों के साथ दो नलियों में से प्रत्येक में सेल lysate (कदम 3.1.3 से) के 200 μl स्थानांतरण। लगातार मिश्रण के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर ≥2 घंटे के लिए सेते हैं प्रतिजन प्रतिरक्षी बाध्य करने के लिए अनुमति देने के लिए।
      9. मोतियों की वसूली और आईपी बफर के 200 μl से धो लें; मिश्रण के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं। मोतियों की वसूली और दो बार अधिक धोने (एकाधिक washes जो दोनों विशिष्ट और गैर विशिष्ट बंधन कम हो जाएगा बचने के लिए)। ध्यान pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
      10. immunoprecipit elute करने के लिए प्रोटीन लोडिंग बफर के 30 μl जोड़ेपैदा प्रोटीन। 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 1,500 XG पर अपकेंद्रित्र, मोती त्यागने और eluted सह आईपी नमूना युक्त सतह पर तैरनेवाला बचाने के लिए।
      11. सफल प्रोटीन एक्स वर्षा को सत्यापित करने के लिए, एक एसडीएस पृष्ठ जेल पर सह आईपी नमूना की एक छोटी राशि (1/10 वें, 3 μl) एंटीबॉडी प्रोटीन एक्स के लिए विशेष के साथ 17 immunoblotting द्वारा विश्लेषण किया जा करने के लिए लोड के एक विभाज्य शामिल करें सेल lysate अपने नमूने में प्रोटीन एक्स अभिव्यक्ति सत्यापित करने के लिए।
      12. , सह उपजी प्रोटीन Y की उपस्थिति के लिए परीक्षण करने के लिए एक अलग एसडीएस पृष्ठ जेल पर सह आईपी नमूना के बाकी (9/10 वें, 27 μl) लोड एंटीबॉडी प्रोटीन वाई के लिए विशिष्ट के साथ 17 immunoblotting द्वारा विश्लेषण किया जा अपने नमूने में प्रोटीन Y अभिव्यक्ति सत्यापित करने के लिए सेल lysate के एक विभाज्य शामिल करें।
    2. रासायनिक पार से जोड़ने
      1. निम्नलिखित बफ़र्स तैयार:
        1. homogenization बफर पार से जोड़ने खंड 2.2.1.1 में वर्णित है।
        2. 5x पी तैयारrotein लोडिंग बफर 300 मिमी Tris, 10% w / v एसडीएस, 50% वी / वी ग्लिसरॉल, 25 मिमी EDTA, 0.05% w / v bromophenol नीले, 10% वी / वी β-mercaptoethanol (वैकल्पिक) के मिश्रण से; आरटी पर 6.8 पीएच और दुकान को समायोजित; उपयोग करने से पहले 50 डिग्री सेल्सियस पर गर्म है।
      2. एक मिला हुआ 100 मिमी पेट्री डिश से कोशिकाओं Homogenize (~ 8 x 10 6 कोशिकाओं यदि HEK293, एक hemocytometer के उपयोग के साथ गिना) की धारा 2.2 में वर्णित है।
        नोट: सुक्रोज (0.3M पर) एक आईएसओ आसमाटिक बफर बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है। नमक, जैसे, 120 - 150 मिमी NaCl या KCl बजाय प्रयोग किया जा सकता है, ब्याज की oligomeric प्रोटीन परिसर पर निर्भर करता है।
      3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 20,000 XG पर बाद परमाणु उप सेलुलर अंश अपकेंद्रित्र प्रोटीन समुच्चय गोली और सतह पर तैरनेवाला बचाने के लिए। अलग 0.5 मिलीलीटर ट्यूबों में (~ 20 प्रोटीन की माइक्रोग्राम प्रति आमतौर पर) 20 μl प्रत्येक के आठ aliquots ले लो।
      4. सभी नमूनों को 0.0025% वी / वी glutaraldehyde जोड़ें और टाइमर शुरू। आठ नमूने के प्रत्येक glutarald के साथ प्रतिक्रिया करते हैंके लिए आरटी पर ehyde: 0, 2, 5, 10, 15, 20, 30, 60 मिनट।
        नोट: glutaraldehyde दो एल्डिहाइड समूहों है कि मुक्त amines के साथ प्रतिक्रिया है। पीएच बफ़र्स या प्राथमिक एमिनो समूहों के साथ अन्य पदार्थों का उपयोग, क्योंकि वे glutaraldehyde प्रतिक्रिया बुझाना होगा बचें।
      5. साथ 2% वी / वी hydrazine निर्दिष्ट समय में glutaraldehyde प्रतिक्रिया बंद करो और प्रोटीन denature के लिए 5x प्रोटीन लोडिंग बफर के 5 μl जोड़ें।
      6. एसडीएस पृष्ठ और immunoblotting 17 पर आगे बढ़ें।

    Representative Results

    Y2H प्रणाली में, चारा: शिकार बातचीत शुरू में कमी माध्यम में खमीर विकास चयन (नियासिन, leucine और) हिस्टिडीन द्वारा परीक्षण किया जाता है और बाद में β-लड़की enzymatic गतिविधि assays (चित्रा 1) द्वारा मूल्यांकन। शिकार प्रोटीन बातचीत: खमीर मध्यम कमी हिस्टडीन में संवर्धित कि चारा की ताकत पर निर्भर करता है धीमी गति से विकास दर है। β-लड़की परख खमीर में किया जाता है या तो बढ़ रही है ठोस समर्थन पर (प्लेटें अगर) या तरल संस्कृति में (मध्यम में संवर्धित केवल नियासिन और leucine कमी), बाद उपज मात्रात्मक परिणाम के साथ। हम सफलतापूर्वक RyR2 भीतर डोमेन-डोमेन बातचीत के रूप में अच्छी तरह से उपन्यास प्रोटीन भागीदारों के 2-4,12,21,22 की पहचान करने के Y2H इस्तेमाल किया है। उदाहरण के लिए, हम एक एन टर्मिनल टुकड़ा के साथ बातचीत के लिए RyR2 पेप्टाइड अनुक्रम की पूरी लंबाई में फैले निर्माणों ओवरलैपिंग की एक श्रृंखला की जांच (AD4L: RyR2 अवशेषों 1 - 906 GAL4 विज्ञापन के साथ जुड़े हुए)। 3 कालोनी लिफ्ट फिल्टर पेपर β-लड़की assays केवल BT4L के लिए ज्वलंत नीले रंग का खमीर कालोनियों का उत्पादन: AD4L जोड़ी (2A चित्रा), दिखा रहा है कि AD4L सूचना का आदान प्रदान के साथ ही, अर्थात् BT4L निर्माण (RyR2 अवशेषों 1 - 906 GAL4 के साथ जुड़े हुए डीएनए-बी)। जबकि किसी भी अन्य निर्माण के साथ खमीर सह-बदल, AD4L जोड़ी चरम सी टर्मिनल डोमेन (BT8) के साथ एक माध्यमिक कमजोर एसोसिएशन सुझाव सफेद और इसलिए चारा के लिए नकारात्मक बनी हुई: हल्के नीले रंग कालोनियों BT8 के लिए पता चला रहे थे शिकार प्रोटीन बातचीत। मात्रात्मक परिणाम, तरल β-लड़की assays (चित्रा 2 बी), के द्वारा प्राप्त की मजबूत BT4L संकेत दिया: P53 प्रोटीन (pVA3) और SV40 बड़ी टी प्रतिजन (pTD1) के बीच में जाना जाता संघ की ताकत में AD4L बातचीत बराबर जबकि BT8: AD4L बातचीत काफी कमजोर (<10% नियंत्रण की तुलना में) किया गया था।

    हम नियमित रूप से सह-आईपी प्रयोगों (चित्रा 3) च बाहर ले जाने के, एक स्तनधारी सेल लाइन (HEK293) में क्षणिक अभिव्यक्ति ollowing एक स्वतंत्र जैव रासायनिक परख के रूप में Y2H निष्कर्षों 2-4,12-14,21-24 सुदृढ़ करने के लिए। RyR2 एन टर्मिनस आत्म बातचीत सत्यापित करने के लिए दो अलग-अलग RyR2 अवशेषों के लिए एन्कोडिंग plasmids 1 - 906 या तो cMyc या हा पेप्टाइड मिलान (BT4L और AD4L, क्रमशः) के साथ टैग, HEK293 कोशिकाओं में सह ट्रांसफ़ेक्ट कैल्शियम फास्फेट वर्षा विधि का उपयोग कर रहे थे 3। homogenized कोशिकाओं के बाद परमाणु अंश डिटर्जेंट CHAPS साथ solubilized गया था, और अघुलनशील सामग्री centrifugation द्वारा हटा दिया गया था सेल lysate उत्पादन करने के लिए। सेल lysate, एजेंट को कम करने dithiothreitol के साथ इलाज किया, तो हा टैग AD4L immunoprecipitate को Ab हा और प्रोटीन एक sepharose मोतियों के साथ incubated था। सह-आईपी नमूने, एसडीएस युक्त बफर के साथ eluted दो अलग-अलग एसडीएस पृष्ठ जैल (1/10 वें और 9/10 वें विभाजन) पर भरी हुई है और अब हा और Ab cMyc, आर के साथ immunoblotting द्वारा विश्लेषण किया गयाespectively। AD4L के सफल प्रत्यक्ष आईपी (~ 100 केडीए) अटल बिहारी हा द्वारा immunoblotting द्वारा सत्यापित किया गया था, लेकिन गैर-प्रतिरक्षा खरगोश आईजीजी (चित्रा -4 ए) का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण में नहीं है। महत्वपूर्ण बात है, cMyc टैग BT4L (~ 100 केडीए) केवल Ab हा आईपी में बरामद किया गया था, और immunoprecipitated AD4L (चित्रा 4 बी) के अभाव में नकारात्मक नियंत्रण में नहीं है।

    Y2H और सह आईपी assays RyR2 एन टर्मिनस आत्म बातचीत के लिए लगातार सबूत प्रदान की है, लेकिन वे एन टर्मिनल डोमेन के oligomerization स्थिति के बारे में सूचित नहीं किया था, अर्थात् है कि क्या यह केवल dimers या उच्चतर परिसरों रूपों। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि परिसरों को अलग कर देना होगा और केवल जिसमें सब यूनिटों प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत खत्म SDS- की वजह से एसडीएस पृष्ठ और गर्मी प्रेरित प्रोटीन विकृतीकरण द्वारा पता लगाया जाएगा। इस पर काबू पाने के लिए, हम पार से जोड़ने (चित्रा 5) कि रासायनिक और स्थिरतापूर्वक पूर्व मौजूदा protei conjoins का उपयोगn oligomers, जिसका आणविक जन तो एसडीएस पृष्ठ आकार जुदाई 2-5 से जांच की जा सकती है। उदाहरण के लिए, HEK293 सेल homogenate cMyc-BT4L, एजेंट को कम करने के साथ इलाज किया dithiothreitol व्यक्त glutaraldehyde साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की और एसडीएस पृष्ठ और immunoblotting Ab cMyc (चित्रा 6) का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था। मोनोमर (~ 100 केडीए), ~ केडीए के 400 एक उच्च आणविक जन प्रोटीन बैंड एक समय निर्भर तरीके से पता चला था, RyR2 एन टर्मिनस टेट्रामर गठन का संकेत 3 के अलावा। विशेष रूप से, कम से कम टेट्रामर डिमर और trimer बैंड मनाया के साथ प्रमुख oligomeric प्रजातियों था। 15% ढाल एसडीएस पृष्ठ जैल 3 - इसकी स्पष्ट आणविक जन का निर्धारण करने के लिए, BT4L oligomer 4 के माध्यम से अलग हो गया था। हम आणविक जन / जेल मंदता मानक 30 की एक सीमा के साथ प्रोटीन मानकों का प्रयोग वक्र का उत्पादन - 460 केडीए, और हम oligomer गणना की 358 केडीए 15 होना करने के लिए (एन = 4)। यह स्पष्ट आणविक द्रव्यमान एक BT4L टेट्रामर एक में व्यवस्था के अनुरूप हैबजाय रैखिक रूप में की तुलना में बंद परिपत्र फैशन, देशी RyR2 चैनल के भीतर चार यूनिटों की व्यवस्था से उम्मीद के रूप में।

    आकृति 1
    चित्रा 1. Y2H फ़्लोचार्ट। खमीर, सह तब्दील चारा और लक्ष्य plasmids के साथ, मध्यम कमी हिस्टडीन में विकास के लिए चयनित और / या β-लड़की एंजाइमी गतिविधि के लिए यत्न किया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र 2
    चित्रा 2. Y2H सुझाव RyR2 एन टर्मिनस डोमेन आत्म बातचीत। (ए) योजनाबद्ध मानव RyR2 ओवरलैपिंग प्रोटीन के लिए Y2H प्रणाली में परीक्षण के टुकड़े की (चारा) श्रृंखला का चित्रण RyR2 एन टर्मिनल AD4L (शिकार) के निर्माण के साथ बातचीत। नकारात्मक बातचीत के लिए (बी) के मात्रात्मक तरल β-लड़की सकारात्मक नियंत्रण के खिलाफ सामान्यीकृत assays (pVA3 GAL4 डीएनए बी.डी. के लिए encodes - कॉलोनी लिफ्ट फिल्टर पेपर β-लड़की assays के द्वारा प्राप्त गुणात्मक परिणाम "+" कई गुना या में संकेत कर रहे हैं। "" p53 प्रोटीन के साथ फ्यूजन; pTD1 SV40 बड़ी टी प्रतिजन के साथ GAL4 ई संलयन के लिए encodes)। 3 से संशोधित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र तीन
    चित्रा 3. सह-आईपी फ़्लोचार्ट। स्तनधारी कोशिकाओं, सह ट्रांसफ़ेक्ट plasmids एक्स और वाई के साथ, homogenized और डिटर्जेंट solubilized सेल सह आईपी परख में इस्तेमाल lysate, एसडीएस पृष्ठ और immunoblotting के द्वारा पीछा उत्पादन कर रहे हैं।च = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig3large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 4
    चित्रा 4. सह-आईपी स्तनधारी कोशिकाओं में RyR2 एन टर्मिनस डोमेन आत्म बातचीत इंगित करता है। HEK293 कोशिकाओं cMyc टैग (BT4L) और हा टैग (AD4L) RyR2 एन टर्मिनस डोमेन के क्षणिक सह अभिव्यक्ति (के लिए सह ट्रांसफ़ेक्ट थे अवशेषों 1 - 906)। AD4L, लोग-solubilized और dithiothreitol इलाज HEK293 lysate से Ab हा के साथ immunoprecipitated गया था, जबकि के रूप में नकारात्मक नियंत्रण, सह आईपी assays गैर प्रतिरक्षा खरगोश आईजीजी के साथ किए गए। Immunoprecipitated प्रोटीन 5 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस पर गर्म किया और अलग 6% एसडीएस पृष्ठ 1/10 वें या आईपी नमूनों की 9/10 वें के साथ भरी हुई जैल के माध्यम से 3 घंटे के लिए 20 मा पर सुलझाया गया। बाद प्रोटीन polyviny पर 2 घंटे के लिए 80 वी में हस्तांतरणAb हा (ए) या ​​अटल बिहारी cMyc (बी), क्रमशः, हॉर्सरैडिश peroxidase संयुग्मित विरोधी माउस आईजीजी द्वारा पीछा (1: 10,000 कमजोर पड़ने) और बढ़ाया chemiluminescence का पता लगाने: lidene difluoride झिल्ली, immunoblotting विश्लेषण (1,000 कमजोर पड़ने 1) का उपयोग किया गया (1 मिनट जोखिम)। सेल lysate के एक विभाज्य, मात्रा आईपी नमूनों में संसाधित के 1/50 वें के रूप में भी आणविक जन मानक सेवा करने के लिए शामिल किया गया था। 3 से संशोधित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 5
    चित्रा 5. क्रॉस को जोड़ने फ़्लोचार्ट। स्तनधारी कोशिकाओं, प्लाज्मिड एक्स के साथ ट्रांसफ़ेक्ट, homogenized और पार से जोड़ने की परख में glutaraldehyde साथ प्रतिक्रिया के अधीन हैं, एसडीएस पीए द्वारा पीछा कियाजीई और immunoblotting। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 6
    चित्रा 6 पार से जोड़ने इंगित करता है RyR2 एन टर्मिनस डोमेन tetramer गठन HEK293 कोशिकाओं cMyc टैग (BT4L) RyR2 एन टर्मिनस डोमेन के क्षणिक अभिव्यक्ति (अवशेषों 1 - 906) के लिए ट्रांसफ़ेक्ट थे।। सेल homogenate, एजेंट को कम करने dithiothreitol के साथ इलाज किया, संकेत समय बिंदुओं के लिए glutaraldehyde साथ incubated था। नमूने 5 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस पर गर्म और 3 घंटे के लिए 20 मा पर एसडीएस पृष्ठ (6% जेल) द्वारा सुलझाया गया। Polyvinylidene difluoride झिल्ली पर 2 घंटे के लिए 80 वी में प्रोटीन हस्तांतरण के बाद, immunoblotting विश्लेषण का उपयोग किया गया (1: 1,000 कमजोर पड़ने) अटल बिहारी cMyc, हॉर्सरैडिश peroxidase संयुग्मित विरोधी माउस आईजीजी (1 द्वारा पीछा किया:10,000 कमजोर पड़ने) और बढ़ाया chemiluminescence का पता लगाने (1 मिनट जोखिम)। Monomeric (एम: ~ 100 केडीए) और tetrameric (टी) रूपों तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं। 3 से संशोधित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    Discussion

    प्रोटीन होमो-oligomers के गठन के एक मौलिक जैविक प्रक्रिया है कि प्रतिलेखन कारक, एंजाइमों, आयन चैनल और रिसेप्टर्स 25,26 की गतिविधि को नियंत्रित करता है। महत्वपूर्ण बात है, प्रोटीन oligomerization भी neurodegeneration और arrhythmogenic हृदय रोग 4,27 सहित रोग प्रभाव पड़ता है। के तरीके में इस अनुच्छेद में उल्लिखित मध्यस्थता प्रोटीन स्वयं संघ और oligomerization डोमेन-डोमेन बातचीत की पहचान करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। नीचे, हम प्रत्येक प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम पर इंगित करें, और हम महत्वपूर्ण विचार, सीमाओं और निवारण पर चर्चा की।

    Y2H प्रणाली संभावित इसके अपेक्षाकृत उच्च throughput प्रदर्शन की वजह से बातचीत प्रोटीन भागीदारों, उपयोग की आसानी और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों के लिए स्क्रीन करने के लिए पहली नियोजित किया जा सकता है। Y2H प्रक्रियाओं मानक (प्लेट या प्रकार के बरतन) इन्क्यूबेटरों और कमरे रोकथाम सुविधाओं के साथ एक सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रयोगशाला में किया जाता है। मंगलवार के उपयोग केजबकि β-लड़की assays में अच्छे परिणाम के लिए, हौसले खमीर कालोनियों उगाया (वर्ष 5 दिनों के लिए) (कदम 1.2.3) का इस्तेमाल किया जाना चाहिए eshly तैयार सक्षम कोशिकाओं (कदम 1.1.8), उच्च दक्षता खमीर परिवर्तन के लिए महत्वपूर्ण है। Gal4 और / या अतिरिक्त / वैकल्पिक रिपोर्टर जीन के अलावा अन्य प्रतिलेखन कारकों पर आधारित सिस्टम उपलब्ध हैं, और इसलिए चारा और शिकार plasmids उचित Y2H तनाव के साथ मिलान किया जाना चाहिए।

    कुछ उपभेदों 3-अमीनो-1,2,4-triazole, HIS3 प्रोटीन की एक प्रतिस्पर्धी अवरोध की उपस्थिति में सुसंस्कृत होना चाहिए, आदेश HIS3 रिपोर्टर जीन 7.8 के किसी भी विधान अभिव्यक्ति बुझाने के लिए। चारा और लक्ष्य संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति 17 immunoblotting द्वारा सत्यापित किया जाना चाहिए। मामले में चारा / शिकार संलयन प्रोटीन खमीर को विषाक्त कर रहे हैं, कम सहनीय प्रोटीन का स्तर अलग वैक्टर जहां चारा / शिकार अभिव्यक्ति एक अलग प्रमोटर द्वारा संचालित किया जाता है में क्लोनिंग द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। इसके अलावा, यह टी सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैटोपी चारा / शिकार संलयन प्रोटीन स्वायत्त पत्रकार जीन गतिविधि प्रदर्शित नहीं करते। स्वायत्त पत्रकार जीन सक्रियण निर्माण को संशोधित जिम्मेदार क्षेत्र को हटाने के द्वारा बचाया जा सकता है, या दो का परीक्षण किया प्रोटीन के लिए GAL4 डीएनए बी और ई fusions गमागमन द्वारा। इसके अलावा, transmembrane डोमेन बेहतर चारा / शिकार निर्माणों से छोड़े गए हैं, क्योंकि वे intracellular झिल्ली डिब्बों में misfolding या संलयन प्रोटीन की mislocalization उत्पन्न हो सकता है। दरअसल, Y2H प्रणाली के मुख्य नुकसान यह है कि चारा और लक्ष्य प्रोटीन झूठी सकारात्मक या झूठी नकारात्मक बातचीत 6-9, जिसके परिणामस्वरूप में खमीर नाभिक में स्थानीय कर रहे हैं, विशेष बाद translational संशोधनों की कमी उनके शारीरिक subcellular स्थान से दूर है और संभावित है ।

    स्तनधारी heterologous अभिव्यक्ति सिस्टम बेहतर रचना, बाद translational संशोधनों और subcellular स्थानीयकरण के मामले में स्तनधारी अभिन्न झिल्ली प्रोटीन के अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं।सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया सेल अभिकर्मक तरीकों में से एक है, जिसका मुख्य कारण न्यूनतम उपकरणों की, कैल्शियम फास्फेट वर्षा है और अभिकर्मकों 11,15 की आवश्यकता है। वैकल्पिक तरीकों, अर्थात् electroporation, liposomes, cationic लिपिड और पॉलिमर, सेल लाइन के आधार पर उच्च अभिकर्मक दक्षता उपज और इस्तेमाल का निर्माण कर सकता है। सामान्य में, अभिकर्मक दक्षता को प्रभावित करने वाले कारकों प्राथमिक प्लास्मिड डीएनए गुणवत्ता और सेल स्वास्थ्य / व्यवहार्यता हैं। सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त कर रहे हैं जब उच्चतम शुद्धता के (260nm / 280nm absorbance के अनुपात ~ 1.8) और सक्रिय रूप से विभाजित कोशिकाओं के डीएनए का इस्तेमाल किया जाता है। 70% संगम (कदम 2.1.2), क्योंकि विदेशी डीएनए लेने की क्षमता मध्यम 11 से अवगत कराया सेल की सतह क्षेत्र से संबंधित है - कोशिकाओं इसलिए कोई 60 से अधिक पर ट्रांसफ़ेक्ट किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, अभिकर्मक (कदम 2.1.3) के दौरान संस्कृति के माध्यम में एंटीबायोटिक दवाओं के शामिल किए जाने से वृद्धि हुई कोशिका मृत्यु 15 के कारण सलाह नहीं दी है।

    एफया 2x HBS समाधान (कदम 2.1.1) की विशेष रूप से, सावधान तैयारी और पीएच समायोजन (7.05 ठीक करने के लिए) में कैल्शियम फास्फेट वर्षा, और प्लास्मिड डीएनए / कैल्शियम / जोरदार मिश्रण (कदम 2.1.5) द्वारा फॉस्फेट परिसरों की उचित गठन हैं उच्च दक्षता अभिकर्मक के लिए महत्वपूर्ण कदम। आमतौर पर, 24 के भीतर क्षणिक अभिकर्मक चोटियों से प्रोटीन अभिव्यक्ति - 72 घंटा।

    एक बार कोशिकाओं काटा जाता है, बाद में प्रक्रियाओं प्रोटीज गतिविधि को कम करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बाहर किया जाना चाहिए, और प्रोटीज अवरोधकों के अलावा सिफारिश की है। सेल homogenization क्योंकि गुणसूत्र डीएनए समाधान चिपचिपापन बढ़ाने के लिए और बढ़ाने के गैर विशिष्ट बंधन सकता नाभिक को हटाने के लिए एक centrifugation कदम से पालन किया जाना चाहिए। इस प्रकार, एक आईएसओ आसमाटिक बफर में यांत्रिक तरीकों से homogenization पसंद किया जाता है, आम तौर पर में (0.3 एम) सुक्रोज या (150 मिमी) सोडियम क्लोराइड। सामान्य में, सूक्रोज आधारित बफ़र्स प्रोटीन स्थिरता को बढ़ाने के लिए और संभावित गैर देशी प्रोटीन एकत्रीकरण को कम करने के लिए जाना जाता है, लेकिन पी के कारणप्रोटीन की सतह पर referential हाइड्रेशन, इलेक्ट्रोस्टैटिक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत इष्ट हैं। इसके विपरीत, नमक आधारित बफ़र्स प्रोटीन सतह पर आरोप लगाया अमीनो एसिड पक्ष समूहों का शुद्ध प्रभारी को प्रभावित करती है, इस प्रकार अधिक हाइड्रोफोबिक के आधार पर बातचीत 28 की दिशा में एक पूर्वाग्रह कर रही है।

    सह-आईपी विशेष रूप से देशी ऊतकों से प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का आकलन करने के लिए सबसे अधिक कार्यरत जैव रासायनिक परख है। इसके मुख्य दोष आईपी में इस्तेमाल करते हैं और 10,16,18 immunoblotting के लिए मान्य अति विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए आवश्यकता है। इस प्रकार, पुनः संयोजक प्रोटीन अक्सर एक पेप्टाइड मिलान के साथ टैग कर रहे हैं, उदाहरण के लिए।, इन्फ्लूएंजा hemagglutinin (YPYDVPDYA) या मानव cMyc (EQKLISEEDL), जिसके लिए उच्च आत्मीयता विशिष्ट एंटीबॉडी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। अगर वांछित, immunoprecipitating एंटीबॉडी रासायनिक प्रोटीन एक राल पर संयुग्मित किया जा सकता immunoblotting चरण के दौरान अपने क्षालन और पता लगाने के अस्पष्ट हो सकता है कि सह उपजी जनसंपर्क से बचने के लिएotein 16; इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, हम सफलतापूर्वक रासायनिक पार linker 3,3'-dithiobis (sulfosuccinimidylpropionate), 24 का इस्तेमाल किया है। यह जरूरी है कि एक उचित डिटर्जेंट आईपी बफर में शामिल है और homogenized कोशिकाओं के अघुलनशील सामग्री गैर विशिष्ट बंधन (कदम 3.1.3) को कम से कम करने के लिए centrifugation द्वारा हटा दिया जाता है। चुनाव और डिटर्जेंट की एकाग्रता महत्वपूर्ण विचार कर रहे हैं: मजबूत डिटर्जेंट और / या उच्च सांद्रता काफी बाध्यकारी गैर विशिष्ट कम हो जाएगा, लेकिन यह भी समाप्त हो सकती है x: y प्रोटीन बातचीत, कम सांद्रता या मामूली डिटर्जेंट की अनुमति हो सकती है, जबकि एक कमजोर बातचीत मनाया जा सकता है, लेकिन अत्यधिक गैर विशिष्ट बंधन में परिणाम। इंटरमीडिएट ताकत डिटर्जेंट पसंद कर रहे हैं, जैसे, ट्राइटन X-100 0.5 पर -। 1% एकाग्रता। आगे गैर विशिष्ट बंधन, एक तटस्थ प्रोटीन को कम करने के लिए (जैसे, 100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर में गोजातीय सीरम albumin) आईपी बफर में शामिल किया जा सकता है, और / या सेल lysate पूर्व Cleare जा सकती हैअकेले प्रोटीन एक राल के साथ पहले ऊष्मायन के साथ घ। washes की संख्या एक्स के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए: वाई जोड़ी का परीक्षण किया, आईपी बफर (कदम 3.1.9) के साथ आम तौर पर तीन 10 मिनट washes। किसी भी मामले में, immunoprecipitating एंटीबॉडी के रूप में गैर प्रतिरक्षा आईजीजी के साथ एक सह-आईपी नमूना हमेशा समानांतर में संसाधित किया जाना चाहिए के रूप में नकारात्मक नियंत्रण (कदम 3.1.6) सेवा के लिए।

    रासायनिक पार से जोड़ने का मुख्य लाभ यह है कि यह प्रोटीन होमो-oligomer की stoichiometric संरचना पर बताते है। Glutaraldehyde आमतौर पर इस्तेमाल किया पार linker क्योंकि यह कोई विशेष उपकरणों की आवश्यकता है और यह बातचीत प्रोटीन 19,20 के बीच thermally और रासायनिक स्थिर पार लिंक उत्पन्न करता है। मुक्त अमीनो समूहों के साथ यौगिकों परख बफ़र्स (कदम 3.2.1) से छोड़े गए किया जाना चाहिए, क्योंकि वे रासायनिक प्रतिक्रिया बुझाना होगा। Glutaraldehyde एकाग्रता और प्रतिक्रिया समय (कदम 3.2.4) ब्याज की oligomeric प्रोटीन परिसर के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। इस तकनीक, especi के मुख्य दोषसहयोगी जब पूरे सेल की तैयारियों पर प्रदर्शन किया, रासायनिक प्रतिक्रिया है कि कृत्रिम प्रोटीन समुच्चय है कि जैविक महत्व की कमी उपज सकता है की गैर विशिष्टता है।

    विवो में वैकल्पिक (जैसे।, प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण, द्वि-आणविक प्रतिदीप्ति या luminescence पूरक) और इन विट्रो तकनीक में (जैसे।, आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी, विश्लेषणात्मक ultracentrifugation, इज़ोटेर्माल अनुमापन उष्मामिति) प्रोटीन स्वयं संघ और मूल्यांकन के लक्षण वर्णन के लिए उपलब्ध हैं oligomerization stoichiometry 29,30 की। प्रत्येक विधि के अपने फायदे और नुकसान है, और यह एक विशेष प्रोटीन प्रोटीन शुद्धि / स्थिरता और उपकरण / अभिकर्मक उपलब्धता पर निर्भर करता है के अध्ययन के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है। तीन पूरक विस्तार, अर्थात् Y2H, सह आईपी और पार से जोड़ने में यहाँ वर्णित विधियों, संयोजन में इस्तेमाल किया गया है RyR2 होमो-oligome के लिए मजबूर सबूत प्रदान करने के लिएअलगाव में और एक जीवित कोशिका के भीतर आर गठन।

    Disclosures

    लेखकों की घोषणा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

    Acknowledgments

    इस काम के SZ (एफएस / 08/063 और FS / 15/30 / +३१,४९४) को ब्रिटिश हार्ट फाउंडेशन फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    PART 1 yeast two-hybrid
    Plate incubator Hereaus B6120 Used at 30 °C
    Orbital shaker incubator New Brunswick Scientific INNOVA 4300 Used at 30 °C with shaking at 230 - 250 rpm
    Spectrophotometer Perkin Elmer Lambda Bio+ To measure OD600 of yeast culture; to measure Absorbance at 420 nm in liquid b-Gal assay
    Matchmaker Two-Hybrid System 2 Kit Takara Clontech K1604-1 Contains bait vector pGBKT7, prey vector pACT2  and yeast strain Y190 
    Yeast Nitrogen Base Sigma-Aldrich Y0626 To prepare minimal SD growh medium 
    Dropout supplement lacking leucine and tryptophan Sigma-Aldrich Y0750 To prepare minimal SD growh medium 
    Dropout supplement lacking leucine, tryptophan, histidine Sigma-Aldrich Y2001 To prepare minimal SD growh medium 
    Herring testes carrier DNA  Takara Clontech 630440 For yeast transformation
    Whatman filter paper Grade 5  Sigma-Aldrich WHA1005070 for use in colony-lift filter paper b-Gal assay
    X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) Sigma-Aldrich B4252 for use in colony-lift filter paper b-Gal assay
    ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside) Sigma-Aldrich N1127 for use in liquid b-Gal assay
    PART 2. Protein expression in a mammalian cell line
    HEK293 cell line ATCC ATCC® CRL-1573™
    Humidified incubator (5% CO2, 37 °C) SANYO MCO-18AIC To culture mammalian cells
    DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium) Invitrogen (ThermoFisher) 41966 To prepare growth medium for mammalian cells
    Fetal Bovine Serum Invitrogen (ThermoFisher) 10500 To prepare growth medium for mammalian cells
    Glass beads Sigma-Aldrich G8772 To homogenise cells
    Needle 23 G (0.6 x 30 mm) BD Microlance 300700 To homogenise cells
    Protease inhibitor cocktail (Complete)  Roche 11873508001 To prevent proteolysis
    PART 3. In vitro biochemical methods 
    Mini-PROTEAN Tetra Cell (SDS-PAGE system) Bio-Rad 1658000EDU  For polyacrylamide gel electrophoresis
    Trans-Blot SD (Semi-dry transfer system) Bio-Rad 1703940 For electrophoretic transfer
    Compact X-ray film processor Xograph X4 For use in immunoblotting
    Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882 For use in chemical cross-linking
    Protein-A sepharose beads  GE Healthcare Life Sciences 17-5280-01  For use in co-IP assay
    Anti-HA (Y-11 rabbit polyclonal IgG) Santa Cruz Biotechnology sc-805 For use in co-IP assay
    Non-immune rabbit IgG Santa Cruz Biotechnology  sc-2027 For use in co-IP assay
    Anti-cMyc (9E10 mouse monoclonal IgG) Santa Cruz Biotechnology  sc-40 For use in immunoblotting
    Anti-HA (16B12 mouse monoclonal IgG) Covance MMS-101P For use in immunoblotting
    Anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz Biotechnology sc-2005 For use in immunoblotting
    Hyperfilm ECL GE Healthcare Life Sciences 28906836 For use in immunoblotting
    ECL Western Blotting Substrate Pierce (ThermoFisher) 32106 For use in immunoblotting

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    References

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    आण्विक जीवविज्ञान अंक 113 रासायनिक पार से जोड़ने सह immnoprecipitation स्तनधारी सेल अभिकर्मक oligomerization ryanodine रिसेप्टर स्वयं संघ खमीर दो संकर
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    Stanczyk, P. J., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study. J. Vis. Exp. (113), e54271, doi:10.3791/54271 (2016).

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