Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Genetiske og biokjemiske tilnærminger for Published: July 27, 2016 doi: 10.3791/54271
Automatic Translation
1, 1, 1
1Wales Heart Research Institute, Cardiff University School of Medicine, College of Biomedical and Life Sciences

Introduction

Skjelett- og hjertemuskulatur sammentrekning er utløst av sarkoplasmatisk retikulum Ca 2+ utgivelsen mediert av RyR. Det er tre pattedyr RyR-isoformer med den funksjonelle kanal sammensatt av fire identiske subenheter. Hver RyR subenhet består av et stort cytoplasmatisk regulatorisk N-terminale delen og en liten C-terminale del inneholdende de transmembranområdene som danner en høy-konduktans Ca2 + pore. Unormal intra- og inter-subenheten interaksjoner til grunn RyR kanal dysfunksjon og resultere i nevromuskulær og hjertesykdommer 1. Identifisering og karakterisering av bestemte domener som er involvert i RyR struktur: funksjon forholdet er derfor avgjørende for forståelsen av RyR patofysiologi.

Tradisjonelle biokjemiske protein-protein interaksjon teknikker kreve betydelige mengder renset protein, ofte produsert i bakterier. Dette er ikke mulig i tilfelle av RyR, en meget stor membran protein sammensatt av ~ 5000 aminosyrer, mens dets rekombinante fragmenter er ikke lett mottagelig for bakteriell ekspresjon og rensing. Således er alternative ekspresjonssystemer som omfatter eukaryote vertsceller som er nødvendig for pattedyr integrerte membranproteiner. Vi har tidligere benyttet Y2H, co-IP og tverrbindingsanalyser til kollektivt vise at N-terminale tetramerization er en strukturell funksjon som er konservert over tre pattedyr RyR isoformene 2,3. Viktigere, har vi funnet ut at et enkelt punkt mutasjon assosiert med arytmogene hjertesykdom forstyrrer N-terminale selv forening og resulterer i en dysfunksjonell RyR kanal 4. Vi har også anvendt disse metoder til oligomerisering studier av RyR cytoplasmatiske C-terminale hale 5 så vel som den N-terminale ende av den homologe intracellulær Ca2 + frigivelse kanalen, inositol 1,4,5 trisphosphate reseptor 2.

I Y2H assay den interactipå mellom to proteiner (X og Y) er målt ved rekonstituering av et funksjonelt transkripsjonsfaktor (GAL4) og den påfølgende aktivering av rapportørgener 6-9. To forskjellige kloningsvektorer blir brukt til å generere fusjoner av de to testede proteiner med de to fysisk adskillbare, uavhengige domener av GAL4: DNA-bindende domene (DNA-BD) / protein-X-fusjons (agn) og aktiverings Domene (AD) / protein-Y fusjon (mål). Den Y2H kan brukes til å teste hvorvidt et protein interagerer med seg selv ved å generere GAL4 DNA-BD og AD fusjoner av det samme proteinet. Genetisk modifiserte Y2H stammer er GAL4 og GAL80 mangelfull (den GAL80 proteinet er en repressor av GAL4), samt TRP1 og LEU2 mangelfull (for å tilveiebringe ernæringsmessig valg for agn og byttedyr plasmider, henholdsvis). I gjær kjernen, blir de rekombinante DNA-BD og AD peptider bringes i nær fysisk nærhet for å fremstille et hybrid-transkripsjonsfaktor GAL4 bare gjennom sine fusjoner 'X: Y interaction. Denne tilnærmingen muliggjør rask genetisk screening for å påvise protein-protein interaksjoner gjennom parallelltranskripsjonelle aktivering av prototrofe (HIS3-kodende for et enzym som er nødvendig for biosyntese histidin) og kromogen (LacZ som koder for β-galaktosidase (β-Gal)) rapportørgener. Den største fordelen med den Y2H er at det er en in vivo-analyse som detekterer selv svake eller forbigående protein-protein-interaksjoner. Videre omfatter deteksjon den enkle bruken av vekst seleksjon (i media som mangler histidin) eller av en kolorimetrisk (β-Gal) analyse uten behov for rensing av agn og målproteiner eller dannelse av spesifikke antistoffer. I tillegg kan den Y2H brukes til å screene en samling av tilfeldige ukjente kloner (kloner cDNA-bibliotek kondensert til GAL4 AD) for nye bindingspartnere av et agn protein, også gir direkte adgang til cDNA biblioteket proteinet.

For å forlenge Y2H observasjoner, independent biokjemiske teknikker kan benyttes. Co-IP og tverrbindingsanalyser kombinert med immunoblotting er metoder som brukes for å påvise protein foreninger i komplekse prøveblandinger, f.eks., Helcellelysater 10. Deres viktigste fordelen er at de rapporterer på protein-protein interaksjoner fra naturlig vev, i motsetning til andre fremgangsmåter som krever bruk av rekombinante proteiner. Rekombinante proteiner kan også anvendes, typisk uttrykt i en pattedyrcellelinje, hvor de er sannsynlig å ha sin korrekte konformasjon og post-translasjonelle modifikasjoner, så vel som subcellulære lokalisering. Imidlertid, siden ko-IP og tverrbinding er i vitro analyser som gjør bruk av homogeniserte celler, er det nødvendig å bekrefte hvorvidt de to proteinpartnere er co-lokalisert i den intakte cellen 11. Vi benytter rutinemessig transfeksjon av pattedyr HEK293 celler til forbigående å uttrykke pattedyr integral membran og cytosoliske proteiner ved hjelp av kalsiumfosfat-utfellingsmetoden 2-4,12-14, Som er beskrevet her i detalj. Dette er en billig måte for effektiv levering av plasmid DNA i celler, men den er avhengig av den spesielle cellelinje som brukes, og cellesammenløpet, samt renhet av plasmid DNA 11,15.

Den ko-IP måling involverer isolering av det naturlige eller rekombinante protein av interesse fra cellelysater under ikke-denaturerende betingelser som muliggjør at ko-rensning av mulige interaksjonspartnere 10,16. Den krever bruk av to uavhengige antistoffer, den immunoutfelling antistoffet for isolering av protein X, og immunoblotting antistoff for påvisning av proteinpartner Y. Den kan brukes til å teste hvorvidt et protein interagerer med seg selv ved å generere to forskjellige fusjoner med to forskjellig epitop tags (f.eks., HA og cMyc). Den immunoutfelling antistoffet er bundet gjennom sitt Fc-område på protein-A (eller protein-G, avhengig av dyrearten, hvor antistoffet ble hevet), hvilkener konjugert til agarose (eller sepharose) harpiks. Protein X utfelles ved antistoff: Protein-A-harpiks etter inkubasjon med cellelysatet, nemlig den vaskemiddel-oppløselige fraksjon av homogeniserte celler. Protein immuno-komplekser eluert med SDS-holdig buffer og deretter analysert ved hjelp av SDS-PAGE og immunblotting ved bruk av et antistoff for å påvise tilstedeværelse av protein Y-17. Co-IP-bør utføres med detergentløselige proteiner for å unngå overdreven ikke-spesifikk binding. Valg av vaskemiddel og dets konsentrasjon, samt antall vaskinger, bør optimaliseres for hver X: Y par 10,16,18.

Tverrbinding anvendes for å bestemme støkiometrien av den oligomere proteinkomplekset. Den er basert på en kjemisk reaksjon for å lage kovalente bindinger mellom tilstøtende samvirkende protomere, og derfor, det muliggjør bevaring av proteinets oligomere status ved SDS-PAGE separasjon. Det er mange kryssbinding reagents av ulike lengder og kjemi er målrettet mot forskjellige reaktive grupper på et proteiner, vanligvis primære aminer, karboksyl eller tiolgrupper. Her beskriver vi bruken av glutaraldehyd (OHC (CH2) 3 CHO), en homo-bi-funksjonelle tverrbindingsmiddel med to aldehydgrupper på hver ende som reagerer med frie aminogrupper som er tilstede i lysinrester 19,20. Tverrbinding er fulgt i en treringstrinnet eller tidsavhengig måte som resulterer i adduktdannelse. Glutaraldehyd reaksjonen stoppes med hydrazin (H 2 NNH 2) og proteinprøver blir deretter analysert ved SDS-PAGE og immunblotting 17 for å evaluere deres oligomerisering tilstand. Vi bør merke seg at kryssbinding induserer ikke oligomeriseringsprosessen men bare skaper stabile broer mellom eksisterende protein komplekser. Viktige hensyn ved gjennomføring av tverrbindingseksperimenter omfatter valget av kryssbindingsmiddel, dets konsentrasjon og reaksjonstiden 19,20.

Protocol

1. Gjær to-hybrid

  1. gjær Transformation
    1. Forbered følgende medier og buffere:
      1. Fremstille gjær fullstendig gjærekstrakt-pepton-glukose (YPD) medium ved å blande 20 g / l pepton, 10 g / l gjærekstrakt, 2% vekt / volum glukose (tilsatt etter autoklavering) og 20 g / l agar (for platene bare) ; Steriliser ved autoklavering og bruke frisk på dagen for eksperimentet.
      2. Fremstille gjær minimalt syntetisk definert (SD) medium (som mangler leucin og tryptofan for å holde selektivt press på begge agn og target plasmider) ved å blande 6,7 g / l gjærnitrogenbase, 1,6 g / l Fjerner supplement som mangler leucin og tryptofan, 2% vekt / v glukose (tilsatt etter autoklavering) og 20 g / l agar (for plater only); Steriliser ved autoklavering og bruke frisk på dagen for eksperimentet.
      3. Forbered 50% w / v PEG (polyetylenglykol) 3350; sterilisere gjennom et 0,2 mikrometer filter og oppbevares ved romtemperatur.
      4. Forbered 100 mM Tris / 10 mM EDTA (10x TE), justerepH til 7,5, sterilisere gjennom et 0,2 mikrometer filter og oppbevares ved romtemperatur.
      5. Forbered en M litiumacetatmetoden (10x LiAc); Juster pH til 7,5 med CH3COOH, sterilisere gjennom et 0,2 um filter og oppbevares ved romtemperatur.
    2. Gjenopplive den Y2H belastning (f.eks Y190) ved å stryke en liten mengde av det frosne glycerol lager på en YPD-plate. Inkuber ved 30 ° C inntil gjærkolonier nå ~ 2 mm i diameter (vanligvis 3 - 5 dager, avhengig av gjærstamme).
    3. Inokulere 0,5 ml av YPD (i et 1,5 ml rør) med en enkelt, stor (2 - 3 mm i diameter) koloni. Vortex kraftig for ~ 2 min for å spre noen klumper.
    4. Overfør cellesuspensjonen i en 500 ml kolbe inneholdende 50 ml YPD-medium. Inkuber ved 30 ° C i 16 - 18 timer med risting ved 250 rpm i gjær for å nå stasjonær fase.
    5. Overføring 4. - 5. ml av over natten-kulturen i 200 ml YPD (i en 1-liters erlenmeyerkolbe) for å fremstille en optisk tetthet ved 600 nm (OD 600, måltved hjelp av et spektrofotometer) på 0,2 - 0,3 (200 ml vil være tilstrekkelig for 20 transformasjoner).
    6. Inkuber ved 30 ° C med risting ved 250 rpm inntil cellene er i midt-log fase, det vil si, OD 600 = 0,5 til 0,6 (vanligvis 2 - 3 timer).
    7. Høste gjær ved sentrifugering (i 50 ml rør) ved 1500 xg i 5 min ved RT. Kast supernatanten, resuspender hver pellet i 5 ml sterilt H2O og basseng sammen.
    8. Re-sentrifuge ved 1500 xg i 5 min ved romtemperatur og kast supernatanten. Resuspender gjær pellet i 1 ml nylaget, sterile 1x LiAc / TE.
      MERK: Bruk kompetente gjærceller innen en time med forberedelser.
    9. Fremstille plasmid prøver (i 1,5 ml rør) ved tilsetning av 200 ng av plasmid-DNA for enkelttransformasjoner, eller 0,5 til 1 ug av hvert plasmid DNA for co-transformasjoner, og 100 ug av silde testiklene bærer-DNA (kokt i 20 minutter og avkjøles videre is like før bruk).
      MERK: Inkluder en positiv kontroll, for eksempel gjær.co-transformert med pVA3 (koding for GAL4 DNA-BD fusjon med p53 protein) og pTD1 (koding for GAL4 AD fusjon med SV40 stort T-antigen).
    10. Tilsett 100 av nylaget, kompetent gjærsuspensjonen (trinn 1.1.8) og 600 mL av 1x LiAc / PEG-oppløsning (8 ml lager PEG 3350, 1 ml lager TE, 1 ml lager LiAc) og vortex for ~ 30 sek. Inkuber ved 30 ° C i 30 minutter med risting ved 200 rpm.
    11. Legg 80 mL dimetylsulfoksyd (10% volum / volum sluttkonsentrasjon) og bland godt ved forsiktig omsnuing. Varmesjokk i 15 minutter i et 42 ° C vannbad mens det blandes med 2 - 3 min.
    12. Chill cellesuspensjonen på is i 2 min og sentrifuger ved 14 000 xg i 15 sekunder ved romtemperatur for å gjenvinne gjær.
    13. Resuspender cellepelleten i 100 ul 1x TE og platen på egnede minimale SD mediumskåler for selektiv vekst (medium som mangler leucin og tryptofan for å holde selektivt press på begge agn og mål-plasmider).
    14. Inkuber platene up-side-ned på 30° C inntil kolonier er ~ 2 mm i diameter (vanligvis 4 - 5 dager). Platene kan lagres ved 4 ° C i 2 - 3 uker; for lengre oppbevaring gjøre glyserol aksjer og oppbevar ved -80 ° C.
      MERK: Kontroller at agn og target-proteiner blir uttrykt i gjær ved immunoblotting 17, og at de ikke har autonom reportergen aktivering ved separat uttrykt i gjær (med β-Gal-analyse som beskrevet i avsnitt 1.3).
  2. Colony-lift filter papir β-Gal analyse
    1. Forbered følgende buffere:
      1. Fremstille Z-buffer inneholdende 100 mM Na HPO 2 til 4, 40 mM NaH 2PO 4, 10 mM KCl, 1 mM MgSO4; justere pH til 7,4. Steriliser ved autoklave og oppbevar ved romtemperatur.
      2. Fremstille X-Gal-buffer ved oppløsning av 5-brom-4-klor-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid i 20 mg / ml i N, N-dimetylformamid og lagre i mørket ved -20 ° C. Forbered Z buffer / X-Gal løsning. Gjør bufferfør bruk ved å blande X-Gal ved 0,33 mg / ml og β-mercaptoethanol ved 0,27% volum / volum i Z-buffer. Bruk 2,5 ml per prøve.
    2. Legg 2,5 ml av nyfremstilt Z-buffer / X-Gal-løsning i en ren 100 mm plate og sted inne i et cellulosefilterpapir.
    3. Sette inn et nytt filterpapir over overflaten av platen med gjærkolonier som skal bli analysert. Gni forsiktig filterpapiret på tallerkenen med pinsett og la for ~ 5 min for koloniene å feste.
      MERK: Behandle positiv kontroll parallelt, dvs. gjær co-transformert med pVA3 og pTD1..
    4. Løft filterpapiret og senk det (med tang) i en pool av flytende nitrogen i 30 sek (flytende nitrogen skal håndteres med forsiktighet, alltid bruke tykke hansker og vernebriller). La den frosne filterpapiret tine ved romtemperatur i ~ 2 min.
    5. Plasser filterpapir (kolonisiden opp) på toppen av pre-fuktet filterpapir inne i 100 mm plate, og inkuber ved 30 ° C.
    6. Sjekk med jevne mellomrom(Hvert ~ 30 min) for utseendet på blå kolonier. Gjær Y190 co-transformert med de positive kontroll plasmider (pVA3 + pTD1) vil bli blått innen 60 min (upubliserte observasjoner).
      MERK: Svak agn: target interaksjoner kan ta flere timer å produsere en positiv blå signal (unngå langvarig inkubasjon (> 8 timer) som kan gi falske positive resultater). For best resultat, bruk fersk co-transformerte kolonier, dvs. dyrket ved 30 ° C i 4 -. 5 dager, ~ 2 mm i diameter.
  3. Flytende kultur β-Gal Assay
    1. Forbered følgende buffere:
      1. Fremstille Z-buffer inneholdende 100 mM Na HPO 2 til 4, 40 mM NaH 2PO 4, 10 mM KCl, 1 mM MgSO4; justere pH til 7,4, sterilisere ved autoklave og oppbevar ved romtemperatur.
        1 M Na 2 CO 3; oppbevar ved RT.
      2. Forbered Z buffer / β-mercaptoethanol. Gjøre buffer før bruk ved tilsetning av β-mercaptoethanol ved 0,27% v /v i Z-buffer; bruke 700 mL per prøve. Forbered Z-buffer / ONPG løsning. Gjøre buffer før bruk ved å blande ONPG (o-nitrofenyl-β-D-galaktopyranosid) ved 4 mg / ml og β-mercaptoethanol ved 0,27% volum / volum i Z-buffer; bruke 160 mL per prøve.
    2. Bruke en enkel koloni for å inokulere 5 ml minimalt medium SD (som mangler leucin og tryptofan for å holde selektivt press på begge agn og målet plasmider) og inkuber ved 30 ° C i 16 - 18 timer med risting ved 250 rpm.
      MERK: Analyse fem separate kolonier co-transformert med de samme agn og målet plasmider.
    3. Overføre nok av over natten-kulturen til 10 ml friskt medium SD for å fremstille en OD 600 = 0,2 til 0,3. Inkuber ved 30 ° C med risting ved 250 rpm inntil cellene er i midt-log fase (OD600 = 0,5 til 0,6).
    4. Overfør 0,5 ml av gjærkultur i et 1,5 ml rør og sentrifuger ved 14 000 xg i 2 min ved RT. Spill den nøyaktige OD 600 når høst cells. Resuspender pellet i 100 ul Z-buffer; Dette vil resultere i et 5-ganger konsentrasjonsfaktor.
    5. Plasser røret i flytende nitrogen for ~ 1 min (flytende nitrogen skal håndteres med forsiktighet, alltid bruke tykke hansker og briller) og deretter i en 37 ° C vannbad i 3 min å tine. Gjenta dette fryse-tine syklus to ganger mer for å sikre cellene er brutt åpen.
    6. Sett opp en blank tube med 100 ul Z-buffer.
    7. Legg 700 ul Z-buffer / β-merkaptoetanol og 160 ul Z-buffer / ONPG til prøven og tomme tuber; starter tidtakeren og plasser i en 30 ° C inkubator.
    8. Sjekk med jevne mellomrom for gul farge å utvikle. Tilsett 400 ul av 1 M Na 2 CO 3 for å stoppe fargeutviklingen og registrere medgått tid i minutter. Gjær Y190 co-transformert med de positive kontroll plasmider (pVA3 + pTD1) blir gul i løpet av 60 min ..
      MERK: Svak agn: target interaksjoner kan ta flere timer å produsere en positiv gul signal For beste resultater ved å bruke ferskt ko-transformerte kolonier, dvs. dyrket ved 30 ° C i 4 -. 5 dager, ~ 2 mm i diameter.
    9. Sentrifuger ved 14.000 xg i 5 minutter ved romtemperatur for å pelletere celleavfallet og overføres supernatanten til en ren kyvette.
    10. Ved hjelp av et spektrofotometer, måle absorbansen ved 420 nm (A 420) av prøvene i forhold til de tomme (verdiene bør være mellom 0,02 til 1,0).
    11. Beregn β-galaktosidase-enheter, med en enhet defineres som den mengde som hydrolyserer 1 pmol av ONPG til o-nitrofenol og D-galaktose pr min per celle, i henhold til følgende formel:
      ligning 1 = β-galaktosidase-enheter
      Hvor: t: medgåtte tiden for inkubering (i minutter); jf.: konsentrasjonsfaktoren fra trinn 1.4.8, dvs. jf = 5; OD 600: når cellene ble høstet.

2. Protein Expression i en pattedyrcellelinje

  2. Forbered følgende medier og buffere:
    1. Fremstille vekstmedium ved blanding av DMEM med 4,5 g / l glukose, 10% volum / volum føtalt bovint serum og 2 mM L-glutamin; sterilisere gjennom et 0,2 mikrometer filter og oppbevares ved 4 ° C.
    2. Fremstille 2x Hepes-bufret saltvann (2x HBS) ved blanding av 280 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,5 mM Na HPO 2 til 4, 12 mM glukose, 50 mM Hepes; justere pH til 7,05, sterilisere gjennom et 0,2 mikrometer filter og oppbevares ved -20 ° C. Forbered 2,5 M CaCl 2. Steriliser gjennom et 0,2 mikrometer filter og oppbevares ved -20 ° C.
  3. En dag før transfeksjon, frø 1 - 2 x 10 6 HEK293 celler i en 100 mm petriskål for å være 60-70% konfluent den følgende dag. Kultur for 16 - 18 timer ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO2.
  4. På dagen for transfeksjon, fjern de gamle mellomstore og fôr celler med 10 ml frisk vekst medium.
    NOTAT: Antibiotika er utelatt fra kulturmediet i løpet av transfeksjon fordi de kan øke celledød.
  5. Fortynn 24 ug av plasmid-DNA (for ko-transfeksjoner, en like stor mol-forholdet mellom de to plasmider) og 60 pl 2,5 M CaCl2 i 600 ul totalvolum (laget med sterilt avionisert H2O) inne i et 1,5 ml rør; vortex å blande.
    MERK:. For høyeste transfeksjon effektivitet, bør plasmid DNA være av høyeste renhet, dvs. har et forhold Abs 260 / Abs 280 = ~ 1,8.
  6. Tilsett plasmid DNA / kalsium-løsning dråpevis inn i et 50 ml rør inneholdende 600 ul av 2x HBS mens stadig og kraftig blanding ved virvling. Inkuber i 20 minutter ved romtemperatur for å tillate dannelsen av kalsiumfosfat / plasmid-DNA komplekser.
  7. Etter 20 minutters inkubering, vortex kort og tilsett løsningen dråpevis til cellene for å dekke hele overflatearealet av 100 mm petriskål.
  8. Inkuber cellene ved 37 ° C i 5% CO
  9. Høste cellene 24 timer etter transfeksjon ved sentrifugering ved 1000 x g i 3 minutter ved romtemperatur og kast supernatanten. Cellepelletene kan oppbevares ved -80 ° C inntil behov.
    MERK: Expression vanligvis topper 24-72 timer etter transfeksjon.
  • Cell Homogenisering
    1. Forbered følgende buffere:
      1. Forbered Co-IP homogenisering buffer ved å blande 150 mM NaCl, 20 mM Tris; justere pH til 7,4 og oppbevares ved 4 ° C.
      2. Forbered Cross-linking homogenisering buffer ved å blande 5 mM Hepes, 0,3 M sukrose; justere pH til 7,4 og oppbevares ved 4 ° C (filter før bruk for å fjerne eventuelle partikler). Supplere med proteasehemmere før bruk.
    2. Tilsett 250 mL av glassperler (425 - 600 mikron) inne i et 1,5 ml tube og vask med 500 mL av homogenisering buffer. Pellet glassperler med en kort sentrifugeringpuls (1000 xg i 5 sek) og fjern supernatanten. Gjenta dette vasketrinn gang til.
    3. Resuspender cellepelleten (fra trinn 2.1.8) i 500 mL iskald homogeniseringsbuffer og overføre cellesuspensjonen inn i glassperler inneholdende rør.
    4. Homogenisere cellene på is med 20 passasjer gjennom en fin nål (23 g, 0,6 x 30 mm) som er knyttet til en 1 ml sprøyte. Med røret cap lukket, pierce gjennom den med nål og spre cellesuspensjon kraftig gjennom glassperler.
    5. Sentrifuger ved 1500 xg i 10 min ved 4 ° C for å fjerne kjerner og ubrutte celler og kast pellet. Lagre supernatanten representerer post-atomfraksjon og gå direkte til co-IP eller kryssbinding som passer.

    • 3. In vitro biokjemiske metoder

    1. Co-immunoprecipitation
      1. Forbered følgende buffere:
        1. Forbered Co-IP homogenisering buffer som beskrevet i section 2.2.1.1. Forbered IP-buffer ved å blande 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% (vekt / volum) CHAPS, 2 mM ditiotreitol (valgfritt, ditiotreitol kan inkluderes for å redusere proteinaggregater som kan ha blitt dannet på grunn av luftoksydasjon); justere pH til 7,4 og oppbevares ved 4 ° C.
        2. Forbered 2% w / v CHAPS i co-IP homogenisering buffer; oppbevar ved 4 ° C.
        3. Fremstille Protein-ladningsbuffer ved blanding av 60 mM Tris, 2% vekt / volum SDS, 10% volum / volum glycerol, 5 mM EDTA, 0,01% vekt / volum bromfenolblått, 2% volum / volum β-merkaptoetanol (valgfritt); justere pH til 6,8 og oppbevar ved romtemperatur.
      2. Homogenisere celler fra en sammenflytende 100 mm petriskål (~ 8 x 10 6 celler hvis HEK293, tellet ved anvendelse av et hemocytometer) som beskrevet i avsnitt 2.2.
      3. Oppløse den post-atom sub-cellulær fraksjon med 0,5% CHAPS (ved bruk av 2% lager) og inkubasjon i ≥2 timer ved 4 ° C under konstant blanding. Sentrifuger ved 20000 x g i 10 min ved 4 ° C for å pelletere uoppløselig materiale;al og kast pelleten. Lagre supernatanten betegnes cellelysat.
        MERK: Inkludering av en detergent og fjerning av det uoppløselige materialet er helt nødvendig for å minimere ikke-spesifikk binding. . Mellomliggende vaskemidler, f.eks CHAPS eller Triton X-100, ved en konsentrasjon på 0,2 - 1%, er de mest brukte.
      4. Fremstille to separate 1,5 ml rør og tilsett ~ 20 mL (avhengig av IgG-bindingskapasitet) av 6 mg / ml protein-A eller protein G-agarose (eller sepharose-kuler). Vask med 200 ul IP buffer.
        MERK: Velg riktig Ig-bindende harpiks avhengig av dyrearter som brukes til å heve immunoutfelling antistoff. Protein-G binder et bredere spekter av Ig-undertyper i forhold til protein-A.
      5. Gjenopprette perler ved sentrifugering ved 1500 x g i 2 min ved 4 ° C. Gjenta vask en gang med IP-buffer, deretter resuspender perlene i 200 ul av IP-buffer.
      6. Tilsett 1 ug (5 ng / mL) av immunoutfelling-antistoff eller ikke-immun IgG (itjene som negativ kontroll) i de to separate protein-A / G-inneholdende rør. Inkuber i ≥2 timer ved 4 ° C under konstant blanding.
        MERK: behandle alltid en negativ kontroll med bruk av ikke-immun IgG dannet i samme dyreart som immunoutfelling antistoff.
      7. Gjenopprette perler ved sentrifugering ved 1500 x g i 2 min ved 4 ° C og forsiktig kast supernatanten ved pipettering.
      8. Overfør 200 ul cellelysat (fra trinn 3.1.3) inn i hvert av de to rør med antistoff og protein-A / G-perler. Inkuber i ≥2 timer ved 4 ° C med kontinuerlig blanding for å gi rom for antigen-antistoff-binding.
      9. Gjenopprette perler og vask med 200 ul IP buffer; inkuberes i 10 min ved 4 ° C med blanding. Utvinne perler og vaskes to ganger mer (unngå multiple vaskinger som vil redusere både spesifikk og ikke-spesifikk binding). forkaste forsiktig supernatanten ved pipettering.
      10. Tilsett 30 ul protein-ladningsbuffer for å eluere immunoprecipitrerte proteiner. Sentrifuger ved 1500 xg i 2 min ved 4 ° C, kast perler og lagre supernatanten inneholder elueres co-IP prøven.
      11. For å bekrefte vellykket protein X nedbør, laste inn en liten mengde (1/10, 3 pl) av den ko-IP prøven på en SDS-PAGE-gel som skal analyseres ved immunoblotting 17 med antistoff som er spesifikt for protein X. inkluderer en delmengde av cellelysat å verifisere protein X uttrykk i prøven.
      12. For å teste for tilstedeværelse av ko-utfelt protein Y, laste resten (9/10 th, 27 ul) av den ko-IP-prøven på en separat SDS-PAGE-gel som skal analyseres ved immunoblotting 17 med antistoff som er spesifikt for protein Y. inkluderer en delmengde av cellelysatet for å bekrefte protein Y ekspresjon i prøven.
    2. Kjemisk Cross-linking
      1. Forbered følgende buffere:
        1. Cross-linking homogenisering buffer som beskrevet i punkt 2.2.1.1.
        2. Forbered 5x protein-ladningsbuffer ved blanding av 300 mM Tris, 10% vekt / volum SDS, 50% volum / volum glyserol, 25 mM EDTA, 0,05% vekt / volum bromfenol blå, 10% volum / volum β-merkaptoetanol (valgfritt); justere pH til 6,8 og oppbevares ved romtemperatur; varm ved 50 ° C før bruk.
      2. Homogenisere celler fra en sammenflytende 100 mm petriskål (~ 8 x 10 6 celler hvis HEK293, tellet ved anvendelse av et hemocytometer) som beskrevet i avsnitt 2.2.
        MERK: Sukrose (ved 0,3 M) blir brukt til å lage en iso-osmotisk buffer. Salt, for eksempel, 120-150 mM NaCl eller KCl kan brukes i stedet, avhengig av oligomere proteinkomplekset av interesse.
      3. Sentrifuger den post-atom sub-cellulær fraksjon ved 20.000 xg i 10 min ved 4 ° C for å pelletere proteinaggregater og lagre supernatanten. Ta åtte aliquoter på 20 ul hver (typisk ~ 20 ug protein) i separate 0,5 ml rør.
      4. Legg 0,0025% v / v glutaraldehyd til alle prøver og starte timeren. La hver av de åtte prøvene reagerer med glutaraldehyde ved RT i: 0, 2, 5, 10, 15, 20, 30, 60 min.
        MERK: Glutaraldehyde har to aldehydgrupper som reagerer med frie aminer. Unngå bruk av pH-buffere eller andre stoffer med primære aminogrupper fordi de vil slukke glutaraldehyd reaksjon.
      5. Stopp glutaraldehyd reaksjon på det angitte tidspunktet med 2% v / v hydrazin og legge til 5 pl 5x protein-lasting buffer å denaturere proteiner.
      6. Fortsett til SDS-PAGE og immunoblotting 17.

    Representative Results

    I det Y2H system, agnet: er byttet interaksjon innledningsvis testet ved gjærvekst seleksjon i medium som mangler (tryptofan, leucin og) histidin og deretter vurdert ved β-Gal enzymatisk aktivitetsanalyser (figur 1). Gjær dyrket i medium som mangler histidin har langsom veksthastighet som avhenger av styrken av agnet: byttet proteininteraksjon. Den β-Gal Analysen utføres i gjær (dyrket i medium som mangler bare tryptofan og leucin), enten som vokser på fast bærer (agar plater) eller i flytende kultur, og de sistnevnte ettergivende kvantitative resultater. Vi har med hell brukt Y2H å identifisere domene-domene interaksjoner innenfor RyR2 samt nye protein partnere 2-4,12,21,22. For eksempel, vist vi en serie overlappende konstruksjoner som spenner over hele lengden av RyR2 peptidsekvensen for samvirke med et N-terminalt fragment (AD4L: RyR2 rester 1-906 smeltet sammen med GAL4 AD). 3 Colony-lift filter papir β-Gal analyser produsert levende blå-farget gjær kolonier bare for BT4L: AD4L par (figur 2A), som viser at AD4L samhandler med seg selv, nemlig BT4L konstruere (RyR2 rester 1-906 smeltet sammen med GAL4 DNA-BD). Blek blå kolonier ble påvist for BT8: AD4L par som tyder på en sekundær svakere forbindelse med den ekstreme C-terminale domene (BT8), mens gjæren ko-transformeres med en hvilken som helst annen konstruksjon som forble hvit og derfor negativ for agn: rov proteininteraksjon. Kvantitative resultater, oppnådd ved væske β-Gal-analyser (figur 2B), er angitt robust BT4L: AD4L interaksjon tilsvarende i styrke til den kjente sammenheng mellom den p53-protein (pVA3) og SV40 stort T-antigen (pTD1), mens BT8: AD4L interaksjon var betydelig svakere (<10% i forhold til kontroll).

    Vi rutinemessig utføre co-IP eksperimenter (figur 3) following forbigående ekspresjon i en pattedyrcellelinje (HEK293), som uavhengig biokjemisk analyse for å forsterke Y2H funnene 2-4,12-14,21-24. For å verifisere RyR2 N-terminale ende selv-interaksjon, to separate plasmider som koder for RyR2 rester 1-906 merket med enten cMyc eller HA peptidepitopen (BT4L og AD4L, respektivt), ble ko-transfektert i HEK293-celler ved bruk av kalsiumfosfat-utfellingsmetoden 3. Den post-nukleær fraksjon av homogeniserte celler ble solubilisert med vaskemiddelblandingene CHAPS, og det uløselige materiale ble fjernet ved sentrifugering for å fremstille cellelysatet. Cellelysatet, behandles med reduksjonsmidlet ditiotreitol, ble deretter inkubert med Ab HA og Protein A-Sepharose-kuler for å immunoutfelle HA-merket AD4L. Co-IP prøver, eluert med SDS-holdig buffer, ble lastet på to separate SDS-PAGE-geler (1/10 og 9/10 th splitt) og analysert ved immunoblotting med Ab HA og Ab cMyc, respectively. Vellykket direkte IP av AD4L (~ 100 kDa) av Ab HA ble bekreftet ved immunblotting, men ikke i den negative kontroll ved hjelp av ikke-immun kanin-IgG (figur 4A). Viktigere, cMyc-merket BT4L (~ 100 kDa) ble gjenvunnet kun i den Ab HA IP, og ikke i den negative kontroll i fravær av immunopresipitert AD4L (figur 4B).

    Y2H og co-IP-analyser gitt konsistent bevis for RyR2 N-terminale selv interaksjon, men de gjorde ikke informere på oligomerisering status for N-terminal domene, nemlig om det danner bare dimer eller høyere komplekser. Det skal bemerkes at kompleksene vil dissosiere og bare de som består av underenheter vil bli detektert ved hjelp av SDS-PAGE på grunn av SDS og varmeindusert proteindenaturering avskaffe protein-protein-interaksjoner. For å overvinne dette, bruker vi kryssbinding (figur 5) som kjemisk og stabilt conjoins pre-eksisterende Proteinkonn oligomerer, hvis molekylvekt kan deretter bli undersøkt ved hjelp av SDS-PAGE størrelse separasjon 2-5. For eksempel, HEK293-celle som uttrykker homogenat cMyc-BT4L, behandlet med reduksjonsmidlet ditiotreitol, ble omsatt med glutaraldehyd og analysert ved SDS-PAGE og immunblotting ved bruk av Ab cMyc (figur 6). I tillegg til monomeren (~ 100 kDa), en høy molekylvekt proteinbånd på ~ 400 kDa ble påvist i en tidsavhengig måte, noe som indikerer RyR2 N-terminale tetramer formasjon 3. Spesielt, tetramer var de dominerende oligomere arter, med minimal dimer og trimer bånd observert. For å bestemme sin tilsynelatende molekylmassen ble BT4L oligomer separert gjennom 4-15% gradient SDS-PAGE-geler 3. Vi produserte den molekylære masse / gelretardasjon standardkurve ved bruk av proteinstandarder med en rekkevidde på 30-460 kDa, og vi beregnet oligomeren til å være 358 kDa 15 (n = 4). Denne tilsynelatende molekylmasse er i samsvar med en BT4L tetramer anordnet i enlukket sirkulær måte istedenfor i lineær form, som forventet fra anordningen av de fire underenheter innenfor det native RyR2-kanalen.

    Figur 1
    Figur 1. Y2H flytskjema. Gjær, co-transformert med agn og målet plasmider, er valgt for vekst i medium som mangler histidin og / eller analysert for β-Gal enzymatisk aktivitet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 2
    Figur 2. Y2H Foreslår RyR2 N-terminale Domain Self-interaksjon. (A) Skjematisk skildrer (agn) rekke menneskelige RyR2 overlappende proteinfragmenter testet i Y2H system for samhandling RyR2 N-terminal AD4L (byttedyr) konstruksjon med. Kvalitative resultater oppnådd ved koloni-løft filterpapir β-Gal analysene er angitt i "+" multipler eller "-" for negativ interaksjon (B) Kvantitativ væske β-Gal assays normalisert mot den positive kontroll (pVA3 koder for GAL4 DNA-BD. fusjon med p53 protein, pTD1 koder for GAL4 AD fusjon med SV40 stort T-antigen). Modifisert fra tre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 3
    Figur 3. Co-IP-flytdiagram. Pattedyrceller, ko-transfektert med plasmidene X og Y, er homogenisert og vaskemiddel-oppløst for å fremstille cellelysatet anvendes i co-IP-assay, etterfulgt av SDS-PAGE og immunoblotting.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 4
    Figur 4. Co-IP Indikerer RyR2 N-terminale Domain Selv samhandling i pattedyrceller. HEK293 celler ble ko-transfektert for transient co-uttrykk for cMyc-merket (BT4L) og HA-merket (AD4L) RyR2 N-terminale domenet ( rester 1-906). AD4L ble immunopresipitert med Ab HA fra CHAPS-oppløste og ditiotreitol-behandlede HEK293-lysat, mens som negativ kontroll, co-IP-analyser ble utført med ikke-immun kanin IgG. Immunoutfelte proteinene ble oppvarmet ved 85 ° C i 5 minutter og løses ved 20 mA i 3 timer gjennom separate 6% SDS-PAGE-geler lastet med 1/10 eller 9/10 th av IP-prøver. Etter protein overføring på 80 V for 2 timer på polyvinyyliden difluorid-membran, immunblotting-analyse ble utført ved anvendelse av (1: 1000 fortynning) Ab HA (A) eller Ab cMyc (B), henholdsvis, fulgt av pepperrot peroksidase-konjugert anti-mus IgG (1: 10.000 fortynning) og forbedret kjemiluminescens deteksjon (1 min eksponering). En alikvot av cellelysat, 1/50 th av volumet behandlet i IP-prøver, ble også inkludert for å tjene som molekylmasse standard. Modifisert fra tre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 5
    Figur 5. Kryssbindingsflytdiagram. Pattedyrceller transfektert med plasmid X, er homogenisert og underkastet en reaksjon med glutaraldehyd i tverrbindingsanalysen, etterfulgt av SDS-PAGE og immunoblotting. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 6
    Figur 6. Cross-linking Indikerer RyR2 N-terminale Domain Tetramer Formation HEK293 celler ble transfektert for forbigående uttrykk for cMyc-merket (BT4L) RyR2 N-terminale domenet (restene 1 - 906).. Cellehomogenatet, behandles med reduksjonsmidlet ditiotreitol, ble inkubert med glutaraldehyd for å få de angitte tidspunkter. Prøvene ble oppvarmet ved 85 ° C i 5 minutter og løses ved hjelp av SDS-PAGE (6% gel) ved 20 mA i 3 timer. Etter protein overføring på 80 V i 2 timer på polyvinylidendifluorid-membran, ble immunblotting-analyse utført ved anvendelse av (1: 1000 fortynning) Ab cMyc, etterfulgt av pepperrot peroksidase-konjugert anti-mus IgG (1:10000 fortynning) og forbedret kjemiluminescens deteksjon (1 min eksponering). Monomere (M: ~ 100 kDa) og tetramere (T) former er angitt ved pilene. Modifisert fra tre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Discussion

    Dannelsen av protein homo-oligomerer er en fundamental biologisk prosess som regulerer aktiviteten av transkripsjonsfaktorer, enzymer, ionekanaler og reseptorer 25,26. Viktigere, har protein oligomeriseringsprosessen også patologiske konsekvenser inkludert nevrodegenerasjon og arytmogene hjertesykdom 4,27. De metoder som er skissert i denne artikkelen brukes til å identifisere domene-domene interaksjoner formidler protein selv forening og oligomerisering. Nedenfor peker vi på kritiske trinnene i hver protokoll, og vi diskutere viktige hensyn, begrensninger og feilsøking.

    Den Y2H Systemet kan benyttes først å screene for potensielle samspill protein partnere på grunn av sin relativt høy gjennomstrømning screening, brukervennlighet og svært reproduserbare resultater. Y2H prosedyrer er utført i et mikrobiologisk laboratorium med standard (plate eller shaker) inkubatorer og rom containment fasiliteter. Bruken av freshly forberedt kompetente celler (trinn 1.1.8) er kritisk for høy effektivitet gjær transformasjon, mens det for de beste resultater i β-Gal analyser, fersk vokst gjær kolonier (opp til 5 dager gamle) bør brukes (trinn 1.2.3). Systemer basert på annet enn GAL4 og / eller ekstra / alternative reporter gener transkripsjonsfaktorer er tilgjengelig, og derfor agn og byttedyr plasmider bør matches med riktig Y2H belastning.

    Noen stammer som skal bli dyrket i nærvær av 3-amino-1,2,4-triazol, en konkurrerende inhibitor av HIS3-protein, for å slukke enhver konstitutiv ekspresjon av HIS3 reportergen 7,8. Uttrykk for agn og målet fusjonsproteiner bør verifiseres av immunoblotting 17. I tilfelle agn / byttedyr fusjonsproteiner er giftig for gjær, kan lavere akseptable proteinnivåer oppnås ved kloning i forskjellige vektorer hvor agnet / byttedyr ekspresjon drives av en annen promoter. Videre er det viktig å sikre tlue agn / byttedyr fusjonsproteiner viser ikke autonom reporter genaktivitet. Autonomous reporter gen aktivering kan bli reddet ved å endre konstruksjonen for å fjerne ansvarlig region, eller ved å bytte GAL4 DNA-BD og AD fusjoner for de to testede proteiner. Videre er transmembranområdene bedre utelatt fra agn / byttedyr konstruksjoner fordi de kan forårsake uriktig folding eller mislocalization av fusjonsproteiner i intracellulære membranlommer. Faktisk, er den største ulempen med den Y2H system som agn og target-proteiner er lokalisert i gjær kjernen bort fra deres fysiologiske subcellulære beliggenheten og potensielt mangler spesielle post-translasjonelle modifikasjoner, noe som resulterer i falske positive eller falske negative interaksjoner 6-9 .

    Pattedyr heterologe ekspresjonssystemer er bedre egnet for studier av pattedyr integrerte membranproteiner i form av conformation, post-translasjonelle modifiseringer og subcellulære lokalisering.En av de mest brukte celle transfeksjonsmetoder er det kalsiumfosfatutfelling, hovedsakelig på grunn av den minimale utstyr og reagenser nødvendig 11,15. Alternative metoder, nemlig elektroporering, liposomer, kationiske lipider og polymerer, kan gi høyere transfeksjonseffektiviteten avhengig av cellelinjen og konstruere brukt. Generelt er de viktigste faktorene som påvirker transfeksjonseffektiviteten er plasmid DNA kvalitet og celle helse / levedyktighet. De beste resultatene oppnås når plasmid-DNA av den høyeste renhet (260 nm / 280 nm absorbans-forhold på ~ 1,8) og aktivt delende celler brukes. Celler bør derfor transfekteres på ikke mer enn 60 - 70% konfluens (trinn 2.1.2), fordi evnen til å ta opp fremmed DNA er relatert til overflatearealet av cellen utsettes for mediet 11. I tillegg er inkludering av antibiotika i kulturmediet i løpet av transfeksjon (trinn 2.1.3) ikke anbefales på grunn av økt celledød 15.

    Feller kalsiumfosfat utfelling særlig nøye planlegging og pH-justering (til 7,05 presist) av 2x HBS-oppløsning (trinn 2.1.1), og riktig dannelse av plasmid DNA / kalsium / fosfat-komplekser ved kraftig blanding (trinn 2.1.5) ligger viktige skritt for høy effektivitet transfeksjon. Vanligvis protein uttrykk ved forbigående transfeksjon topper innen 24-72 timer.

    Når cellene er høstet, må påfølgende prosedyrer utføres ved 4 ° C for å minimalisere proteaseaktivitet, og tilsetning av protease-inhibitorer er anbefalt. Celle homogenisering bør følges av et sentrifugeringstrinn for å fjerne kjerner fordi kromosomalt DNA kan øke løsningens viskositet og øke ikke-spesifikk binding. Således, blir homogeniseringen ved hjelp av mekaniske midler i en iso-osmotisk buffer foretrekkes, vanligvis i (0,3 M) sukrose eller (150 mM) NaCl. Generelt er sukrose-baserte buffere er kjent for å forbedre proteinstabilitet og redusere potensiell ikke-nativt protein aggregasjon, men på grunn av phenvisnings hydrering på proteinflaten, er elektrostatisk protein-protein interaksjoner foretrukket. Omvendt, salt-baserte buffere påvirker nettoladningen av ladede aminosyre-sidegrupper på proteinflaten, og dermed ha en forspenning mot mer hydrofobe interaksjoner baserte 28.

    Co-IP-er den mest vanlig anvendt biokjemisk analyse for å vurdere protein-protein interaksjoner, spesielt fra opprinnelig vev. Dens viktigste ulempen er kravet for svært spesifikke antistoffer validert for bruk i IP og immunblot 10,16,18. Dermed er rekombinante proteiner ofte merket med en peptid-epitop, f.eks., Influensa hemagglutinin (YPYDVPDYA) eller human cMyc (EQKLISEEDL), hvor det høy-affinitet spesifikke antistoffer er kommersielt tilgjengelige. Om ønsket, kan den immunoutfelling antistoffet være kjemisk konjugert på protein-A-harpiks for å unngå dens eluering og deteksjon i løpet av immunblotting scenen som kan tilsløre det ko-utfelte protein 16; for å oppnå dette, har vi med hell brukt den kjemiske kryssbinder 3,3'-ditiobis (sulfosuccinimidylpropionate) 24. Det er viktig at et passende vaskemiddel er inkludert i IP-buffer, og det uoppløselige materiale av homogeniserte celler ble fjernet ved sentrifugering for å minimere ikke-spesifikk binding (trinn 3.1.3). Valget og konsentrasjonen av vaskemiddel er viktige betraktninger: sterkere vaskemidler og / eller høyere konsentrasjoner vil vesentlig redusere ikke-spesifikk binding, men kan også oppheve X: Y proteininteraksjon, mens lavere konsentrasjoner eller mildere detergenter kan tillate en svak interaksjon som skal følges, men kanskje resultere i store ikke-spesifikk binding. Mellomliggende styrke vaskemidler er foretrukket, for eksempel Triton X-100 0.5 -. 1% konsentrasjon. For ytterligere å redusere ikke-spesifikk binding, et nøytralt protein (for eksempel bovint serumalbumin ved 100 ug / ml) kan inkluderes i IP-buffer, og / eller cellelysatet kan forhånds Cleared med før inkubasjon med protein-A harpiks alene. Antall vaskinger bør optimaliseres for X: Y par testet, typisk tre 10-minutters vaskinger med IP-buffer (trinn 3.1.9). I alle fall bør en ko-IP-prøven med ikke-immun IgG som immunoutfelling antistoffet alltid bli behandlet parallelt for å tjene som negativ kontroll (trinn 3.1.6).

    Den største fordelen med kjemisk tverrbinding er at den informerer om den støkiometriske sammensetning av proteinet homo-oligomer. Glutaraldehyd er et vanlig kryss-linker fordi det krever ingen spesialutstyr, og det genererer termisk og kjemisk stabile kryssbindinger mellom samspill proteiner 19,20. Forbindelser med frie aminogrupper bør sløyfes fra analysebuffere (trinn 3.2.1) fordi de vil slukke den kjemiske reaksjonen. Glutaraldehyd-konsentrasjonen og reaksjonstiden (trinn 3.2.4) bør være optimalisert for de oligomere proteinkomplekset av interesse. Den største ulempen med denne teknikken, especially når den utføres på hele cellepreparater, er den ikke-spesifisiteten av den kjemiske reaksjon som kan gi kunstige proteinaggregater som mangler biologisk betydning.

    Alternative in vivo (f.eks. Fluorescens resonans energioverføring, bi-molekylær fluorescens eller luminescens komplementering) og in vitro-teknikker (f.eks., Størrelseseksklusjons-kromatografi, analytisk ultrasentrifugering, isoterm titrering kalorimetri) er tilgjengelige for å karakterisere proteinet selv-assosiasjon og vurdering oligomeriseringsgrad støkiometri 29,30. Hver metode har sine egne fordeler og ulemper, og det kan være mer egnet for studium av et spesifikt protein, avhengig av proteinrensing / stabilitet og utstyr / reagens tilgjengelighet. De tre komplementære metoder som beskrives her i detalj, nemlig Y2H, co-IP og kryssbinding, er blitt brukt i kombinasjon for å gi overbevisende bevis for RyR2 homo-oligomer dannelse isolert og i en levende celle.

    Disclosures

    Forfatterne har ikke noe å fortolle.

    Acknowledgments

    Dette arbeidet ble støttet av British Heart Foundation Fellowships til SZ (FS / 08/063 og FS / 15/30/31494).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    PART 1 yeast two-hybrid
    Plate incubator Hereaus B6120 Used at 30 °C
    Orbital shaker incubator New Brunswick Scientific INNOVA 4300 Used at 30 °C with shaking at 230 - 250 rpm
    Spectrophotometer Perkin Elmer Lambda Bio+ To measure OD600 of yeast culture; to measure Absorbance at 420 nm in liquid b-Gal assay
    Matchmaker Two-Hybrid System 2 Kit Takara Clontech K1604-1 Contains bait vector pGBKT7, prey vector pACT2  and yeast strain Y190 
    Yeast Nitrogen Base Sigma-Aldrich Y0626 To prepare minimal SD growh medium 
    Dropout supplement lacking leucine and tryptophan Sigma-Aldrich Y0750 To prepare minimal SD growh medium 
    Dropout supplement lacking leucine, tryptophan, histidine Sigma-Aldrich Y2001 To prepare minimal SD growh medium 
    Herring testes carrier DNA  Takara Clontech 630440 For yeast transformation
    Whatman filter paper Grade 5  Sigma-Aldrich WHA1005070 for use in colony-lift filter paper b-Gal assay
    X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) Sigma-Aldrich B4252 for use in colony-lift filter paper b-Gal assay
    ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside) Sigma-Aldrich N1127 for use in liquid b-Gal assay
    PART 2. Protein expression in a mammalian cell line
    HEK293 cell line ATCC ATCC® CRL-1573™
    Humidified incubator (5% CO2, 37 °C) SANYO MCO-18AIC To culture mammalian cells
    DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium) Invitrogen (ThermoFisher) 41966 To prepare growth medium for mammalian cells
    Fetal Bovine Serum Invitrogen (ThermoFisher) 10500 To prepare growth medium for mammalian cells
    Glass beads Sigma-Aldrich G8772 To homogenise cells
    Needle 23 G (0.6 x 30 mm) BD Microlance 300700 To homogenise cells
    Protease inhibitor cocktail (Complete)  Roche 11873508001 To prevent proteolysis
    PART 3. In vitro biochemical methods 
    Mini-PROTEAN Tetra Cell (SDS-PAGE system) Bio-Rad 1658000EDU  For polyacrylamide gel electrophoresis
    Trans-Blot SD (Semi-dry transfer system) Bio-Rad 1703940 For electrophoretic transfer
    Compact X-ray film processor Xograph X4 For use in immunoblotting
    Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882 For use in chemical cross-linking
    Protein-A sepharose beads  GE Healthcare Life Sciences 17-5280-01  For use in co-IP assay
    Anti-HA (Y-11 rabbit polyclonal IgG) Santa Cruz Biotechnology sc-805 For use in co-IP assay
    Non-immune rabbit IgG Santa Cruz Biotechnology  sc-2027 For use in co-IP assay
    Anti-cMyc (9E10 mouse monoclonal IgG) Santa Cruz Biotechnology  sc-40 For use in immunoblotting
    Anti-HA (16B12 mouse monoclonal IgG) Covance MMS-101P For use in immunoblotting
    Anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz Biotechnology sc-2005 For use in immunoblotting
    Hyperfilm ECL GE Healthcare Life Sciences 28906836 For use in immunoblotting
    ECL Western Blotting Substrate Pierce (ThermoFisher) 32106 For use in immunoblotting

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Seidel, M., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. Structural and functional interactions within ryanodine receptor. Biochem Soc Trans. 43 (3), 377-383 (2015).
    2. Zissimopoulos, S., Marsh, J., Stannard, L., Seidel, M., Lai, F. A. Amino-terminus oligomerisation is conserved in intracellular calcium release channels. Biochem J. 459 (2), 265-273 (2014).
    3. Zissimopoulos, S., et al. N-terminus oligomerization regulates the function of cardiac ryanodine receptors. J Cell Sci. 126 (Pt 21), 5042-5051 (2013).
    4. Seidel, M., Thomas, N. L., Williams, A. J., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. Dantrolene rescues aberrant N-terminus inter-subunit interactions in mutant pro-arrhythmic cardiac ryanodine receptors. Cardiovasc Res. 105 (1), 118-128 (2015).
    5. Stewart, R., Zissimopoulos, S., Lai, F. Oligomerization of the cardiac ryanodine receptor C-terminal tail. Biochem J. 376, 795-799 (2003).
    6. Deane, C. M., Salwinski, L., Xenarios, I., Eisenberg, D. Protein interactions: two methods for assessment of the reliability of high throughput observations. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 349-356 (2002).
    7. Fashena, S. J., Serebriiskii, I., Golemis, E. A. The continued evolution of two-hybrid screening approaches in yeast: how to outwit different preys with different baits. Gene. 250 (1-2), 1-14 (2000).
    8. Stynen, B., Tournu, H., Tavernier, J., Van Dijck, P. Diversity in genetic in vivo methods for protein-protein interaction studies: from the yeast two-hybrid system to the mammalian split-luciferase system. Microbiol Mol Biol Rev. 76 (2), 331-382 (2012).
    9. Yang, M., Wu, Z., Fields, S. Protein-peptide interactions analyzed with the yeast two-hybrid system. Nucleic Acids Res. 23 (7), 1152-1156 (1995).
    10. Elion, E. A. Chapter 8, Detection of protein-protein interactions by coprecipitation. Curr Protoc Immunol. , (2007).
    11. Kingston, R. E., Chen, C. A., Rose, J. K. Chapter 9, Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Mol Biol. , (2003).
    12. Lam, A. K., Galione, A., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. Hax-1 identified as a two-pore channel (TPC)-binding protein. FEBS letters. , (2013).
    13. Zissimopoulos, S., Lai, F. Interaction of FKBP12.6 with the cardiac ryanodine receptor C-terminal domain. J Biol Chem. 280, 5475-5485 (2005).
    14. Zissimopoulos, S., Thomas, N. L., Jamaluddin, W. W., Lai, F. A. FKBP12.6 binding of ryanodine receptors carrying mutations associated with arrhythmogenic cardiac disease. Biochem J. 419 (2), 273-278 (2009).
    15. Jordan, M., Wurm, F. Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate. Methods. 33 (2), 136-143 (2004).
    16. Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods Mol Biol. 424, 349-364 (2008).
    17. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
    18. Yang, W., Steen, H., Freeman, M. R. Proteomic approaches to the analysis of multiprotein signaling complexes. Proteomics. 8 (4), 832-851 (2008).
    19. Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37 (5), 790-796 (2004).
    20. Wine, Y., Cohen-Hadar, N., Freeman, A., Frolow, F. Elucidation of the mechanism and end products of glutaraldehyde crosslinking reaction by X-ray structure analysis. Biotechnol Bioeng. 98 (3), 711-718 (2007).
    21. Zissimopoulos, S., Lai, F. Central domain of the human cardiac muscle ryanodine receptor does not mediate interaction with FKBP12.6. Cell Biochem Biophys. 43, 203-220 (2005).
    22. Zissimopoulos, S., West, D., Williams, A., Lai, F. Ryanodine receptor interaction with the SNARE-associated protein snapin. J Cell Sci. 119, 2386-2397 (2006).
    23. Zissimopoulos, S., Docrat, N., Lai, F. Redox sensitivity of the ryanodine receptor interaction with FK506-binding protein. J Biol Chem. 282, 6976-6983 (2007).
    24. Zissimopoulos, S., Seifan, S., Maxwell, C., Williams, A. J., Lai, F. A. Disparities in the association of the ryanodine receptor and the FK506-binding proteins in mammalian heart. J Cell Sci. 125. 125 (Pt 7), 1759-1769 (2012).
    25. Ali, M. H., Imperiali, B. Protein oligomerization: how and why. Bioorg Med Chem. 13 (17), 5013-5020 (2005).
    26. Hashimoto, K., Panchenko, A. R. Mechanisms of protein oligomerization, the critical role of insertions and deletions in maintaining different oligomeric states. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20352-20357 (2010).
    27. Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 101-112 (2007).
    28. Chi, E. Y., Krishnan, S., Randolph, T. W., Carpenter, J. F. Physical stability of proteins in aqueous solution: mechanism and driving forces in nonnative protein aggregation. Pharm Res. 20 (9), 1325-1336 (2003).
    29. Gell, D. A., Grant, R. P., Mackay, J. P. The detection and quantitation of protein oligomerization. Adv Exp Med Biol. 747, 19-41 (2012).
    30. Kaczor, A. A., Selent, J. Oligomerization of G protein-coupled receptors: biochemical and biophysical methods. Curr Med Chem. 18 (30), 4606-4634 (2011).

    Tags

    Molecular Biology kjemisk kryssbinding co-immnoprecipitation pattedyrcelle transfeksjon oligomeriseringsprosessen ryanodine reseptor self-forening gjær to-hybrid
    Genetiske og biokjemiske tilnærminger for<em&gt; I Vivo</em&gt; og<em&gt; In Vitro</em&gt; Vurdering av Protein Oligomerisering: The Ryanodine Receptor Case Study
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Stanczyk, P. J., Lai, F. A.,… More

    Stanczyk, P. J., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study. J. Vis. Exp. (113), e54271, doi:10.3791/54271 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter