Summary
Bu yazıda, üç boyutlu (3D) tek tip diziler ekstraselüler matriks çevrili tanımlanan geometri epitel doku mühendisi yumuşak litografi tabanlı teknik anlatılmaktadır. Bu yöntem, hücre tipleri ve deneysel bağlamlarda çeşitli için uygun olan ve aynı çoğaltır yüksek verimli tarama sağlar.
Introduction
morfojenezi dallanma olarak bilinen kollara ayrılmış epitelyal dokuların gelişimi, hücre-türevli, fiziksel ve çevresel faktörler ile düzenlenir. meme bezinde, morfolojilerinden dallanma toplu hücre göçü bir ağaç gibi mimari oluşturur güdümlü aracılığıyla tekrarlanan bir süreçtir. İlk adım şube başlatılması ve uzama 1,2 izledi süt kanallarından birincil tomurcuğu oluşumu vardır. Çevredeki stromaya dalları Invasion ergenlik steroid hormonların sistemik salınımı ile indüklenir. Yeni birincil tomurcukları sonra varolan şube uçlarından başlatabilir ve bu süreç bir epitel ağacı 3 yaratmaya devam ediyor. Birçok önemli biyokimyasal sinyaller tespit edilmiş olmasına rağmen, bu karmaşık gelişim süreci şu anda eksiktir rehberlik hücre biyolojik mekanizmaların kapsamlı bir anlayış. Ayrıca, belirli ipuçlarının etkilere mekanik çalışmalar deney gelen yapısızlaştırmak zorin vivo likte olarak hassas uzaysal tedirginlikler ve ölçümler çoğu zaman mümkün değildir.
Böyle tüm organ kültürü, birincil organoids ve hücre kültür modelleri gibi üç boyutlu (3D) kültür teknikleri, sistematik doku morfolojilerinden 4-6 yatan mekanizmaları araştırmak için yararlı araçlardır. Bu hareketi, çoğalması ve farklılaşması dahil olmak üzere hücre davranışları çeşitli, bu gibi mekanik güçler ve biyokimyasal sinyallerin gibi, tek tek özel faktörlerin etkileri belirlemek için yararlı olabilir. 6 tasarlanan hücre kültürü modelleri, özellikle, hali hazırda pertürbasyon etkinleştirmek tek tek hücreler ile bunların mikro arasında.
Böyle bir kültür modeli a ile uyarılan zaman tutarlı ve tekrarlanabilir toplu göç dalları oluşturan kontrollü 3D yapısı ile örnek meme epitel doku mühendisi bir mikroüretim tabanlı bir yaklaşım kullanırppropriate büyüme faktörleri. modelin en büyük avantajı tam işlemek ve bu tür yüksek istatistiksel güven ile mekanik stres desen, fiziksel ve biyokimyasal faktörlerin etkilerini ölçmek için yeteneğidir. Bu teknik, bir araya hesaplama modelleme ile, daha önce meme epitelyal dokusunda ve dallı epitel 7-11 normal gelişimin rehberliğinde fiziksel ve biyokimyasal sinyallerin nispi katkılarını belirlemek için kullanılmıştır. Burada sunulan kolaylıkla hücreler ve hücre-dışı matrisi (ECM) jellerin diğer tiplerinin uzatılabilir, bu model, dokular, bina için ayrıntılı bir protokoldür ve terapötiklerinin test edilmesi için potansiyel bir araç olarak hizmet eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çözümler 1. hazırlanması
- Insülin, 5 mg / ml çözelti hazırlamak (çözücü, 100 ml, 500 mg insülin) O dH 2 5 mM, hidroklorik asit (HCI) ile toz haline getirilmiş insülin stokları sulandırmak. Damıtılmış su, 100 ml konsantre HCI, 50 ul ekleyerek çözücü 100 ml (DH 2 O) hazırlayın.
- PBS 1x solüsyon yapmak için, steril koşullar altında DH 2 O 1x, 10x, fosfat tamponlu tuz (PBS) stok çözeltisi seyreltilir.
- şöyle polidimetilsiloksan (PDMS) bir elastomer çözeltisi hazırlayın: 1 (ağ: ağ) oranı, bir 10 ısıyla sertleştirme maddesi ile bir araya PDMS prepolimeri karıştırın.
- aşağıda hücre kültür ortamı hazırlayın: Hazır Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı 500 ml: Besin Karışımı, F-12 (DMEM / F-12), 10, steril fetal sığır serumu ml (FBS), gentamisin reaktif 500 ul ve ek 5 mg / ml insülin, 500 ul.
- (w% 1 ekleyin, 1 x PBS çözeltisi içinde% 1 sığır serum albümini (BSA) hazırlamak için: BSA tozu v) çözeltisi PBS 1x ve iyice karıştırın.
- ekleyin I kolajen nötralize sığır tipi bir 4 mg / ml çözelti hazırlamak için, 50 ul 10x Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) tampon maddesi, 30 ul 0.1 N sodyum hidroksit (NaOH), 30 ul hücre kültür ortamı ve hazır kollajen 400 ul soğutulmuş 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne. Yukarı ve aşağı pipetleme yavaş yavaş karıştırın; kabarcıkları almaktan kaçınması. Herhangi bir kabarcıklarını çıkarmak için, kısaca 4 ° C'de karışım santrifüj.
- 4 (v: v) 1 x PBS içinde% 16 paraformaldehit 1 seyrelterek bir sabitleyici çözelti hazırlayın.
- 1,000 (v: v) stok çekirdekleri etiketleme çözümü 1 seyreltilmesi ile bir çekirdek etiketleme çözümü hazırlayın 1x PBS içinde.
- Deterjan:% 0.3 (v v) ile 1X PBS karıştırılarak% 0.3 fosfat tamponlu tuzlu su ve deterjan (PBST) çözeltisi hazırlayın.
- % 0.3 PBST: keçi serumu 01:10 (v v) seyreltilmesi ile engelleme tampon hazırlayın.
- PRI seyrelterek, ilgilenilen özel bir protein için bir birincil antikor çözeltisi hazırlayın(Örneğin, tavşan anti-fokal yapışma kinaz (FAK)) Mary antikoru 1: 200 (hacim: hacim) blokaj tamponunda.
- (V v) blokaj tamponunda 1.000 (örneğin, keçi anti-tavşan) 1 floresan prob ve konjüge olmamış antikor seyrelterek bir ikincil antikor çözeltisi hazırlayın.
3D micropatterning Elastomerik Pullar 2. Hazırlık
Not: Elastomerik pulları PDMS ile yapılır.
- Adım 1.3 açıklandığı gibi aynı oranda bir PDMS çözüm yapmak ve iyice karıştırın. Karıştırma işlemi sırasında oluşan olan tüm hava kabarcıklarını çıkarmak için 15-30 dakika süreyle bir vakumlu odasında karışımın yerleştirin.
- tekne ya da lithographically istenen geometri özellikleri ile desenli bir silikon ustası içeren Petri kabı tartın bir plastik içine Tolüen dökün. En iyi sonuçları elde etmek için, 12 saat ~ 60 ° C'de PDMS çözeltisi tedavi.
Not: silikon ustaları son derece özelleştirilebilir; Bu protokol 50 ölçülerinde dikdörtgen yapılar kullanırmm x 200 mm x 50 mm 200 mm aralıklı. Silikon Masters, standart fotolitografi teknikleri kullanılarak yapılabilir. Kısaca, bir epoksi-bazlı fotorezist silikon göbeğin üzerine spin-kaplanır. İstenilen damga özelliklerini ayrıntılı bir maske daha sonra UV ışığına maruz fotorezist kaplı gofret, üstüne yerleştirilir. maske tarafından bloke istenen özellikleri ışığa maruz kalır ve ışığa dirençli kaplamanın geri kalanı çözünür olduğu ve yıkanmasını edilebilir ise bu yerlerde fotorezist, çapraz bağlanmış olur. - PDMS silikon ana istenilen özelliklere etrafında tamamen donduktan sonra plastik bir kaba gelen PDMS ve master'ı çıkarın. Dikkatle silikon gofret PDMS ayırmak ve temiz bir jilet kullanarak baskılı özellikleri çevresinde aşırı PDMS çıkarın.
- Hemen bir jilet ile tek tek dikdörtgen pullar halinde kalıplanmış özelliklerine (~ 8 mm x 5 mm), desenli PDMS kesti. Bir cle bu özellik yan-up MağazaBir 100 mm çaplı Petri kabı.
- Ayrıca, dikdörtgen pulları için destek yapmak için adım 1.3 açıklanan PDMS çözümü kullanın.
- bir eğirme kaplayıcı kullanılarak, 100 mm çapında bir Petri tabağına eşit PDMS çözeltisi ~ 2-3 g yaymak ve adım 2.1 60 ° C'de ~ 12 saat boyunca PDMS tedavi. Sonra, bir jilet kullanarak, dikdörtgenler içine PDMS ince bir tabaka (~ 5 mm x 2 mm) kesti.
Not: İki destekler adım 2.3 yapılan her PDMS damga için gereklidir. destekleri PDMS pulları içeren 100 mm çapında Petri kabındaki saklanabilir. - PDMS pulları ve destekler hücre kültürü için kullanılmadan önce, bir biyogüvenlik kabini içinde bir aspiratör (hücre kültürü kaput) kullanılarak% 70 etanol ve kuru batırılarak sterilize edin.
3D Epitel Dokuların 3. hazırlanması
- Bir biyo-güvenlik kabini, her pul en PBS içinde% 1 BSA, yaklaşık 50 ul'lik bir damla ekleyin. Bir mini 4 ° C'de pul kaplı damlacık yerleştirin4 saat içinde anne BSA damgası yüzeyine adsorbe sağlamak.
- PDMS pul aspire BSA çözüm.
- Her yıkamadan sonra aspire, hücre kültür ortamı (pul her yıkama başına 50 ul yeterli olmalıdır) ile iki kez pul yüzeyleri yıkayın.
- Kavisli paslanmaz çelik cımbız kullanarak sterilize PDMS pulları ve destekleri anlaştım. Her damgası PDMS için bir biyogüvenlik kabini, bir 35 mm çaplı doku kültürü çanak yatıyordu. her yemeğin, PDMS pul uzunluğu biraz daha az bir mesafe ile ayrılmış iki PDMS destekler uzandı.
- cımbız kullanarak, birçok yuvarlak cam lamelleri sterilize (çapı 15 mm, # 1)% 70 etanol kullanarak PDMS pulları olduğu gibi. cımbız ile onları tutarken lamelleri fazla sıvıyı aspire. Ayrı bir 100 mm çapında Petri kabındaki yıkandı lamelleri saklayın.
- ~ Kollajen karışımı 50 ul eşit kat, her yüzey damgası PDMS için dağıtın.
- AlmakHer kollajen kaplı PDMS cımbızla damga ve onları hafifçe ters çevirin. PDMS üstüne ters pullar indirin 35 mm çaplı doku kültüründe ortaya koydu destekler kollajen mühür ve doku kültürü çanak alt arasında olacak şekilde bombeli. 30 dakika boyunca 37 ° C 'de yemekler inkübe edin.
- Dairesel lamelleri her birine ~ kalan kollajen karışımı 50 ul koyun ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe (daha sonra bu, tamamen kollajen bunları kapsüllemek için mühendislik dokularının üzerine yerleştirilir).
- % 40 konfluansa ~ epitel hücreleri (ör. EpH4 fare meme epitelyal hücreleri) ihtiva eden bir 100 mm çaplı bir doku kültürü çanağı elde edilir. Hücre kültür ortamı aspire edildi ve PBS 1x 10 ml ile bir kez yıkanır. hücrelere tripsin 2 ml ilave edilir ve 5-10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- doku kültürü çanağı, tripsinize edilmiş hücre ihtiva eden çanak kalan yapışık hücreler ayırma taze kültür ortamı 8 ml ekleyin. pipetleme ile yavaşça karıştırın ve 5 dakika boyunca 100 x g 'de 15 ml konik bir tüp ve santrifüj hücre karışımı hareket ettirin.
- Konik tüpten aspire ve hücre kültür ortamı içinde hücre pelletini. hücreler bir hemasitometre kullanarak saymak süspansiyon konsantrasyonunu belirlemek için. 10 6 -10 7 hücre / ml ~ nihai bir konsantrasyon elde etmek için süspansiyon ses seviyesini ayarlayın.
- inkübatör jölelenmişti kollajen örnekleri çıkarın. cımbız kullanarak, yavaşça kalıplı kollajen onları ayırmak ve onları atmak için düz yukarı PDMS pulları kaldırın.
- istenen geometriye kalıplanmış boşluklar içeren her kollajen jel yüzeyi üzerine ~ konsantre hücre süspansiyonu 30 ul koyun. Hafifçe yemekler yan sallayarak boşlukları içinde yerleşen hücreyi teşvik yan ise 10X / 0.25 NA amacı ile bir aydınlık mikroskop altında hücreleri gözlemleyin. boşluklar ~ 5 dakika içinde doldurulması gerekmektedir.
- rBoşlukların etrafında aşırı hücre birikimleri temizlenmelidir yan, her bir doku kültürü çanağı eğim ve yavaşça kollajen jel yüzeyi üzerine hücre kültürü ortamında ul 400 ~ dağıtın. Her yıkama arasında mikroskop altında kolajen jelleri kontrol sıvı aspire ve yıkama 1-2 kez daha tekrarlayın.
- fazla hücreler kolajen kalıp hücre dolu boşlukların etrafında temizlendikten sonra, 15 dakika boyunca 37 ° C'de bir hücre kültür inkübatörü içine doku kültür kaplarına yerleştirin. Ardından, cımbız kullanarak, yavaşça kollajen kaplı sınıf lamelleri ters ve lamelleri kollajen hücre dolu boşlukların üzerine bir kap oluşturduğu hücre dolu kollajen kalıpların üstüne koyun. 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Kollajen kapaklar hücre dolu kollajen kalıba yapıştırılır sonra, jeller üstüne cam lamel üzerinde yavaşça ~ 2-2.5 ml hücre kültür ortamı dağıtmak. Kültür 1-3 gün boyunca 37 ° C 'de örnekler.
Not:24 saat ilk ekimden sonra epitel dokular, epidermal büyüme faktörü (EGF) veya dal uyarılması için hepatosit büyüme faktörü (HGF) gibi büyüme faktörleri ile muamele edilir.
4. İmmünofloresan ve Görüntü Analizi
- Doku kültür kaplarından, hücre kültür ortamı aspire ve hücre-ihtiva eden jeller karşılamak için yeterli sabitleyici solüsyonu ekleyin. 200 rpm'de bir çalkalayıcıda 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin yemekler.
- , Fiksatif aspire 1X PBS ile doku kültür kaplarına doldurun ve 200 rpm'de bir çalkalama 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Üç toplam yıkar iki kez tekrarlayın.
- Doku kültürü çanak aspire PBS ve Hoechst çözümü ile değiştirin: çekirdekleri etiketlemek için. 15-20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. FAK veya antikorlar ile saptanabilir başka marker için leke, 4.5 adıma geçin.
- nükleer etiketleme çözeltisi aspire ve hücre-ihtiva eden g yıkamakAşama 4.2 olarak 1 x PBS ile üç kez kavuşmaktadır. Lekeli örnekler sonraki kullanıma kadar 4 ° C 'de 1 x PBS içinde saklanabilir.
- , PBS aspire doku kültür kaplarından% 0.3 PBST 300 ul ve 15 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir örnek: ilgi konusu bir protein için leke için.
- PBS aspire Blokaj tamponu ile jeller kapak ve ~ 4 saat boyunca oda sıcaklığında bir çalkalama (200 rpm) üzerinde inkübe edin.
- Aspire bloke tamponu, primer antikor çözeltisi ile jeller kapağı ve 4 ° C'de bir gece 200 rpm'de bir çalkalama üzerinde inkübe edin.
- Primer antikor çözeltisi aspire% 0.3 PBST solüsyonu ekleyin ve 30 dakika için oda sıcaklığında 200 rpm'de bir çalkalama üzerinde inkübe edin. PBST aspire ve 3-4 saat süreyle her 30 dakikada bir tekrarlayınız.
- Tekrarlayın 4.7 ve 4.8, ikincil antikor çözeltisi ile inkübe bu kez yineleyin. İkincil antikor photobleaching önlemek için alüminyum folyo ile doku kültür tabaklarında sarın. fina sonraL yıkama, lekeli numuneler sonraki kullanıma kadar 4 ° C 'de 1 x PBS içinde saklanabilir.
- Örnekleri görselleştirmek için, epitel dokuda midplane odaklanmış bir 10X / 0.30 NA objektif kullanın.
- Hücre çekirdekleri, UV aydınlatma altında 10X / 0.30 NA objektif kullanarak bir nükleer işaretleyici ile etiketlenmiş görüntü sabit örnekleri görselleştirmek için.
- Ters bir floresan mikroskopu üzerinde bir 10X / 0.30 NA objektif kullanılarak ilgi konusu bir protein, görüntü için boyandı örnekleri görselleştirmek için.
- aynı ilk geometri birçok dokuda (tipik olarak 50 veya daha fazla) protein boyama frekans haritalar oluşturmak için, ilk ithalat standart görüntü analiz yazılımı kullanarak her görüntü (Malzeme) ve 8-bit gri tonlama onları dönüştürmek.
- Bu görüntülerin eşik için, gri tonlama kesme noktası tanımlayarak ikili (yani, yarım ton / siyah ve beyaz) onları dönüştürmek; eşiğin altına gri tonlama değerleri siyah olur ve eşiğin üstünde o beyaz olur. Daha sonra, kombinetek bir görüntü yığını içine bireysel ikili görüntülerin her.
- Sonraki yığılmış görüntüleri kayıt (yani hizalamak veya onları maç) analiz yazılımı. Birçok görüntü analiz yazılımı paketleri serbestçe kullanılabilir kayıt eklentisi ile geliyor.
- sonraki görüntüye uyum için bir şablon olarak bir yığın her görüntü kullanın, tüm yığın görüntüleri yayılması ile hizalanır şekilde. Son olarak, bindirme (proje) ortalama yoğunluğuna dayalı hizalanmış görüntü yığınında görüntüleri piksel frekansı harita ile tek bir görüntü oluşturmak için. Bu görüntü daha sonra renk kodlu seçim 10,11 görüntü düzenleme yazılımını kullanarak olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Meme epitelyal dokusu mikroimalat genel şematik
Deneysel çalışma akışını özetleyen mikroimalat prosedürünün genel şematik Şekil 1'de gösterilmiştir. Sonuçta tamamen bir ECM jel içinde gömülü olan özdeş geometri ve aralık epitel dokuda bir dizidir. Temsili deney I, 4 mg / ml bir konsantrasyonda kolajen sığır türü bir jel içinde kültürlenmiş EpH4 fare meme epitelyal hücreleri kullanılmaktadır. Mühendislik dokuların en yüksek kaliteyi sağlamak için, protokolde belirtilen teknikler yakından takip edilmelidir. Bir tür içine kalıp edilmiştir dikdörtgen kuyuların diziler Şekil 2A ve 2B gösteri düşük ve yüksek büyütme görünümleri Hücre tohumlama öncesinde jel kollajen. Kuyuların şekli silikon ana özelliklerin şekli tarafından belirlenir. Inci kaldırmak önemlidiryukarı doğru kollajen e PDMS kalıp boşluğu geometrisi deforme etmek için özen gösterilmelidir. Şekil 2C, bir tür dikdörtgen kuyu gösterilmektedir I (aşırı hücre kollajen yüzeyinden yıkanmış) meme epitel hücreleri ile doldurulmuştur kolajen jel. Bu örnekte, her bir 200 mm x 50 mm, dikdörtgen de yaklaşık 80-100 hücreler içerir.
Büyüme faktörlerinin eklenmesi morfojenezi indükler
Tohumlamadan 24 saat sonra, dokular morfojenezi dallanma model HGF ve EGF gibi ve birkaç gün boyunca kültürlendi büyüme faktörleri ile muamele edilebilir. Tipik olarak, dalları gibi erken büyüme faktörü stimülasyon sonrasında 4 saat olarak oluşmaya başlar. Şekil 3A Ben, 24 saat mikroimalat işlemden sonra jel kollajen bir tür içinde dikdörtgen meme epitel dokulardan temsili sonuçlar gösterir cel sonrals kollajen ve birbirlerine yapıştırılır var. Şube büyüme faktörü ilavesinden önce görülmektedir. Şekil 3B, 10 ng / ml'de HGF eklenerek 24 saat sonra dallanma maruz bırakılan bir Örnek dikdörtgen doku gösterir. Bu durumda, dallar hücrelerin en yüksek mekanik stres 9 deneyim (orta karşıt olarak) doku uçlarında meydana gelir. Aynı jel özdeş ilk geometri birden fazla dokular daha sonra yüksek verimlilik analizi sağlayarak, şube konumu ve şube uzunluğu nüfus ortalamalarını belirlemek için görüntülü olabilir.
İmmünfloresan boyama protein lokalizasyonu görselleştirmek için
Kültür modelinde doku dizilerinin İmmünfloresan boyama bize yüksek istatistiksel güven ile bir doku içinde protein lokalizasyonu belirlemek için izin verir. Şekil 4A Repre gösterirfokal yapışma kinaz (FAK) boyanmış bir dallanma dikdörtgen meme epitelyal doku silci oluşur. aynı geometri dokuların frekans haritalar oluşturma diğer proteinler lokalizasyonu ve dallanma etkinliği ile karşılaştırılabilir dokularda ilgi konusu olan proteinlerin, ortalama mekansal lokalizasyonu görselleştirmek için kullanılabilmektedir. Şekil 4B genellikle oluşur dallanma dikdörtgen dokuların, kısa ucunda FAK zenginleştirme gösteren 50 dokular için ortalama FAK boyama frekans haritasını gösterir.
Şekil 1. Şematik mikroimalat prosedürü özetleyen. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. mikroimalat sürecinde çekilen görüntüler. (A) Alçak ve (B) ve türü dikdörtgen boşlukların yüksek büyütme faz-kontrast görüntüleri ben bir elastomer PDMS kalıp kullanılarak oluşturulan kollajen'in. (A) ve (B) (C) Boşluklar meme epitelyal hücreleri ile doldurulmuştur. Ölçek barlar, 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. microfabricated dokular morfolojilerinden dallanma tabi. Mikrofabrikasyon sonra temsili dikdörtgen doku 24 saat (A) Faz-kontrast görüntü. (B) re Faz-kontrast görüntü10 ng / ml'de HGF ilavesinden sonra 24 saat dallanma geçmesi başlamıştır Sunuş dikdörtgen doku. Beyaz oklar yeni oluşan dalları gösterir. Ölçek barlar, 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Mikrofabrike dokuların Şekil 4. immünofloresan boyama. Dalı başlatılmasından sonra meme epitelyal dokusunda FAK (A) 'immünofloresan boyama. (B) 50 dokularda ortalama FAK boyama frekans haritası. Ölçek barlar, 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH (HL118532, HL120142, CA187692), David ve Lucile Packard Vakfı, Camille ve Henry Dreyfus Vakfı ve Burroughs hibe tarafından kısmen desteklenmiştir Fonu hoş geldiniz. ASP Charlotte Elizabeth Procter yüceltici Kardeşliği tarafından kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| PDMS curing agent | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| Lithographically patterned silicon master | self-made | N/A | |
| Plastic weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-115 | |
| 100-mm-diameter Petri dishes | BioExpress | D-2550-2 | |
| Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH2O |
| Razor blade | American Safety Razor | 620179 | |
| 1:1 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium : Ham’s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1) | Hyclone | SH30023FS | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| 10x Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Life Technologies | 14185-052 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I6634-500MG | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| 10x Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 221465-500G | |
| Bovine type I collagen (non-pepsinized) | Koken | IAC-50 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | A-7906 | |
| Curved stainless steel tweezers | Dumont | 7 | |
| 35-mm-diameter tissue culture dishes | BioExpress | T-2881-6 | |
| 15 ml conical tubes | BioExpress | C-3394-2 | |
| 1.5 ml Eppendorf Safe-Lock Tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter | Bellco Glass Inc. | Special order | |
| 0.05% 1x Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Paraformaldehyde | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Perkin Elmer | N9300260 | Detergent |
| HGF | Sigma Aldrich | H 9661 | Resuspended in dH2O at 50 mg/ml |
| Rabbit anti-mouse FAK antibody | Life Technologies | AMO0672 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Life Technologies | A-11034 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | N/A | Used for color-coding pixel frequency maps. |
| FIJI (ImageJ) | NIH | N/A | Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images. |
References
- Affolter, M., et al. Tube or not tube: remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Dev Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
- Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K signaling in the regulation of branching morphogenesis. Biosystems. 109 (3), 403-411 (2012).
- Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).
- Fata, J. E., et al. The MAPK(ERK-1,2) pathway integrates distinct and antagonistic signals from TGFalpha and FGF7 in morphogenesis of mouse mammary epithelium. Dev Biol. 306 (1), 193-207 (2007).
- Ip, M. M., Darcy, K. M. Three-dimensional mammary primary culture model systems. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1 (1), 91-110 (1996).
- Lo, A. T., Mori, H., Mott, J., Bissell, M. J. Constructing three-dimensional models to study mammary gland branching morphogenesis and functional differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 103-110 (2012).
- Nelson, C. M., Vanduijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures. Science. 314 (5797), 298-300 (2006).
- Gjorevski, N., Nelson, C. M. Endogenous patterns of mechanical stress are required for branching morphogenesis. Integr Biol (Camb). 2 (9), 424-434 (2010).
- Gjorevski, N., Nelson, C. M. Mapping of mechanical strains and stresses around quiescent engineered three-dimensional epithelial tissues. Biophys J. 103 (1), 152-162 (2012).
- Gjorevski, N., Piotrowski, A. S., Varner, V. D., Nelson, C. M. Dynamic tensile forces drive collective cell migration through three-dimensional extracellular matrices. Sci Rep. 5, 11458 (2015).
- Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K regulates branch initiation and extension of cultured mammary epithelia via Akt and Rac1 respectively. Dev Biol. 379 (2), 235-245 (2013).
- Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
- Hirai, Y., et al. Epimorphin functions as a key morphoregulator for mammary epithelial cells. J Cell Biol. 140 (1), 159-169 (1998).
- Pavlovich, A. L., Manivannan, S., Nelson, C. M. Adipose stroma induces branching morphogenesis of engineered epithelial tubules. Tissue Eng Part A. 16 (12), 3719-3726 (2010).
