Summary
توضح هذه المخطوطة تقنية القائم على الطباعة الحجرية الناعمة لهندسة صفائف موحدة للثلاثي الأبعاد (3D) الأنسجة الطلائية للهندسة المعرفة وتحيط بها المصفوفة خارج الخلية. هذا الأسلوب هو قابل للمجموعة واسعة من أنواع الخلايا والسياقات التجريبية ويسمح لفحص عالية الإنتاجية من مكررات متطابقة.
Introduction
تطوير الأنسجة الظهارية تشعبت، والمعروفة باسم المتفرعة التشكل، وينظم من قبل، والعوامل البيئية المادية المستمدة من الخلية. في الغدة الثديية، المتفرعة التشكل هو عملية تكرارية من خلالها الموجهة الهجرة الخلية الجماعية تخلق بنية تشبه شجرة. الخطوة الأولى هي تشكيل برعم الأساسي من قنوات الحليب، تليها بدء فرع واستطالة 1،2. وبفعل غزو فروع في سدى المحيطة الإفراج النظامية من هرمونات الستيرويد في سن البلوغ. ثم بدء براعم ابتدائية جديدة من نهايات الفروع القائمة، وتستمر هذه العملية لإنشاء شجرة الظهارية 3. على الرغم من أن تم التعرف على العديد من الإشارات البيوكيميائية المهمة، فهم شامل لآليات الخلية البيولوجية التي توجه هذه العملية التنموية المعقدة تفتقر حاليا. وعلاوة على ذلك، دراسات الميكانيكية على تأثيرات منبهات معينة يصعب تفكيك من من experiالإدلاء بالبيانات في الجسم الحي، اضطرابات والقياسات الزمانية المكانية كما دقيقة وغالبا ما تكون غير ممكنة.
ثلاثي الأبعاد (3D) تقنيات زراعة، مثل ثقافة بأكملها الجهاز، organoids الابتدائي، ونماذج ثقافة الخلية، أدوات مفيدة للتحقيق منهجي الآليات الكامنة التشكل الأنسجة 4-6. هذه يمكن أن تكون مفيدة بشكل خاص لتحديد تأثيرات عوامل محددة بشكل فردي، مثل القوى الميكانيكية والإشارات البيوكيميائية، على مجموعة متنوعة من السلوكيات الخلية، بما في ذلك الهجرة، والانتشار، والتمايز. 6 المهندسة نماذج ثقافة الخلية، على وجه الخصوص، تمكن بسهولة اضطراب من الخلايا الفردية والمكروية بهم.
يستخدم نموذج واحد ثقافة هذا النهج القائم على التصنيع الدقيق لهندسة الأنسجة الظهارية الثديية نموذجية مع هيكل 3D للرقابة التي تشكل على الدوام وبتكاثر الفروع التي تهاجر بشكل جماعي عندما الناجم مع لعوامل النمو ppropriate. والميزة الرئيسية لهذا النموذج هو القدرة على التعامل بدقة وقياس آثار العوامل الفيزيائية والكيميائية الحيوية، مثل أنماط من إجهاد، مع الثقة إحصائية عالية. هذا الأسلوب، جنبا إلى جنب مع النمذجة الحاسوبية، وقد تم بالفعل تستخدم لتحديد المساهمات النسبية للإشارات الجسدية والكيميائية الحيوية في توجيه التطور الطبيعي للأنسجة الظهارية الثديية وغيرها من ظهائر متفرعة 7-11. المقدمة هنا هو بروتوكول مفصلة لبناء هذه الأنسجة النموذج، والتي يمكن أن تمتد بسهولة إلى أنواع أخرى من الخلايا والمصفوفة خارج الخلية (ECM) والمواد الهلامية، والتي هي بمثابة أداة محتملة لاختبار العلاجات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد حلول
- لإعداد 5 ملغ / مل حل الأنسولين، يخفف من الأسهم الأنسولين مسحوق مع 5 ملم حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك) في DH 2 O (500 ملغ الأنسولين في 100 مل المذيبات). إعداد 100 مل المذيبات وذلك بإضافة 50 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك المركز إلى 100 مل من الماء المقطر (DH 2 O).
- لجعل 1X حل من برنامج تلفزيوني، وتمييع الحل الأسهم 10X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ل1x أخرى مع DH 2 O تحت ظروف معقمة.
- إعداد ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) المطاط الصناعي الحل كما يلي: خلط prepolymer PDMS مع وكيل علاج في نسبة 10:: 1 (ث ث).
- إعداد خلية ثقافة المتوسط على النحو التالي: 500 مل من الأسهم Dulbecco لتعديل النسر متوسطة: خليط المغذيات F-12 (DMEM / F-12)، إضافة 10 مل من معقم مصل بقري جنيني (FBS)، و 500 ميكرولتر من كاشف جنتاميسين، و 500 ميكرولتر من 5 ملغ / مل الانسولين.
- لإعداد 1٪ مصل بقري الزلال (BSA) في حل برنامج تلفزيوني 1X، إضافة 1٪ (ث: •) حل من مسحوق جيش صرب البوسنة 1X برنامج تلفزيوني وتخلط جيدا.
- لإعداد 4 ملغ / مل حل من نوع البقري تحييد أنا الكولاجين، إضافة 50 ميكرولتر 10X هانك في محلول ملحي متوازن (HBSS) العازلة، 30 ميكرولتر 0.1 N هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم)، 30 ميكرولتر مستنبت الخلية، و 400 ميكرولتر من الكولاجين الأسهم إلى 1.5 مل أنبوب microcentrifuge المبردة. مزيج ببطء عن طريق pipetting صعودا وهبوطا، تجنب إدخال فقاعات. لإزالة أي فقاعات، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة الخليط في 4 درجات مئوية.
- يعد حل تثبيتي عن طريق تمييع 16٪ امتصاص العرق 1: 4 (ت: ت) في برنامج تلفزيوني 1X.
- يعد حل نوى وضع العلامات عن طريق تمييع نوى الأسهم العلامات الحل 1: 1000 (ت: ت) في برنامج تلفزيوني 1X.
- إعداد 0.3٪ الفوسفات مخزنة المالحة والمنظفات (PBST) حل عن طريق خلط برنامج تلفزيوني 1X مع 0.3٪ (ت: ت) المنظفات.
- إعداد عازلة تمنع عن طريق تمييع مصل الماعز 01:10 (ت: ت) في 0.3٪ PBST.
- يعد حل الأجسام المضادة الأولية لبروتين معين من الاهتمام عن طريق تمييع الحزب الثوري المؤسسيماري الأجسام المضادة (على سبيل المثال، أرنب المضادة للتنسيق التصاق كيناز (FAK)) 1: 200 (ت: ت) في عرقلة العازلة.
- يعد حل الضد الثانوية عن طريق تمييع الأجسام المضادة مسبار مترافق فلوري (على سبيل المثال، الماعز المضادة للأرنب) 1: 1000 (ت: ت) في عرقلة العازلة.
2. إعداد طوابع المرنة لMicropatterning 3D
ملاحظة: تتم الطوابع المرنة مع PDMS.
- جعل حل PDMS على نفس النسبة كما هو موضح في الخطوة 1.3 و تخلط جيدا. ضع الخليط في فراغ الغرفة ل15-30 دقيقة لإزالة أي فقاعات الهواء التي تم تقديمها خلال عملية الخلط.
- من أجل حل نزع الغاز في البلاستيك وزن القارب أو طبق بتري تحتوي على درجة الماجستير السيليكون الذي هو نمط lithographically مع ميزات للهندسة المطلوب. للحصول على أفضل النتائج، وعلاج حل PDMS على 60 درجة مئوية لمدة 12 ساعة ~.
ملاحظة: السيليكون سادة قابلة للتخصيص للغاية. يستخدم هذا البروتوكول الهياكل مستطيلة ذات أبعاد من 50متباعدة ميكرون × 200 ميكرون × 50 ميكرون 200 ميكرون بعيدا. ويمكن إجراء سادة السيليكون باستخدام تقنيات ضوئيه القياسية. لفترة وجيزة، وتدور المغلفة ومقاومة للضوء من الإيبوكسي على رأس رقاقة السيليكون. يتم وضع قناع تفاصيل ملامح الطوابع المطلوبة على أعلى الرقاقة المغلفة مقاومة للضوء، الذي هو ثم تتعرض لضوء الأشعة فوق البنفسجية. ويتعرض الميزات المطلوبة لا يعوقها قناع للضوء ومقاوم الضوء في هذه المواقع يصبح crosslinked، في حين أن ما تبقى من طلاء مقاوم الضوء قابل للذوبان ويمكن غسلها بعيدا. - بعد الشفاء من PDMS حول السمات المرغوبة على سيد السيليكون، وإزالة PDMS والماجستير من وعاء من البلاستيك. بعناية فصل PDMS من رقاقة السيليكون وإزالة PDMS الزائدة من حول ميزات مطبوع باستخدام شفرة حلاقة نظيفة.
- الآن قطع PDMS منقوشة مع ميزات مطبوع في الطوابع مستطيلة الفردية (~ 8 مم × 5 ملم) بشفرة حلاقة. تخزين هذه الميزة على جانب المتابعة في شركة كليطبق بيتري 100 ملم القطر.
- بالإضافة إلى ذلك، استخدام حل PDMS هو موضح في الخطوة 1.3 لجعل الدعم للطوابع مستطيلة.
- باستخدام المغطي تدور، انتشرت ~ 2-3 غرام من حل PDMS بالتساوي على 100 ملم قطرها طبق بتري وعلاج PDMS ل~ 12 ساعة على 60 درجة مئوية كما في الخطوة 2.1. ثم، باستخدام شفرة حلاقة، وقطع طبقة رقيقة من PDMS إلى مستطيلات (~ 5 مم × 2 مم).
ملاحظة: هناك حاجة لاثنين من الدعم لكل ختم PDMS في الخطوة 2.3. ويدعم يمكن تخزينها في 100 ملم قطرها طبق بتري الذي يحتوي على PDMS الطوابع. - قبل الطوابع PDMS والدعم يمكن أن تستخدم لزراعة الخلايا، وتعقيم عن طريق الغمر في 70٪ من الإيثانول والجافة باستخدام الشافطة في خزانة السلامة البيولوجية (خلية ثقافة هود).
3. إعداد 3D طلائي الأنسجة
- في خزانة السلامة البيولوجية، إضافة قطرة من ما يقرب من 50 ميكرولتر من 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني على رأس كل طابع. وضع قطرة مغطاة الطوابع في 4 درجة مئوية لمدة مصغرةأمي من 4 ساعات للتأكد من أن BSA تمتز على سطح الختم.
- حل نضح جيش صرب البوسنة من الطوابع PDMS.
- غسل الأسطح من الطوابع مرتين مع خلية ثقافة المتوسط (50 ميكرولتر لكل يغسل في ختم ينبغي أن يكون كافيا)، الشفط بعد كل غسل.
- التعامل مع PDMS الطوابع والدعم تعقيمها باستخدام منحني ملاقط الفولاذ المقاوم للصدأ. في خزانة السلامة البيولوجية، وضع واحد 35 ملم قطرها طبق زراعة الأنسجة لكل PDMS الطوابع. في كل طبق، وضع اثنين PDMS الدعم مفصولة مسافة أقل قليلا من طول الطوابع PDMS.
- باستخدام الملقط، تعقيم العديد من coverslips الزجاج الدائرية (15 مم في القطر، رقم 1) كما أن هناك PDMS الطوابع باستخدام الايثانول 70٪. نضح السوائل الزائدة من لل coverslips في حين عقد لهم مع ملاقط. تخزين لل coverslips غسلها في 100 ملم قطرها طبق منفصل بيتري.
- الاستغناء ~ 50 ميكرولتر من مزيج الكولاجين لبالتساوي معطف سطح كل PDMS الطوابع.
- امسككل PDMS المغلفة الكولاجين ختم مع ملاقط وعكس لهم بلطف. خفض الطوابع مقلوب على أعلى PDMS يدعم المنصوص عليها في نسيج الثقافة 35 ملم قطرها زعته مثل أن الكولاجين هو بين الطابع والجزء السفلي من صحن زراعة الأنسجة. احتضان الأطباق عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- الاستغناء ~ 50 ميكرولتر من مزيج الكولاجين المتبقية على كل لل coverslips دائرية (في وقت لاحق، سيتم وضع هذه على أعلى من الأنسجة المهندسة لتغليف تماما لهم في الكولاجين)، واحتضان لهم عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- الحصول على طبق زراعة الأنسجة 100 ملم القطر التي تحتوي على الخلايا الظهارية (على سبيل المثال. EpH4 الماوس الخلايا الظهارية الثديية) في ~ 40٪ confluency. نضح مستنبت الخلية ويغسل مرة واحدة مع 10 مل برنامج تلفزيوني 1X. إضافة 2 مل من التربسين إلى الخلايا واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقيقة.
- إضافة 8 مل من مستنبت الطازجة إلى الطبق زراعة الأنسجة التي تحتوي على الخلايا trypsinized، فصل أي الخلايا الملتصقة المتبقية من الطبق. المزيج بلطف قبل pipetting ونقل خليط الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 100 × ز لمدة 5 دقائق.
- نضح طاف من أنبوب مخروطي الشكل و resuspend بيليه خلية في خلية ثقافة المتوسط. باستخدام عدادة الكريات، عد الخلايا لتحديد تركيز التعليق. ضبط حجم تعليق للحصول على التركيز النهائي من ~ 10 6 -10 7 خلية / مل.
- إزالة عينات الكولاجين تبلور من الحاضنة. باستخدام الملقط، ورفع بلطف PDMS الطوابع مباشرة صعودا إلى فصل لهم من الكولاجين مصبوب والتخلص منها.
- الاستغناء ~ 30 ميكرولتر من تعليق خلية تتركز على سطح كل هلام الكولاجين تحتوي على تجاويف مصبوب الهندسة المرجوة. مراقبة الخلايا تحت المجهر brightfield مع الهدف NA 10X / 0.25 بينما تهز بلطف الأطباق الجانبية إلى جنب لتعزيز خلية تسوية داخل تجاويف. يجب ملء تجاويف داخل ~ 5 دقائق.
- إلى remove الخلايا الزائدة من جميع أنحاء تسوس الأسنان، وإمالة كل طبق زراعة الأنسجة على جانبها والاستغناء بلطف ~ 400 ميكرولتر مستنبت الخلايا على سطح الهلام الكولاجين. نضح السائل وتكرار غسل 1-2 مرات أكثر، والتحقق من المواد الهلامية الكولاجين تحت المجهر بين كل غسل.
- بعد أن تم مسح الخلايا الزائدة من جميع أنحاء تجاويف مملوءة خلية في قالب الكولاجين، ووضع أطباق زراعة الأنسجة في حاضنة الثقافة خلية عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ثم، وذلك باستخدام الملقط، عكس بلطف لل coverslips الطبقة المغلفة الكولاجين ووضعها على رأس قوالب الكولاجين مليئة الخلية بحيث الكولاجين من لل coverslips يشكل الغطاء على تجاويف مملوءة الخلية. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- مرة واحدة انضمت القبعات الكولاجين الكولاجين العفن مليئة الخلية، والاستغناء ~ 2-2.5 مل خلية مستنبت ببطء على مدى ساترة الزجاج على رأس المواد الهلامية. ثقافة العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 1-3 أيام.
ملاحظة:24 ساعة بعد الغرس الأولي، والأنسجة الطلائية يمكن علاجها مع عوامل النمو مثل عامل نمو البشرة (EGF) أو عامل النمو الكبدية (HGF) للحث على المتفرعة.
4. المناعي وتحليل الصور
- نضح مستنبت الخلية من أطباق زراعة الأنسجة وإضافة ما يكفي من حل تثبيتي لتغطية المواد الهلامية التي تحتوي على الخلية. احتضان الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة على شاكر في 200 دورة في الدقيقة.
- نضح تثبيتي، وملء أطباق زراعة الأنسجة مع برنامج تلفزيوني 1X، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة على شاكر في 200 دورة في الدقيقة. كرر مرتين لمدة ثلاث إجمالي يغسل.
- لتسمية نوى: نضح في برنامج تلفزيوني من الطبق زراعة الأنسجة واستبدالها مع حل هويشت. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15-20 دقيقة. وصمة عار لFAK أو علامة أخرى غير قابلة للكشف الأجسام المضادة، انتقل إلى الخطوة 4.5.
- نضح الحل وسم النووي وغسل غرام تحتوي على خليةإلس ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X كما في الخطوة 4.2. عينات الملون يمكن تخزينها في برنامج تلفزيوني 1X في 4 درجات مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
- وصمة عار لبروتين من الفائدة: نضح في برنامج تلفزيوني من أطباق زراعة الأنسجة، إضافة 300 ميكرولتر من 0.3٪ PBST، واحتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- نضح في برنامج تلفزيوني، وتغطي المواد الهلامية مع عازلة تمنع، واحتضان على شاكر (200 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة ل~ 4 ساعات.
- نضح المخزن المؤقت عرقلة، وتغطي المواد الهلامية مع حل الأجسام المضادة الأولية، واحتضان على شاكر في 200 دورة في الدقيقة ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية.
- نضح حل الأجسام المضادة الأولية، إضافة 0.3٪ حل PBST، واحتضان على شاكر في 200 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. نضح PBST وتكرار كل 30 دقيقة لمدة 3-4 ساعة.
- كرر الخطوات من 4.7 و 4.8، وهذه المرة احتضان مع الحل الضد الثانوية. التفاف أطباق زراعة الأنسجة مع رقائق الألومنيوم لمنع photobleaching من من الأجسام المضادة الثانوية. بعد فينال غسل، وعينات الملون يمكن تخزينها في برنامج تلفزيوني 1X في 4 درجات مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
- لتصور العينات، واستخدام الهدف NA 10X / 0.30 ركز على المستوى الناصف من الأنسجة الظهارية.
- لتصور نواة الخلية، صورة ثابتة عينات المسمى مع علامة النووية باستخدام الهدف NA 10X / 0.30 تحت إضاءة الأشعة فوق البنفسجية.
- لتصور عينات الملون لبروتين من الفائدة، صورة باستخدام الهدف NA 10X / 0.30 على مجهر مضان مقلوب.
- لإنشاء خرائط تردد من تلطيخ البروتين من أنسجة متعددة (عادة 50 أو أكثر) من الهندسة الأولية متطابقة، استيراد أول كل الصور باستخدام معيار برمجيات تحليل الصور (انظر المواد) وتحويلها إلى الرمادي 8 بت.
- إلى عتبة هذه الصور، وتحويلها إلى ثنائي (أي نصفية / أبيض وأسود) عن طريق تحديد نقطة قطع تدرج الرمادي. القيم تدرج الرمادي تحت عتبة تصبح سوداء، وأولئك الذين تجاوزوا عتبة تصبح بيضاء. ثم، والجمع بينكل من صور ثنائية الفردية في كومة صورة واحدة.
- المقبل، وسجل الصور مكدسة (أي محاذاة أو مطابقتها) في برامج التحليل. العديد من حزم برمجيات تحليل الصور التي تأتي مع البرنامج المساعد التسجيل متاح مجانا.
- استخدام كل صورة في كومة كنموذج لمحاذاة الصورة التالية، بحيث يتم محاذاة الصور في كومة بأكمله عن طريق الإكثار. وأخيرا، تراكب (المشروع) الصور في كومة صورة الانحياز على أساس متوسط كثافة لتشكيل صورة واحدة مع خريطة تردد بكسل. هذه الصورة يمكن أن يكون ثم مرمزة باستخدام برامج تحرير الصور من اختيار 10،11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التخطيطي العام لالثديية التصنيع الدقيق الأنسجة الظهارية
ويرد التخطيطي العام لإجراء التصنيع الدقيق يحدد تدفق العمل التجريبي في الشكل 1. والنتيجة النهائية هي مجموعة من الأنسجة الطلائية للهندسة متطابقة والمباعدة بين الولادات التي هي جزء لا يتجزأ تماما داخل هلام ECM. تستخدم تجربة تمثيلية EpH4 الماوس الخلايا الظهارية الثديية مثقف في مادة هلامية من نوع البقري أنا الكولاجين بتركيز 4 ملغ / مل. لضمان أعلى مستوى من الجودة من الأنسجة المهندسة، ينبغي اتباع الأساليب الواردة في البروتوكول عن كثب. أرقام 2A وعرض 2B وجهات النظر المنخفضة والعالية التكبير من صفائف من الآبار مستطيلة التي تم مصبوب في النوع الأول الكولاجين هلام قبل البذر الخلية. يتم تحديد شكل الآبار عن طريق شكل الميزات على سيد السيليكون. ومن المهم لرفع الالبريد PDMS العفن على التوالي من الكولاجين حتى لا تشوه الهندسة تجويف. ويبين الشكل 2C الآبار مستطيلة في النوع الأول الكولاجين هلام التي تم شغلها مع الخلايا الظهارية الثديية (تم غسلها الخلايا الزائدة من على سطح الكولاجين). في هذا المثال، كل 200 ميكرومتر × 50 ميكرون جيدا مستطيل يحتوي على حوالي 80-100 الخلايا.
إضافة عوامل النمو تحرض التشكل
بعد 24 ساعة البذر، يمكن أن يعالج الأنسجة مع عوامل النمو مثل HGF أو EGF ومثقف على مدى عدة أيام لنموذج المتفرعة التشكل. عادة، فروع تبدأ في تشكيل في وقت مبكر من 4 ساعات بعد التحفيز عامل النمو. ويبين الشكل 3A نتائج ممثلة من الأنسجة الظهارية الثديية مستطيلة ضمن النوع الأول الكولاجين هلام بعد 24 ساعة من إجراء التصنيع الدقيق، وبعد ذلك سلانضمت ليرة سورية إلى الكولاجين ولبعضها البعض. لم يلاحظ أي فروع قبل عامل النمو بالإضافة. ويبين الشكل 3B نسيج مستطيلة التمثيلية التي مرت المتفرعة بعد إضافة HGF في 10 نانوغرام / مل 24 ساعة. في هذه الحالة، تحدث فروع في نهايات الأنسجة (على العكس من وسط)، حيث تتعرض الخلايا أعلى إجهاد ميكانيكي 9. ويمكن بعد ذلك يمكن تصوير أنسجة متعددة من الهندسة الأولية متطابقة في نفس هلام لتحديد معدلات السكان من موقع فرع وطول فرع، مما يتيح تحليل الإنتاجية العالية.
المناعي تلطيخ لتصور توطين البروتين
المناعي تلطيخ من صفائف الأنسجة في نموذج الثقافة يسمح لنا لتحديد توطين البروتين داخل الأنسجة مع الثقة إحصائية عالية. الشكل 4A يظهر ممثلى أعضاء النتائج sentative من الأنسجة الثديية مستطيلة المتفرعة الظهارية الملون لكيناز الالتصاق التنسيق (FAK). إنشاء خرائط تردد من أنسجة هندسة متطابقة يمكن استخدامها لتصور متوسط توطين المكاني للبروتينات ذات الاهتمام داخل الأنسجة، والتي يمكن مقارنتها إلى توطين البروتينات الأخرى، وكذلك النشاط المتفرعة. ويبين الشكل 4B خريطة تردد متوسط تلطيخ FAK لمدة 50 الأنسجة تظهر FAK تخصيب في نهايات قصيرة من أنسجة مستطيلة، حيث المتفرعة يحدث عادة.
الشكل 1. تخطيطي يوضح الإجراء التصنيع الدقيق. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ن الصفحات = "1"> 
الشكل 2. الصور التي يتم التقاطها أثناء عملية التصنيع الدقيق. (A) منخفضة و (ب) وعالية التكبير الصور على النقيض من المرحلة تجاويف مستطيلة في النوع الأول الكولاجين تم إنشاؤها باستخدام القالب اللدائن المرنة PDMS. تمتلئ (C) التجاويف من (A) و (B) مع الخلايا الظهارية الثديية. الحانات الحجم، 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. Microfabricated الأنسجة الخضوع (أ) صورة المرحلة على النقيض من مستطيلة النسيج 24 ساعة التمثيلية بعد التصنيع الدقيق المتفرعة التشكل. (ب) صورة المرحلة على النقيض من إعادةنسيج مستطيلة presentative التي بدأت الخضوع المتفرعة 24 ساعة بعد إضافة HGF في 10 نانوغرام / مل. وتشير السهام البيضاء الفروع التي شكلت حديثا. الحانات الحجم، 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. المناعي تلطيخ الأنسجة microfabricated. (A) تلطيخ المناعي للFAK في الأنسجة الظهارية الثديية بعد فرع بدء. (ب) خريطة تردد متوسط تلطيخ FAK في 50 الأنسجة. الحانات الحجم، 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (HL118532، HL120142، CA187692)، ومؤسسة ديفيد وولوسيل باكارد، وكميل ومؤسسة هنري دريفوس، وبوروز مرحبا صندوق. وأيد ASP في جزء من شارلوت إليزابيث بروكتر شرفية زمالة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| PDMS curing agent | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| Lithographically patterned silicon master | self-made | N/A | |
| Plastic weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-115 | |
| 100-mm-diameter Petri dishes | BioExpress | D-2550-2 | |
| Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH2O |
| Razor blade | American Safety Razor | 620179 | |
| 1:1 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium : Ham’s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1) | Hyclone | SH30023FS | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| 10x Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Life Technologies | 14185-052 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I6634-500MG | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| 10x Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 221465-500G | |
| Bovine type I collagen (non-pepsinized) | Koken | IAC-50 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | A-7906 | |
| Curved stainless steel tweezers | Dumont | 7 | |
| 35-mm-diameter tissue culture dishes | BioExpress | T-2881-6 | |
| 15 ml conical tubes | BioExpress | C-3394-2 | |
| 1.5 ml Eppendorf Safe-Lock Tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter | Bellco Glass Inc. | Special order | |
| 0.05% 1x Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Paraformaldehyde | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Perkin Elmer | N9300260 | Detergent |
| HGF | Sigma Aldrich | H 9661 | Resuspended in dH2O at 50 mg/ml |
| Rabbit anti-mouse FAK antibody | Life Technologies | AMO0672 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Life Technologies | A-11034 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | N/A | Used for color-coding pixel frequency maps. |
| FIJI (ImageJ) | NIH | N/A | Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images. |
References
- Affolter, M., et al. Tube or not tube: remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Dev Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
- Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K signaling in the regulation of branching morphogenesis. Biosystems. 109 (3), 403-411 (2012).
- Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).
- Fata, J. E., et al. The MAPK(ERK-1,2) pathway integrates distinct and antagonistic signals from TGFalpha and FGF7 in morphogenesis of mouse mammary epithelium. Dev Biol. 306 (1), 193-207 (2007).
- Ip, M. M., Darcy, K. M. Three-dimensional mammary primary culture model systems. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1 (1), 91-110 (1996).
- Lo, A. T., Mori, H., Mott, J., Bissell, M. J. Constructing three-dimensional models to study mammary gland branching morphogenesis and functional differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 103-110 (2012).
- Nelson, C. M., Vanduijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures. Science. 314 (5797), 298-300 (2006).
- Gjorevski, N., Nelson, C. M. Endogenous patterns of mechanical stress are required for branching morphogenesis. Integr Biol (Camb). 2 (9), 424-434 (2010).
- Gjorevski, N., Nelson, C. M. Mapping of mechanical strains and stresses around quiescent engineered three-dimensional epithelial tissues. Biophys J. 103 (1), 152-162 (2012).
- Gjorevski, N., Piotrowski, A. S., Varner, V. D., Nelson, C. M. Dynamic tensile forces drive collective cell migration through three-dimensional extracellular matrices. Sci Rep. 5, 11458 (2015).
- Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K regulates branch initiation and extension of cultured mammary epithelia via Akt and Rac1 respectively. Dev Biol. 379 (2), 235-245 (2013).
- Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
- Hirai, Y., et al. Epimorphin functions as a key morphoregulator for mammary epithelial cells. J Cell Biol. 140 (1), 159-169 (1998).
- Pavlovich, A. L., Manivannan, S., Nelson, C. M. Adipose stroma induces branching morphogenesis of engineered epithelial tubules. Tissue Eng Part A. 16 (12), 3719-3726 (2010).
