Summary
Dit manuscript beschrijft een zachte lithografie gebaseerde techniek uniforme arrays van driedimensionale (3D) epitheliale weefsels gedefinieerde geometrische midden van extracellulaire matrix ingenieur. Deze methode is vatbaar voor een grote verscheidenheid aan celtypen en experimentele contexten en zorgt voor high-throughput screening van identieke herhalingen.
Introduction
De ontwikkeling van vertakte epitheliale weefsels, zogenaamde vertakking morfogenese wordt geregeld door cel afkomstige, fysieke en omgevingsfactoren. In de melkklier, vertakkende morfogenese is een iteratief proces waarbij geleid collectieve celmigratie wordt een boom-achtige architectuur. De eerste stap is primair knopvorming uit de melkkanalen, gevolgd door tak initiatie en elongatie 1,2. Invasie van takken in het omliggende stroma wordt geïnduceerd door de systemische afgifte van steroïde hormonen in de puberteit. Nieuwe primaire knoppen vervolgens initiëren van de uiteinden van de bestaande vestigingen, en dit proces blijft een epitheliale boom 3 te creëren. Hoewel veel belangrijke biochemische signalen zijn geïdentificeerd, een uitgebreide kennis van de celbiologische mechanismen die leiden dit complex ontwikkelingsproces wordt momenteel ontbreekt. Bovendien mechanistische studies over de invloed van specifieke signalen zijn moeilijk te ontleden van experigen in vivo, zo precies spatiotemporele verstoringen en metingen zijn vaak niet mogelijk.
Driedimensionale (3D) cultuur technieken, zoals hele orgelcultuur, primaire organoids en celcultuur modellen, zijn nuttige hulpmiddelen voor het systematisch onderzoek naar de mechanismen die ten grondslag liggen aan weefsel morfogenese 4-6. Deze kunnen bijzonder nuttig zijn voor het bepalen van de invloed van bepaalde factoren afzonderlijk, zoals mechanische krachten en biochemische signalen, op een verscheidenheid van cel gedrag, zoals migratie, proliferatie en differentiatie. 6 Engineered celkweekmodellen name gemakkelijk mogelijk de verstoring van afzonderlijke cellen en hun micromilieu.
Een dergelijke cultuur model maakt gebruik van een microfabrication gebaseerde benadering van model borstklier epitheliale weefsels met gecontroleerde 3D-structuur die consistent en reproduceerbaar te vormen takken die samen migreren wanneer geïnduceerd met de een ingenieurppropriate groeifactoren. Het grote voordeel van het model is de mogelijkheid om precies te manipuleren en de effecten van fysische en biochemische factoren, zoals patronen van mechanische belasting, hoge statistische betrouwbaarheid te meten. Deze techniek, samen met computermodellen is al gebruikt om de relatieve bijdrage van fysische en biochemische signalen in de leiding van de normale ontwikkeling van mammaire epitheliale weefsels en andere epithelia vertakte 7-11 bepalen. Hier voorgesteld is een gedetailleerd protocol voor het bouwen van deze model weefsels, die gemakkelijk kan worden uitgebreid tot andere typen cellen en extracellulaire matrix (ECM) gels en die dient als een potentieel middel voor het testen van geneesmiddelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van de Solutions
- Een 5 mg / ml oplossing van insuline te bereiden, verdun het gepoederde insuline leverbaar met 5 mM zoutzuur (HCl) in dH 2 O (500 mg insuline in 100 ml oplosmiddel). Bereid 100 ml oplosmiddel door toevoeging van 50 pi geconcentreerd HCl aan 100 ml gedestilleerd water (dH 2 O).
- Aan een oplossing van 1x PBS te verdunnen 10x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) stockoplossing aan 1x met dH 2 O onder steriele omstandigheden.
- Bereid de polydimethylsiloxaan (PDMS) elastomeeroplossing als volgt: meng de PDMS prepolymeer met het hardingsmiddel in een 10: 1 (w: w) verhouding.
- Bereid het celkweekmedium als volgt: 500 ml van de Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F-12), voeg 10 ml steriel foetaal runderserum (FBS), 500 gl gentamicine reagens en 500 pl van 5 mg / ml insuline.
- Tot 1% runderserumalbumine (BSA) bereiden in 1x PBS oplossing, voeg 1% (w: V) oplossing van BSA poeder tot 1x PBS en meng.
- Een 4 mg / ml oplossing van geneutraliseerd bovine type I collageen bereid, voeg 50 ul 10 x Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) buffer, 30 pl 0,1 N natriumhydroxide (NaOH), 30 pi celkweekmedium en 400 ui voorraad collageen een gekoelde 1,5 ml microcentrifugebuis. Meng langzaam door en neer te pipetteren; voorkomen dat er bubbels. Eventuele luchtbellen te verwijderen, kort gecentrifugeerd mengsel bij 4 ° C.
- Bereid een fixatief door verdunning van 16% paraformaldehyde 1: 4 (v: v) in 1x PBS.
- Bereid een kernen etikettering oplossing door verdunning van de voorraad kernen etikettering oplossing 1: 1000 (v: v) in 1x PBS.
- Bereid een 0,3% fosfaatgebufferde zoutoplossing en reinigingsmiddel (PBST) door mengen 1x PBS met 0,3% (v: v) detergent.
- Bereid blokkerende buffer door verdunning van geit serum 01:10 (v: v) in 0,3% PBST.
- Bereid een primaire antilichaamoplossing voor een bepaalde proteïne van belang door verdunning primary antilichaam (bijvoorbeeld konijn anti-focale adhesie kinase (FAK)) 1: 200 (v: v) in blokkeerbuffer.
- Bereid een secundaire antilichaamoplossing door verdunning van een fluorescente probe-geconjugeerd antilichaam (bijvoorbeeld, geit anti-konijn) 1: 1000 (v: v) in blokkeerbuffer.
2. Voorbereiding van Elastomere Stempels voor 3D micropatterning
Opmerking: elastomeer postzegels zijn gemaakt met PDMS.
- Maak een PDMS oplossing in dezelfde verhouding als beschreven in stap 1.3 en meng. Plaats het mengsel in een vacuümkamer gedurende 15-30 min om eventuele luchtbellen die tijdens het mengproces geïntroduceerd verwijderen.
- Giet de ontgaste oplossing in een plastic wegen boot of petrischaal met een silicium meester die lithografisch een patroon met kenmerken van de gewenste geometrie. Voor het beste resultaat, genezen van de PDMS oplossing bij 60 ° C ~ 12 uur.
Opmerking: De silicium meesters zijn zeer flexibel; Dit protocol maakt gebruik van rechthoekige structuren met afmetingen van 50urn x 200 urn x 50 urn afstand 200 urn uit elkaar. De silicium masters kunnen worden gemaakt met behulp van standaard fotolithografische technieken. Kort samengevat, een epoxybasis fotoresist spin-coating op een siliciumwafel. Een masker waarin de gewenste eigenschappen stempel wordt bovenop de fotoresist gecoate wafer, die vervolgens wordt blootgesteld aan UV-licht. De gewenste eigenschappen niet geblokkeerd door het masker wordt blootgesteld aan het licht en de fotolak op deze locaties wordt verknoopt, terwijl de rest van de fotoresist coating oplosbaar en kan worden weggespoeld. - Na de PDMS op de silicium meester is uitgehard om de gewenste eigenschappen, verwijdert u de PDMS en meester uit de plastic container. scheiden voorzichtig de PDMS van silicium wafer en verwijderen overtollige PDMS uit de hele bedrukt functies met een schone scheermesje.
- Knip nu de PDMS patroon met ingedrukt functies in afzonderlijke rechthoekige stempels (~ 8-mm x 5 mm) met een scheermesje. Bewaar deze feature-side-up in een keleen 100-mm diameter petrischaal.
- Daarnaast gebruikt u de PDMS oplossing in stap 1.3 beschreven dragers te maken voor de rechthoekige stempels.
- Met behulp van een spinbekleder, verspreid -2-3 g PDMS oplossing gelijkmatig op een 100-mm diameter petrischaal en genezen van de PDMS voor ~ 12 uur bij 60 ° C zoals in stap 2,1. Dan, met behulp van een scheermesje, snijd de dunne laag van PDMS in rechthoeken (~ 5 mm x 2 mm).
Opmerking: Twee dragers zijn nodig voor elke PDMS stempel in stap 2,3. De dragers kunnen worden opgeslagen in de 100-mm diameter petrischaal die de PDMS stempels bevat. - Voordat de PDMS postzegels en dragers kunnen worden gebruikt voor celkweek, steriliseren door onderdompeling in 70% ethanol en droog met behulp van een aspirator in een bioveiligheid kast (celkweek kap).
3. Bereiding van 3D epitheelweefsels
- In een bio kast, voeg een daling van ongeveer 50 ui 1% BSA in PBS tot de bovenkant van de postzegel. Plaats de druppel die zegels bij 4 ° C voor een minivan minimum 4 uur zodat de BSA adsorbeert aan het oppervlak van de stempel.
- Zuig BSA-oplossing uit de PDMS postzegels.
- Was de oppervlakken van de stempels tweemaal met celkweekmedium (50 gl per wasbeurt per stempel moet voldoende zijn), opzuigen na elke wasbeurt.
- Behandel de gesteriliseerde PDMS postzegels en ondersteunt het gebruik van gebogen roestvrijstalen pincet. In een bioveiligheid kast, lay-out van een 35-mm diameter weefselkweek schotel voor elke PDMS stempel. In elk gerecht, vast twee PDMS steunen gescheiden door een afstand iets minder dan de lengte van de PDMS postzegels.
- Met de pincet, steriliseren zoveel ronde glazen dekglaasjes (15 mm diameter # 1) en er PDMS postzegels middels 70% ethanol. Zuig de overtollige vloeistof uit de dekglaasjes terwijl ze te houden met de pincet. Bewaar de gewassen dekglaasjes in een afzonderlijke 100 mm diameter petrischaal.
- Verdeel ~ 50 pi van het collageen mengsel gelijkmatig bekleden van het oppervlak van elke PDMS stempel.
- Oppakkenelk met collageen beklede PDMS stempel met de pincet en voorzichtig omkeren hen. Verlaag de omgekeerde stempels bovenop de PDMS steunt in 35-mm diameter weefselkweek vastgestelde voorgeschoteld zodat het collageen tussen de stempel en de onderkant van de weefselkweekplaat. Incubeer de schaaltjes 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Verdeel ~ 50 pi van het resterende collageen mengsel op elk van de ronde dekglaasjes en incubeer ze op 37 ° C gedurende 30 min (later, deze worden bovenop het gemanipuleerde weefsel om volledig inkapselen in collageen geplaatst).
- Verkrijgen van een 100-mm diameter weefselkweekplaat met epitheelcellen (ex. EpH4 muizen mammaire epitheelcellen) en ~ 40% confluentie. Zuig het celkweekmedium en eenmaal wassen met 10 ml 1 x PBS. Voeg 2 ml trypsine om de cellen en incubeer bij 37 ° C gedurende 5-10 minuten.
- Voeg 8 ml vers kweekmedium weefselkweek schaal bevattende cellen getrypsiniseerd losmaken resterende hechtende cellen uit het schaaltje. Meng voorzichtig door pipetteren en beweeg het celmengsel een 15 ml conische buis en centrifugeer bij 100 xg gedurende 5 minuten.
- Zuig het supernatant van de conische buis en resuspendeer de celpellet in celkweekmedium. Met behulp van een hemocytometer, tel de cellen aan de concentratie van de suspensie te bepalen. Pas de vering volume tot een eindconcentratie van 6 ~ 10 -10 7 cellen / ml te verkrijgen.
- Verwijder de gegeleerde collageen monsters uit de incubator. Met behulp van de pincet, til de PDMS postzegels recht omhoog om ze los te maken van de gevormde collageen en gooi ze weg.
- Verdeel ~ 30 pi van het geconcentreerde celsuspensie op het oppervlak van elke collageengel met holtes gevormd van de gewenste geometrie. Houd u aan de cellen onder een helderveld microscoop met een 10x / 0,25 NA doelstelling terwijl zachtjes schudden van de gerechten van links naar rechts naar cel afwikkeling van transacties binnen de holtes te promoten. De holten worden ingevuld op ~ 5 min.
- aan rchrap overtollige cellen van rond de holten, kantelen elke weefselcultuurschaal op zijn kant en voorzichtig afzien ~ 400 pi celcultuurmedium over het oppervlak van de collageengel. Zuig de vloeistof en herhaal het wassen 1-2 keer, het controleren van de collageen gels onder de microscoop tussen elke wasbeurt.
- Nadat de overtollige cellen zijn verwijderd uit hele-cel gevulde holten in de matrijs collageen, plaatst de weefselkweekschalen in een cel incubator bij 37 ° C gedurende 15 minuten. Vervolgens, met de pincet voorzichtig omkeren van de met collageen beklede dekglaasjes klasse en plaats ze bovenop het cel collageen gevulde matrijzen zodat het collageen van de dekglaasjes vormt een kap over het cel gevulde holtes. Incubeer de monsters bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
- Zodra de collageen kappen hebben gehecht aan het cel collageen gevulde mal afzien ~ 2-2,5 ml celkweekmedium langzaam via glazen dekglaasje bovenop de gels. Cultuur van de monsters bij 37 ° C gedurende 1-3 dagen.
Notitie:24 uur na de eerste enting, kan de epitheliale weefsels worden behandeld met groeifactoren zoals epidermale groeifactor (EGF) of hepatocyt groeifactor (HGF) te induceren vertakking.
4. Immunofluorescentie en beeldanalyse
- Zuig het celkweekmedium uit de weefselkweek schalen en voeg voldoende fixatief de celbevattende gels omvatten. Incubeer de schotels bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten op een schudinrichting bij 200 rpm.
- Zuig het fixeermiddel, vul de weefselkweek schalen met 1 x PBS en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten op een schudinrichting bij 200 rpm. Herhaal dit twee keer voor drie totaal wasbeurten.
- Om kernen label: Zuig het PBS uit de weefselkweek schotel en te vervangen door Hoechst-oplossing. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15-20 min. Om vlek voor FAK of een andere marker die detecteerbaar is met antilichamen, ga dan naar stap 4.5.
- Zuig het nucleaire labelingoplossing en was de celbevattende gels driemaal met 1x PBS zoals in stap 4,2. Bevlekt monsters kunnen worden opgeslagen in 1x PBS bij 4 ° C tot verder gebruik.
- De kleur wordt een eiwit van belang: Zuig het PBS uit de weefselkweekplaten, voeg 300 pl PBST 0,3%, en incubeer het monster bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
- Zuig het PBS, bedekken de gels met een blokkeerbuffer, en incubeer op een schudapparaat (200 rpm) bij kamertemperatuur gedurende ~ 4 uur.
- Zuig het blokkeerbuffer, bedekken de gels met primaire antilichaamoplossing en incubeer op een schudinrichting bij 200 rpm gedurende de nacht bij 4 ° C.
- Zuig het primaire antilichaamoplossing, voeg 0,3% PBST oplossing en incubeer op een schudinrichting bij 200 tpm bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Zuig het PBST en herhaal elke 30 min gedurende 3-4 uur.
- Herhaal de stappen 4,7 en 4,8, ditmaal incubatie met de secundaire antilichaamoplossing. Wikkel de weefselkweek gerechten met aluminiumfolie om fotobleken van het secundaire antilichaam te voorkomen. Na de final wassen, kunnen gekleurde monsters opgeslagen in 1x PBS bij 4 ° C tot verder gebruik.
- Om monsters te visualiseren, gebruik dan een 10x / 0,30 NA doelstelling gericht op de mid-plane van de epitheliale weefsels.
- Om celkernen, image gefixeerde monsters gelabeld met een nucleaire marker met behulp van een 10x / 0,30 NA doelstelling onder UV-belichting te visualiseren.
- Om monsters gekleurd voor een eiwit van belang, beeld met behulp van een 10X / 0.30 NA objectief op een omgekeerde fluorescentie microscoop te visualiseren.
- Om de frequentie kaarten van eiwit kleuring van meerdere weefsels (meestal 50 of meer) van identieke initiële geometrie, de eerste import elk van de beelden met behulp van standaard beeldanalyse software (zie Materials) en ze converteren naar 8-bits grijstinten.
- Om drempel deze beelden, ze converteren naar binaire (dwz, halftone / zwart-wit) door het definiëren van een grijstinten cutoff punt; grijswaarden onder de drempel worden zwart, en die boven de drempel worden wit. Vervolgens combinerenelk van de afzonderlijke binaire afbeeldingen in een enkel beeld stack.
- Vervolgens registreert de gestapelde foto's (dat wil zeggen, uitlijnen of match ze) in de analyse software. Veel beeldanalyse software pakketten komen met een vrij beschikbare registratie plugin.
- Gebruik elke afbeelding in een stapel als een sjabloon voor de uitlijning van de volgende afbeelding, zodat de beelden in de hele stack worden uitgelijnd door voortplanting. Tot slot, overlay (project) de beelden in de uitgelijnde afbeelding stapel op basis van gemiddelde intensiteit om een enkel beeld met een pixel frequentie kaart te vormen. Dit beeld kan vervolgens worden kleurcodering met behulp van software voor beeldbewerking keuze 10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Algemeen schema van borstklieren epitheelweefsel microfabrication
Een algemeen schema van de microfabrication procedure waarin het experimentele workflow wordt weergegeven in figuur 1. Het resultaat is een array van epitheliale weefsels van identieke geometrie en afstand die volledig zijn ingebed in een gel ECM. Een representatief experiment gebruikt EpH4 muizen mammaire epitheliale cellen gekweekt in een gel van bovine type I collageen in een concentratie van 4 mg / ml. Om de hoogste kwaliteit van gemanipuleerde weefsels te waarborgen, moet de in het protocol technieken nauwlettend worden gevolgd. Figuren 2A en 2B tonen lage en hoge vergroting uitzicht op arrays rechthoekige putten die zijn gevormd in een type I collageen gel voorafgaand aan de cel zaaien. De vorm van de putjes wordt bepaald door de vorm van de functies van het silicium meester. Het is belangrijk om th heffene PDMS schimmel recht omhoog uit het collageen om te voorkomen dat de holte geometrie verstoren. Figuur 2C toont rechthoekige putjes in een type I collageen gel die worden opgevuld met mammaire epitheelcellen (overmaat cellen werden afgewassen van het oppervlak van het collageen). In dit voorbeeld is elk 200 urn x 50 urn rechthoekig en bevat ongeveer 80-100 cellen.
Toevoeging van groeifactoren induceert morfogenese
24 uur na enting, kan het weefsel worden behandeld met groeifactoren zoals EGF of HGF en gekweekt gedurende verscheidene dagen met model vertakkende morfogenese. Gewoonlijk takken beginnen reeds na 4 uur na stimulatie groeifactor vormen. Figuur 3A toont representatieve resultaten van rechthoekige mammaire epitheliale weefsels in een type I collageen gel 24 uur na de microfabrication procedure, waarna CELls zijn gehecht aan het collageen en elkaar. Nr takken situatie vóór groeifactor toevoeging. Figuur 3B toont een representatief rechthoekige weefsel dat heeft ondergaan vertakking 24 uur na de toevoeging van HGF bij 10 ng / ml. In dit geval, takken plaatsvinden aan de einden van het weefsel (in tegenstelling tot het midden), waarbij de cellen ervaring met de hoogste spanning 9. Meerdere weefsels van identieke initiële geometrie in dezelfde gel kan dan worden afgebeeld tot de bevolking gemiddelden van filiaal en tak lengte te bepalen, waardoor high-throughput analyse.
Immunofluorescentiekleuring eiwit lokalisatie visualiseren
Immunofluorescentie kleuring van het weefsel arrays in de cultuur model stelt ons in staat om eiwit lokalisatie te bepalen binnen een weefsel met een hoge statistische betrouwbaarheid. Figuur 4A toont vertegenwoordiger resultaten van een vertakking rechthoekige borstklieren epitheelweefsel gekleurd voor focale adhesie kinase (FAK). Creëren frequentiekaarten weefsels van identieke geometrie kan worden gebruikt om de gemiddelde ruimtelijke lokalisatie van eiwitten van belang in de weefsels, die kan worden vergeleken met de lokalisatie van andere eiwitten en vertakking te visualiseren. Figuur 4B toont een kaart van gemiddelde frequentie FAK kleuring voor 50 weefsels die FAK verrijking aan de korte uiteinden van rechthoekige weefsel, waarbij vertakking gewoonlijk optreedt.
Figuur 1. Schematische waarin de microfabrication procedure. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Foto's genomen tijdens de microfabricage proces. (A) laag en (B) en hoge vergroting fasecontrast beelden rechthoekige holten in type I collageen gemaakt met een elastomere PDMS mal. (C) Holten uit (A) en (B) worden gevuld met mammaire epitheelcellen. Schaal bars, 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. microfabricated weefsels ondergaan (A) Fase-contrast beeld van een representatieve rechthoekige tissue 24 uur na microfabrication vertakking morfogenese.. Fase-contrast beeld van een re (B)presentatieve rechthoekige weefsel dat is begonnen te ondergaan vertakking 24 uur na de toevoeging van HGF bij 10 ng / ml. Witte pijlen geven nieuw gevormde takken. Schaal bars, 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Immunofluorescentie kleuring van microfabricated weefsels. (A) Immunofluorescentie kleuring voor FAK in een mammaire epitheelweefsel na initiatie tak. (B) een frequentie kaart van gemiddelde FAK kleuring in 50 weefsels. Schaal bars, 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van de NIH (HL118532, HL120142, CA187692), de David en Lucile Packard Foundation, de Camille en Henry Dreyfus Stichting, en de Burroughs Welcome Fund. ASP werd mede ondersteund door een Charlotte Elizabeth Procter eretitel Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| PDMS curing agent | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| Lithographically patterned silicon master | self-made | N/A | |
| Plastic weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-115 | |
| 100-mm-diameter Petri dishes | BioExpress | D-2550-2 | |
| Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH2O |
| Razor blade | American Safety Razor | 620179 | |
| 1:1 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium : Ham’s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1) | Hyclone | SH30023FS | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| 10x Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Life Technologies | 14185-052 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I6634-500MG | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| 10x Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 221465-500G | |
| Bovine type I collagen (non-pepsinized) | Koken | IAC-50 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | A-7906 | |
| Curved stainless steel tweezers | Dumont | 7 | |
| 35-mm-diameter tissue culture dishes | BioExpress | T-2881-6 | |
| 15 ml conical tubes | BioExpress | C-3394-2 | |
| 1.5 ml Eppendorf Safe-Lock Tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter | Bellco Glass Inc. | Special order | |
| 0.05% 1x Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Paraformaldehyde | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Perkin Elmer | N9300260 | Detergent |
| HGF | Sigma Aldrich | H 9661 | Resuspended in dH2O at 50 mg/ml |
| Rabbit anti-mouse FAK antibody | Life Technologies | AMO0672 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Life Technologies | A-11034 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | N/A | Used for color-coding pixel frequency maps. |
| FIJI (ImageJ) | NIH | N/A | Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images. |
References
- Affolter, M., et al. Tube or not tube: remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Dev Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
- Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K signaling in the regulation of branching morphogenesis. Biosystems. 109 (3), 403-411 (2012).
- Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).
- Fata, J. E., et al. The MAPK(ERK-1,2) pathway integrates distinct and antagonistic signals from TGFalpha and FGF7 in morphogenesis of mouse mammary epithelium. Dev Biol. 306 (1), 193-207 (2007).
- Ip, M. M., Darcy, K. M. Three-dimensional mammary primary culture model systems. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1 (1), 91-110 (1996).
- Lo, A. T., Mori, H., Mott, J., Bissell, M. J. Constructing three-dimensional models to study mammary gland branching morphogenesis and functional differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 103-110 (2012).
- Nelson, C. M., Vanduijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures. Science. 314 (5797), 298-300 (2006).
- Gjorevski, N., Nelson, C. M. Endogenous patterns of mechanical stress are required for branching morphogenesis. Integr Biol (Camb). 2 (9), 424-434 (2010).
- Gjorevski, N., Nelson, C. M. Mapping of mechanical strains and stresses around quiescent engineered three-dimensional epithelial tissues. Biophys J. 103 (1), 152-162 (2012).
- Gjorevski, N., Piotrowski, A. S., Varner, V. D., Nelson, C. M. Dynamic tensile forces drive collective cell migration through three-dimensional extracellular matrices. Sci Rep. 5, 11458 (2015).
- Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K regulates branch initiation and extension of cultured mammary epithelia via Akt and Rac1 respectively. Dev Biol. 379 (2), 235-245 (2013).
- Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
- Hirai, Y., et al. Epimorphin functions as a key morphoregulator for mammary epithelial cells. J Cell Biol. 140 (1), 159-169 (1998).
- Pavlovich, A. L., Manivannan, S., Nelson, C. M. Adipose stroma induces branching morphogenesis of engineered epithelial tubules. Tissue Eng Part A. 16 (12), 3719-3726 (2010).
