Abstract
الأدينوساين الإنزيمات hydrolyzing ثلاثي الفوسفات، أو ATPases، تلعب دورا حاسما في مجموعة متنوعة من الوظائف الخلوية. ويمكن لهذه البروتينات ديناميكية توليد الطاقة عن الأعمال الميكانيكية، مثل الاتجار البروتين وتدهور والنقل المذاب، والحركات الخلوية. بروتوكول الموصوفة هنا هو فحص أساسي لقياس النشاط في المختبر من ATPases تنقيته لتوصيف وظيفي. البروتينات يتحلل اعبي التنس المحترفين في رد الفعل الذي يؤدي إلى الإفراج الفوسفات غير العضوية، وكمية من الفوسفات تحرير ثم quantitated باستخدام مقايسة اللونية. هذا البروتوكول العالية للتكيف يمكن تعديلها لقياس النشاط أتباز في المقايسات الحركية أو نقطة النهاية. ويرد بروتوكول التمثيلي هنا على أساس النشاط ومتطلبات EpsE، تشارك AAA + أتباز في النوع الثاني إفراز في بكتيريا ضمة الكوليرا. كمية من البروتين النقي اللازمة لقياس النشاط ومدة الفحص وتوقيت وعدد من سافترات mpling، العازلة وتكوين الملح، ودرجة الحرارة، والعوامل المشتركة، والمنشطات (إن وجدت)، وما إلى ذلك قد تختلف عن تلك المذكورة هنا، وبالتالي بعض التحسين قد تكون ضرورية. يوفر هذا البروتوكول إطارا أساسيا لATPases تميز ويمكن أن يؤديها بسرعة وتعديلها بسهولة عند الضرورة.
Protocol
1. تنفيذ ATP الحلمأة رد الفعل مع البروتين النقي
- إعداد مخزونات جميع الكواشف اللازمة لحضانة مع البروتين النقي.
- إعداد عازلة 5X HEPES / كلوريد الصوديوم / الجلسرين (هنج) تحتوي على 100 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 8.5، 65 مم كلوريد الصوديوم، و 5٪ الجلسرين (أو عازلة فحص آخر حسب الاقتضاء).
- إعداد 100 ملي MgCl 2 (أو المعادن الأخرى، إذا أتباز يعتمد المعادن) في الماء.
- إعداد الطازجة 100 ملي اعبي التنس المحترفين في 200 ملي قاعدة تريس (لا ضبط درجة الحموضة مزيد) باستخدام عالية ATP النقاء. قسامة وتخزين الأوراق المالية اعبي التنس المحترفين في -20 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن بضعة أسابيع، كما ATP سوف تنهار مع مرور الوقت، والامتناع عن تجميد وذوبان الأسهم اعبي التنس المحترفين.
- بريمكس MgCl 2 و ATP في نسبة 1: 1 قبل وضع رد فعل التحلل اعبي التنس المحترفين.
- تحضير تسمية 1.5 مل أنابيب لجمع العينات على فترات منتظمة طوال رد فعل. إعداد أنابيب جمع العينات في وقت 0 وفي وقت 15، 30،45، و 60 دقيقة.
ملاحظة: وكبديل، وجمع عينات فقط في وقت 0 ونقطة النهاية.- إضافة 245 ميكرولتر العازلة 1X هنغ إلى كل أنبوب من أجل تمييع العينات التي تم جمعها من ردود الفعل المائي ATP 01:50.
- يعد حمام من الثلج الجاف والايثانول لتجميد بسرعة عينات لوقف التفاعل. في دلو المطاط الجليد أو آمنة الأخرى (غير البلاستيك) حاوية، إضافة عدة قطع من الثلج الجاف وتصب بعناية ما يكفي من 70-100٪ من الإيثانول لتغطية الثلج الجاف.
- تمييع البروتين النقي في المخزن هنغ 1X، حسب الاقتضاء (عادة 5-10 ميكرون)، والحفاظ على الجليد.
- إعداد ردود فعل التحلل اعبي التنس المحترفين.
- في منفصلة 0.5 مل أنابيب لكل عينة، إضافة الكواشف التالية (بالترتيب): H 2 O (تصل إلى الحجم النهائي من 30 ميكرولتر)، 6 ميكرولتر 5X هنغ أو عازلة آخرين، 3 ميكرولتر 100 ملي MgCl 2 -ATP الخليط، و،25-5 البروتين ميكرومتر.
- تشمل منطقة عازلة فقط حالة السيطرة السلبية التي لم تتم إضافة البروتين.
- إزالة 5 ميكرولتر من رد فعل في وقت 0، وتمييع 01:50 في أنبوب 1.5 مل استعداد تحتوي على 245 عازلة هنغ ميكرولتر، وتجميد فورا العينة في حمام الثلج / الايثانول الجاف.
- احتضان ردود الفعل عند 37 درجة مئوية للسماح للاعبي التنس المحترفين المائي للتحدث لمدة 1 ساعة. في كل فترة (15، 30، 45، و 60 دقيقة)، وإزالة 5 مكل من التفاعل وإضافة إلى أنابيب العينات وصفت تحتوي عازلة هنغ كما في الخطوة 1.6.
- في نهاية التفاعل المائي ATP، نقل عينات المخفف إلى -80 درجة مئوية الثلاجة لمدة التخزين. لضمان تجميد جميع العينات تماما، انتظر على الأقل 10 دقيقة قبل المتابعة.
2. عينات احتضان يتضمن بي الحرة مع كشف الكاشف
- عينات ذوبان الجليد المخففة التي تحتوي على ATP قسامات رد فعل التحلل في كل نقطة زمنية (تم الحصول عليها من الخطوات 1.6 و 1.7) في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد لوحة 96-جيدا تحتوي على عينات والمعايير الفوسفات.
- في مل تو 0.5يكون، يخفف من مستوى الفوسفات (المتوفرة مع بي كشف كاشف) من 800 ميكرومتر إلى 40 ميكرومتر بإضافة 5.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت هنغ 800 ميكرومتر القياسية إلى 104.5 ميكرولتر. تخلط جيدا، وإضافة 100 ميكرولتر من هذا 40 ميكرومتر بي المعيار إلى ما A1 من لوحة 96-جيدا.
- إضافة العازلة هنغ 50 ميكرولتر من الآبار B1-H1 لل1: 1 التخفيفات التسلسلي للمعيار بي.
- إزالة 50 ميكرولتر من 40 ميكرومتر بي من A1 جيدا وإضافة إلى عازلة فحص 50 ميكرولتر في B1 جيدا، خلط، وإزالة 50 ميكرولتر من B1 جيدا وإضافة إلى ما C1، التخفيفات المستمر من خلال G1 جيدا. تجاهل 50 ميكرولتر من G1 جيدا بعد خلطه لضمان كل بئر لديه نفس الحجم. كذلك يجب أن تحتوي H1 عازلة الوحيد لخلق معيار بي 40-0 ميكرومتر.
ملاحظة: إذا تمت إضافة عامل إضافي (مثل مثبطات) للعينات، وخلق منحنى القياسية التي تحتوي على هذا العامل للسيطرة على التغيرات في الافراج عن الفوسفات أو الامتصاصية في ظل هذه الظروف. - إضافة 50 ميكرولتر من كل عصيدةلو في نسختين لوحة. إضافة عينات من نقطة زمنية واحدة في الأعمدة عموديا (عينة 1 مرة 0 = A2، A3، عينة 2 مرة 0 = B2، B3) ونقاط زمنية مختلفة أفقيا. هذا يسمح لمدة تصل إلى 8 عينات و 5 نقاط الوقت لكل لوحة.
- استخدام الماصة العقيمة لإزالة ما يكفي من المرمر الأخضر / موليبدات بي كشف كاشف لإضافة 100 ميكرولتر إلى كل من الآبار التي تحتوي على عينات والمعايير (كاشف اللازمة (مل) = 0.1 × عدد العينات والمعايير) وإضافة إلى طبق لسهولة pipetting ل باستخدام الماصة متعدد القنوات. لا صب كاشف الكشف مباشرة في طبق، حيث من المحتمل أن يحدث تلوث بي.
- باستخدام الماصة متعدد القنوات، إضافة 100 ميكرولتر من كشف كاشف بي إلى كل بئر وتخلط بواسطة pipetting بعناية صعودا وهبوطا عدد ثابت من الأوقات دون فقاعات إدخال، ويفضل أن يكون في أمر من النقاط الزمنية الماضية إلى نقطة لأول مرة.
- احتضان لوحة لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، أو وفقا لأماهالاتجاهات nufacturer و.
3. النتائج Quantitate باستخدام قارئ صفيحة
- قراءة الامتصاصية من العينات في 650 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية الامتصاصية.
- جعل منحنى القياسية بي. باستخدام برنامج الرسوم البيانية، رسم بياني لقيم الامتصاصية للعينات بي القياسية مقابل تركيز من أجل إيجاد المعادلة المستخدمة في حل لكمية الفوسفات في كل عينة.
- حساب النشاط أتباز لكل عينة من معايرة مع معيار الفوسفات. الفوسفات صدر = (OD 650 - Y التقاطع) / المنحدر.
- متوسط مجموع بي من التكرارات من كل عينة. طرح القراءة الامتصاصية سيطرة عازلة الوحيد من هذا الرقم. اضرب هذا من قبل عامل التخفيف (50 في مثالنا).
- تحديد بي نانومول صدر في البروتين مكرومول. يجب أن الرسوم البيانية هذه القيم لكل نقطة زمنية في مقايسة الحركية تسفر عن نوبات الخطية على الأقل R = 0.99 (الشكل 1). إذا كان nبعد التمديد، ويمكن تعديل مقايسة مع أكثر أو أقل من البروتين أو فترة حضانة أطول أو أقصر.
- تمثل النتائج على النحو نانومول بي / مكرومول بروتين / دقيقة (الشكلان 2 و 3)، أو البروتين نانومول بي / ميكروغرام / دقيقة إذا رغبت في ذلك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
النشاط في المختبر من T2S أتباز EpsE يمكن يحفزه copurification من EpsE مع المجال حشوية من EpsL (EpsE-cytoEpsL) وإضافة كارديوليين فوسفورية الحمضية 12. ومن الممكن أيضا لتحديد دور معين بقايا EpsE في اعبي التنس المحترفين المائي من خلال مقارنة النشاط من النوع البري (WT) لأشكال مغايرة من البروتين باستخدام هذا الاختبار. هنا، يتم قياس تأثير استبدال اثنين من مخلفات يسين في المجال ملزم الزنك EpsE بمقارنة النشاط أتباز من تنقية WT EpsE-cytoEpsL للمتغير EpsE K417AK419A-cytoEpsL. في الشكل 1، وإطلاق سراح الفوسفات العائدات خطيا على مدى مقايسة الحركية 1 ساعة، وهو شرط لتقدير دقيق لATPase النشاط الحركي. ويبين الشكل 2 بيانات من نفس العينات البروتين النقاء كما الشكل 1 التي تم يعاير ثلاث مرات في مكررة وquantitated من ناحيةمعدل متوسط الإفراج الفوسفات. وتشير هذه البيانات إلى أن K417 و K419 يبدو أن أهمية للنشاط EpsE أتباز. ومع ذلك، مقارنة unstimulated (لا كارديوليين) معدلات النشاط أتباز (الشكل 3) يدل على أن K417 و K419 لا تساهم في النشاط القاعدي EpsE ولكن بدلا من ذلك إلى قدرة البروتين على أن يحفزه كارديوليين. وlysines موجبة الشحنة في المجال ملزم الزنك EpsE قد تتفاعل مباشرة مع الدهون الفوسفاتية سالبة الشحنة، وبالتالي المساهمة في تحفيز بوساطة فوسفورية النشاط EpsE أتباز.
الشكل 1: يتم تحريرها الفوسفات بشكل خطي في الحركية أتباز الفحص ساعة واحدة الحركية أتباز فحص مقارنة الافراج الفوسفات من 0.5 ميكرومتر WT EpsE-cytoEpsL إلى EpsE K417AK419A-cytoEpsL مع زلال المصل البقري حفز كارديوليين (BSA) يعاير كما.السيطرة السلبية. تم رسم البيانات [كمية الفوسفات صدر (المحور الصادي) مقابل الوقت (محور س)] وتعرض لتحليل الانحدار الخطي. يمثل المنحدر معدل ATP التحلل. ويظهر رسم بياني التمثيلي مع معادلات الانحدار الخطي للبروتينات الثلاثة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نقرا ليسين الطفرات في EpsE الزنك وربط المجال تقليل حفز أتباز آخر نتائج 1 ساعة الحركي حفز كارديوليين أتباز فحص مع نفس البروتينات والشروط كما في الشكل 1 تم إجراء فحوصات ثلاث مرات منفصلة في نسختين التقني و تم حساب معدل للاعبي التنس المحترفين المائي كما الفوسفات نانومول ولدت في الدقيقة لكل ميكرومتر العلاقات العامة otein باستخدام معادلات الانحدار الخطي. يتم عرض النتائج متوسط مع الخطأ المعياري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: انقر نقرا يسين الطفرات في EpsE الزنك وربط المجال لا تتداخل مع Unstimulated أتباز آخر الليل (16 ساعة) نقطة النهاية unstimulated (لا كارديوليين) أتباز فحص بمقارنة النشاط من 5 ميكرومتر WT EpsE-cytoEpsL إلى EpsE K417AK419A-cytoEpsL مع ديوان الرقابة المالية. كوسيلة لمراقبة سلبية. وقد أجريت فحوصات ثلاث مرات منفصلة في نسختين التقني ويظهر النتائج متوسط مع الخطأ المعياري. على المستوى القاعدي للنشاط EpsE أتباز unstimulated يعاير على مدى فترة 16 ساعة هو ~ 1000 أضعاف أقل من 1 ساعة الحركي النشاط حفز كارديوليين.e.com/files/ftp_upload/54305/54305fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا هو بروتوكول عام لقياس النشاط أتباز المختبر من البروتينات النقاء لتوصيف والكيمياء الحيوية. هذه الطريقة بسهولة الأمثل. على سبيل المثال، وضبط كمية من البروتين، العازلة والتراكيب الملح، ودرجة الحرارة، وتتراوح مدة الفحص وفترات (بما في ذلك زيادة عدد فترات) يمكن أن تحسن الكميات النشاط. متوفرة تجاريا الكواشف مقرها الخضراء المرمر حساسة للغاية، ويمكن الكشف عن كميات صغيرة من الفوسفات خالية (50 ~ بمول في 100 ميكرولتر). بسبب حساسية هذا الاختبار، فإنه لا بد من استخدام الأدوات يمكن التخلص منها البلاستيك والماء عالى النقاء، ومخازن، والكواشف خالية من تلوث الفوسفات. بعد البروتينات تنقية، فمن المستحسن استبعاد حجم أو التبادل الأيوني اللوني لتحسين نقاء البروتين وإزالة الملوثات.
للبروتينات التي تظهر ضعيفة في النشاط أتباز المختبر، ويمكن إضافة المنشطات إلى رد فعل لتعزيز هالنشاط nzymatic. تم التعرف على العديد من العوامل التي تحفز النشاط أتباز. على سبيل المثال، كارديوليين وغيرها من الدهون غشاء والبروتينات العميل من مرافقين مثل Hsp90، وغيرها من البروتينات المشاركة في دعم التشكل أو البيئات الخاصة التي ATPases تعمل 13-15. مختبرنا أول تتميز EpsE بتطهير أحادية مع ضعف النشاط أتباز مقارنة ATPases مثلي 6. اكتشفنا لاحقا أنه عندما copurified EpsE مع المجال حشوية من EpsL، وهو بروتين الغشاء وشريك ملزم من EpsE في النظام T2S، إضافة الفوسفورية الحمضية مثل كارديوليين إلى خليط التفاعل إلى زيادة كبيرة في النشاط أتباز من EpsE 12. هذا من المرجح يحاكي الظروف الخبرات EpsE في غشاء هيولي التي قد تشجع oligomerization.
وقد استخدمت العديد من التقنيات لقياس في المختبر أتباز نشاط تنقية البروتينات. γ- المشعة
مقايسة الموصوفة هنا يتكون من واحد فقط الفوسفات خطوة قياس الإفراج عنهم، حساس للغاية، ويمكن عادة أن يؤديها في غضون بضعة ساعة. ومن الممكن أيضا أن استعداداتإعادة الركيزة التي تحتوي الخضراء المرمر لتجنب شراء مجموعة من بائع التجاري 6،9. نظر واحدة قبل الشروع في هذا الاختبار هو أن الخطوة بين إضافة الكاشف الكشف عن الفوسفات وأخذ قراءات الامتصاصية الوقت هو وقت حساس نسبيا ويجب أن تكون بين 20-30 دقيقة. ويمكن استخدام هذا البروتوكول الأساسي لتحديد دور المنشطات (كما هو موضح)، الخصوم، مفارز المجالات وبقايا محددة في النشاط أتباز 15،16،18،19. ويمكن أيضا أن يمتد هذا الاختبار لقياس نشاط فوسفاتاز أو الانزيمات الأخرى التي تطلق الفوسفات خلال الحفز. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق هذه الطريقة لفحص عالية الإنتاجية لمثبطات أتباز 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES buffer | Fisher | BP310-500 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Fisher | BP41325 | |
| 96-well plates (clear, flat-bottom) | VWR | 82050-760 | |
| BIOMOL Green | Enzo Life Sciences | BML-AK111 | Preferred phosphate detection reagent. Caution: irritant. |
| Microplate reader | BioTek Synergy or comparable | ||
| Prism 5 | GraphPad Software |
References
- Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (7), 519-529 (2005).
- Baker, T. A., Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochimica et Biophysica Acta. 1823 (1), 15-28 (2012).
- Maxson, M. E., Grinstein, S. The vacuolar-type H+-ATPase at a glance - more than a proton pump. J Cell Sci. 127 (23), 4987-4993 (2014).
- Planet, P. J., Kachlany, S. C., DeSalle, R., Figurski, D. H. Phylogeny of genes for secretion NTPases: Identification of the widespread tadA subfamily and development of a diagnostic key for gene classification. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2503-2508 (2001).
- Robien, M. A., Krumm, B. E., Sandkvist, M., Hol, W. G. J. Crystal Structure of the Extracellular Protein Secretion NTPase EpsE of Vibrio cholerae. J Mol Biol. 333 (3), 657-674 (2003).
- Camberg, J. L., Sandkvist, M. Molecular analysis of the Vibrio cholerae type II secretion ATPase EpsE. J Bacteriol. 187 (1), 249-256 (2005).
- Sandkvist, M. Type II secretion and pathogenesis. Infect Immun. 69 (6), 3523-3535 (2001).
- Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Webb, M. R. Direct, Real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).
- Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: An improvement and evaluation. J Biochem Biophys Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
- Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. A microassay for ATPase. Anal Biochem. 169 (2), 312-318 (1988).
- Harder, K. W., Owen, P., Wong, L. K. H., Aebersold, R., Clark-Lewis, I., Jirik, F. R. Characterization and kinetic analysis of the intracellular domain of human protein tyrosine phosphatase β (HPTP β) using synthetic phosphopeptides. Biochem J. 298 (2), 395-401 (1994).
- Camberg, J. L., Johnson, T. L., Patrick, M., Abendroth, J., Hol, W. G., Sandkvist, M. Synergistic stimulation of EpsE ATP hydrolysis by EpsL and acidic phospholipids. EMBO J. 26 (1), 19-27 (2006).
- McLaughlin, S. H., Smith, H. W., Jackson, S. E. Stimulation of the weak ATPase activity of human Hsp90 by a client protein. J Mol Biol. 315 (4), 787-798 (2002).
- Shiue, S., Kao, K., Leu, W., Chen, L., Chan, N., Hu, N. XpsE oligomerization triggered by ATP binding, not hydrolysis, leads to its association with XpsL. EMBO J. 25 (7), 1426-1435 (2006).
- Ghosh, A., Hartung, S., van der Does, C., Tainer, J. A., Albers, S. V. Archaeal flagellar ATPase motor shows ATP-dependent hexameric assembly and activity stimulation by specific lipid binding. Biochem J. 437 (1), 43-52 (2011).
- Savvides, S. N., et al. VirB11 ATPases are dynamic hexameric assemblies: new insights into bacterial type IV secretion. EMBO J. 22 (9), 1969-1980 (2003).
- Sanghera, J., Li, R., Yan, J. Comparison of the luminescent ADP-Glo assay to a standard radiometric assay for measurement of protein kinase activity. Assay Drug Dev Techn. 7 (6), 615-622 (2009).
- Sherman, D. J., et al. Decoupling catalytic activity from biological function of the ATPase that powers lipopolysaccharide transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), 4982-4987 (2014).
- Zhang, X., et al. Altered cofactor regulation with disease-associated p97/VCP mutations. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (14), E1705-E1714 (2015).
- Rowlands, M. G., Newbatt, Y. M., Prodromou, C., Pearl, L. H., Workman, P., Aherne, W. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Anal Biochem. 327 (2), 176-183 (2004).
