Abstract
三磷酸腺苷水解酶，或ATP酶，在细胞功能多样化阵列发挥关键作用。这些动态蛋白可用于机械工作，如蛋白质运输和退化，溶质运移和细胞运动产生能量。此处所描述的协议是用于测量纯化ATP酶的体外活性功能表征一个基本化验。蛋白水解的ATP以导致的无机磷酸盐的释放反应，和磷酸盐的释放的量，然后用比色测定法进行定量。这个高度适应协议可以进行调整，以测量在动力学或终点测定ATP酶活性。代表性的协议是基于活性和EPSE要求这里提供时，AAA + ATP酶参与II型分泌在细菌霍乱弧菌 。测量活动所需的纯化的蛋白质的量，测定的长度和sa定时和数量mpling间隔，缓冲液和盐的组合物，温度，辅因子，兴奋剂（如果有的话） 等可以从这里描述的变化，并且因此一些优化可能是必要的。该协议为特征的ATP酶的基本框架，并可以快速进行，方便地根据需要进行调整。
Protocol
1.执行与纯蛋白水解ATP反应
- 备齐试剂的股票与纯蛋白孵化。
- 制备含有100mM HEPES pH 8.5的65毫摩尔NaCl和5％甘油（或其它测定缓冲液适当）5倍的HEPES /氯化钠/甘油（HNG）缓冲器。
- 制备的100mM的MgCl 2（或其他金属，如果ATP酶是金属依赖性）的水。
- 准备新鲜的100毫米ATP在200毫米的Tris基地使用高纯度的ATP（不进一步调整pH值）。等分试样并储存的ATP库存在-20℃下不超过几个星期长，作为ATP的会分解随着时间的推移，从冷冻和解冻的ATP库存避免。
- 预混物的MgCl 2和ATP在1：1的比例只是之前设置ATP的水解反应。
- 准备和标记1.5毫升管的定期整个反应过程中采集样品。准备在试管时间0和时间15，30收集样品，45和60分钟。
注意：作为替代，只在时间0和端点收集样品。- 添加245微升1×HNG缓冲向每个管中以稀释来自ATP的水解反应1时50收集的样品。
- 制备干冰和乙醇的浴快速冷冻样品，使反应停止。在橡胶冰桶或其他安全的（非塑料）容器中，加几片干冰和精心浇足70-100％的乙醇覆盖干冰。
- 稀释纯化的蛋白质在1X HNG缓冲，适当（一般为5-10μM），并保持在冰上。
- 成立了ATP水解反应。
- 在单独0.5毫升管每个样品中，添加以下试剂（按顺序）：H 2 O（最多30微升的最终体积），6微升的5倍的HNG或其他缓冲液，3微升100mM的MgCl 2 -ATP混合物和0.25-5μM蛋白质。
- 包括一个缓冲器只阴性对照，其中不加入蛋白的条件。
- 在时间0除去从反应5微升，在含有245微升的HNG缓冲液中制备的1.5毫升管稀释1:50，并立即冷冻在干冰/乙醇浴中的样品。
- 孵育在37℃下反应以允许发生1小时ATP水解。在每个时间间隔（15，30，45，和60分钟），从反应除去5微升等份，并加入到含有HNG缓冲如在步骤1.6标记的样品管中。
- 在ATP水解反应结束时，将稀释的样品到-80℃冷冻贮存。为了确保所有的样品完全冷冻，等待出发前至少10分钟。
2.样品孵育含有游离皮与检测试剂
- 在室温（从步骤1.6和1.7获得）包含在每个时间点ATP水解反应等分试样解冻稀释的样品。
- 建立含有样品和磷酸盐标准的96孔板中。
- 在0.5ml的涂是，加入5.5微升800微米标准104.5微升HNG缓冲液稀释800微米至40微米的磷酸盐标准（带有皮检测试剂）。拌匀，并加入100微升此40μM丕标准，做好对A1 96孔板。
- 加入50μlHNG缓冲井B1-H1为1：郫县标准的1系列稀释。
- 从A1孔中取出50微升40μM丕并加入50微升分析缓冲液中以及B1，混合，并从B1孔取出50微升，并通过精心G1增加以及C1，继续稀释。混合，以保证每口井都有相同的体积后丢弃以及G1 50微升。那么H1应该只包含创建丕标准从40到0μM缓冲区。
注意：如果一个附加的因子（例如抑制剂）已被添加到样品中，创建包含该因子以控制在这些条件下在磷酸盐释放或吸光度的变化的标准曲线。 - 加入50微升每个SAMP的勒式两份的板。和不同的时间点水平;从在列同一时间点垂直（样品2时间0 = B2，B3样品1时间0 = A2，A3）添加样品。这允许多达8个样品，每个板5的时间点。
- 使用无菌移液管，以除去足够的孔雀石绿/钼酸丕检测试剂至100μl添加至各含有样品和标准孔（试剂需要（毫升）=样品和标准的0.1×数），并加入到便于吸移一个菜使用多通道移液管。不直接倒入检测试剂放入盘中，因为皮污染可能发生。
- 使用多通道移液管，从最后的时间点添加100微升丕检测试剂至各孔并混合通过小心地上下吹打次数一致的号码而不引入气泡，优选以所述第一时间点。
- 孵育在室温下25分钟的盘，或根据马nufacturer的指示。
3.定量结果使用酶标仪
- 使用吸光度酶标仪读取样品的吸光度在650nm处。
- 做一个皮标准曲线。使用绘图软件，图形，以便找到用于解决磷酸盐的每个样品中的量的方程为PI标准样品与浓度的吸光度值。
- 通过用磷酸盐标准校准计算各样品的ATP酶活性。磷酸盐释放=（OD 650 - Y轴截距）/斜率。
- 从每个样品的重复平均总皮。减去这个数字的唯一缓冲控制的吸光度。稀释倍数乘以（在本例中50）。
- 确定每个微摩尔蛋白释放纳摩尔皮。在动力学分析作图对于每个时间点，这些值应产生至少R = 0.99（ 图1）的线性拟合;如果n催产素，该测定可以与更多或更少的蛋白质或长或短的孵育时间进行调整。
- 表示的结果以nmolπ/微摩尔蛋白/分钟（ 图2,3），或以nmolπ/微克蛋白/分钟如果需要的话。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
所述T2S ATP酶EPSE 的体外活性可通过EPSE的共纯化与EPSL（EPSE-cytoEpsL）的胞质结构域和另外的酸性磷脂心磷脂12的刺激。另外，也可以通过比较野生型（WT）的活性，使用该测定的蛋白质的变异形式，以确定在ATP水解特定EPSE残基的作用。这里，替换在EPSE锌结合域中的两个赖氨酸残基的作用是通过纯化的WT EPSE-cytoEpsL的ATP酶活性的比较对EPSE K417AK419A-cytoEpsL变体测定的。在图1中 ，磷酸根释放超过1小时的动力学测定法中，用于动力学ATP酶活性的精确定量的要求的过程中直线前进，从同一纯化的蛋白质样品为图1中一式两份测定三次并定量图2显示的数据就......而言磷酸盐释放的平均速率。这些数据表明，K417和K419似乎是EPSE ATP酶活性重要的。然而，未刺激的（无心磷脂）ATP酶活性率的比较（ 图3）表明，K417和K419没有贡献EPSE的基础活性，而是与蛋白质的由心磷脂刺激的能力。在EPSE锌结合结构域的带正电荷的赖氨酸可以直接与带负电荷的磷脂相互作用，从而有利于EPSE ATP酶活性的磷脂介导的刺激。
图1： 磷酸盐是在动力学ATP酶测定线性发行每小时动能心磷脂刺激ATP酶测定0.5μM的WT EPSE-cytoEpsL的磷酸盐释放比较EPSE K417AK419A-cytoEpsL用牛血清白蛋白（BSA）测定为。阴性对照。数据[释放磷酸盐（y轴）对时间（x轴）的量]作图，并进行线性回归分析。斜率表示ATP水解的速率。代表图线性回归方程的三种蛋白质所示。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2： 双赖氨酸突变EPSE锌结合域减少激ATP酶活性的1小时动能心磷脂刺激ATP酶测定法用相同的蛋白质和条件的结果如在图1测定的技术重复的和进行三个独立的倍ATP水解的速率计算为每μMPR每分钟产生纳摩尔磷酸盐 otein利用线性回归方程。与平均值的标准差结果显示， 请点击这里查看该图的放大版本。
图3：EPSE锌结合结构域的双赖氨酸突变不与未刺激的ATP酶活性的干扰隔夜（16小时）端点未刺激（无心磷脂）ATP酶测定5微米WT EPSE-cytoEpsL的活性与BSA比较EPSE K417AK419A-cytoEpsL。作为阴性对照。测定在技术重复进行三次不同的时间，并与标准误差平均值的结果被示出。测定在16小时的时间内未刺激EPSE ATPase活性的基础水平是〜1000倍低于1小时动能心磷脂刺激活性。e.com/files/ftp_upload/54305/54305fig2large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
这是用于对生化表征纯化的蛋白质的体外 ATP酶活性测定通用协议。该方法很容易进行优化;例如，调整的蛋白质，缓冲液和盐的组合物，温度，以及改变该测定长度和间隔（包括增加的间隔的总数）的量可提高活性定量。市售孔雀石基于绿色试剂都高度敏感，而且可以检测少量游离磷酸的（〜100微升50皮摩尔）。因为该测定的敏感性，这是至关重要的使用一次性塑料器皿，超纯水，缓冲液和试剂不含污染的磷酸盐。纯化的蛋白质后，推荐尺寸排阻或离子交换层析以提高蛋白质的纯度和去除污染物。
对于体外 ATP酶活性显示弱的蛋白质，兴奋剂可以加入到反应到加强电子nzymatic活动。刺激ATP酶活性的许多因素进行了表征。例如，心磷脂等膜脂质，蛋白伴侣，如热休克蛋白90，和参与支持特定的构象或环境中的其他蛋白的客户蛋白，其中ATP酶作用13-15。我们的实验室首先特点EPSE通过比较，同源ATP酶6弱的ATP酶活性净化单体。我们后来发现，当EPSE用EPSL在T2S系统胞质域，跨膜蛋白和EPSE的结合伴侣共纯化，除了酸性磷脂如心磷脂到反应混合物中的大大增加EPSE 12的ATP酶活性。这可能模仿在液泡膜可促进齐聚条件EPSE经验。
许多技术已被用来量化体外 ATP酶纯化的蛋白质的活性。放射性γ-
此处所描述的测定法仅由一个磷酸盐释放测定步骤的，是高度敏感的，并且可以典型地几个小时内进行。它也可以编写，J再一个孔雀石含有绿基底，以避免从商业供应商6,9-购买的试剂盒。在进行该测定之前一个考虑是添加磷酸盐检测试剂，并采取吸光度读数之间的步骤是相对时间敏感，并且必须是20-30分钟之间。这个基本的协议可以被用来确定兴奋剂的作用（如所描述），拮抗剂，亚基，结构域，并且具体在ATP酶活15,16,18,19残基。该测定也可以扩展到测量该催化过程中释放出的磷酸盐磷酸酶或其它酶的活性。此外，该方法可以适用于高通量筛选对ATP酶抑制剂20。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES buffer | Fisher | BP310-500 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Fisher | BP41325 | |
| 96-well plates (clear, flat-bottom) | VWR | 82050-760 | |
| BIOMOL Green | Enzo Life Sciences | BML-AK111 | Preferred phosphate detection reagent. Caution: irritant. |
| Microplate reader | BioTek Synergy or comparable | ||
| Prism 5 | GraphPad Software |
References
- Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (7), 519-529 (2005).
- Baker, T. A., Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochimica et Biophysica Acta. 1823 (1), 15-28 (2012).
- Maxson, M. E., Grinstein, S. The vacuolar-type H+-ATPase at a glance - more than a proton pump. J Cell Sci. 127 (23), 4987-4993 (2014).
- Planet, P. J., Kachlany, S. C., DeSalle, R., Figurski, D. H. Phylogeny of genes for secretion NTPases: Identification of the widespread tadA subfamily and development of a diagnostic key for gene classification. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2503-2508 (2001).
- Robien, M. A., Krumm, B. E., Sandkvist, M., Hol, W. G. J. Crystal Structure of the Extracellular Protein Secretion NTPase EpsE of Vibrio cholerae. J Mol Biol. 333 (3), 657-674 (2003).
- Camberg, J. L., Sandkvist, M. Molecular analysis of the Vibrio cholerae type II secretion ATPase EpsE. J Bacteriol. 187 (1), 249-256 (2005).
- Sandkvist, M. Type II secretion and pathogenesis. Infect Immun. 69 (6), 3523-3535 (2001).
- Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Webb, M. R. Direct, Real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).
- Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: An improvement and evaluation. J Biochem Biophys Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
- Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. A microassay for ATPase. Anal Biochem. 169 (2), 312-318 (1988).
- Harder, K. W., Owen, P., Wong, L. K. H., Aebersold, R., Clark-Lewis, I., Jirik, F. R. Characterization and kinetic analysis of the intracellular domain of human protein tyrosine phosphatase β (HPTP β) using synthetic phosphopeptides. Biochem J. 298 (2), 395-401 (1994).
- Camberg, J. L., Johnson, T. L., Patrick, M., Abendroth, J., Hol, W. G., Sandkvist, M. Synergistic stimulation of EpsE ATP hydrolysis by EpsL and acidic phospholipids. EMBO J. 26 (1), 19-27 (2006).
- McLaughlin, S. H., Smith, H. W., Jackson, S. E. Stimulation of the weak ATPase activity of human Hsp90 by a client protein. J Mol Biol. 315 (4), 787-798 (2002).
- Shiue, S., Kao, K., Leu, W., Chen, L., Chan, N., Hu, N. XpsE oligomerization triggered by ATP binding, not hydrolysis, leads to its association with XpsL. EMBO J. 25 (7), 1426-1435 (2006).
- Ghosh, A., Hartung, S., van der Does, C., Tainer, J. A., Albers, S. V. Archaeal flagellar ATPase motor shows ATP-dependent hexameric assembly and activity stimulation by specific lipid binding. Biochem J. 437 (1), 43-52 (2011).
- Savvides, S. N., et al. VirB11 ATPases are dynamic hexameric assemblies: new insights into bacterial type IV secretion. EMBO J. 22 (9), 1969-1980 (2003).
- Sanghera, J., Li, R., Yan, J. Comparison of the luminescent ADP-Glo assay to a standard radiometric assay for measurement of protein kinase activity. Assay Drug Dev Techn. 7 (6), 615-622 (2009).
- Sherman, D. J., et al. Decoupling catalytic activity from biological function of the ATPase that powers lipopolysaccharide transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), 4982-4987 (2014).
- Zhang, X., et al. Altered cofactor regulation with disease-associated p97/VCP mutations. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (14), E1705-E1714 (2015).
- Rowlands, M. G., Newbatt, Y. M., Prodromou, C., Pearl, L. H., Workman, P., Aherne, W. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Anal Biochem. 327 (2), 176-183 (2004).
