Abstract
Adenosintriphosphat-hydrolyserende enzymer eller ATPaser, spiller en kritisk rolle i en bred vifte af cellulære funktioner. Disse dynamiske proteiner kan generere energi til mekanisk arbejde, såsom protein handel og nedbrydning, stoftransport og cellulære bevægelser. Protokollen beskrevet her er en grundlæggende assay til måling af in vitro-aktiviteten af oprensede ATPaser til funktionel karakterisering. Proteiner hydrolyserer ATP i en reaktion, der resulterer i uorganisk phosphat frigivelse, og mængden af phosphat frigivet derefter kvantificeret under anvendelse af et kolorimetrisk assay. Denne meget fleksibel protokol kan justeres til at måle ATPase-aktivitet i kinetiske eller endpoint assays. En repræsentativ protokol gives her baseret på aktiviteten og krav i Epse, AAA + ATPase involveret i type II Sekretion i bakterien Vibrio cholerae. Mængden af oprenset protein er nødvendig for at måle aktivitet, længde af assayet samt tidspunktet for og antallet af sampling intervaller, puffer og salt sammensætning, temperatur, cofaktorer, stimulanser (hvis nogen), etc. kan variere fra de her beskrevne, og således nogle optimering kan være nødvendig. Denne protokol giver en grundlæggende ramme for karakteriserer ATPaser og kan udføres hurtigt og nemt justeres efter behov.
Protocol
1. Udfør ATP hydrolysereaktion med oprenset protein
- Forbered Lagre af alle de nødvendige reagenser til Inkubation med oprenset protein.
- Forbered 5x HEPES / NaCl / glycerol (HNG) puffer indeholdende 100 mM HEPES pH 8,5, 65 mM NaCl, og 5% glycerol (eller andet assaybuffer eventuelt).
- Forbered 100 mM MgCl2 (eller et andet metal, hvis ATPase er metal-afhængig) i vand.
- Forbered frisk 100 mM ATP i 200 mM Tris Base (ikke justere pH yderligere) ved hjælp af høj renhed ATP. Portion og gemme ATP lager ved -20 ° C i ikke længere end et par uger, da ATP vil bryde ned over tid, og afstå fra at fryse og optøning ATP lager.
- Premix MgCl2 og ATP på et 1: 1-forhold lige før opsætning af ATP-hydrolyse reaktionen.
- Forberede og mærke 1,5 ml rør til opsamling af prøver med jævne mellemrum gennem hele reaktionen. Forbered rør til at indsamle prøver på tidspunkt 0 og ved tidspunktet 15, 30,45, og 60 min.
BEMÆRK: Som et alternativ, indsamle prøver kun på tidspunkt 0 og slutpunktet.- Tilføj 245 pi 1x HNG buffer til hvert rør for at fortynde prøver indsamlet fra ATP hydrolysereaktioner 1:50.
- Forbered et bad af tøris og ethanol for hurtigt at fryse prøverne for at stoppe reaktionen. I en gummi isspand eller anden sikker (ikke-plast) beholder, tilsættes nogle stykker af tøris og omhyggeligt hæld nok 70-100% ethanol til dækning af tøris.
- Fortynd oprenset protein i 1x HNG buffer, som er relevant (typisk 5-10 uM), og holde på is.
- Opsætning af ATP hydrolyse reaktioner.
- I separate 0,5 ml rør for hver prøve tilsættes følgende reagenser (i rækkefølge): H2O (op til et endeligt volumen på 30 pi), 6 pi 5x HNG eller anden puffer, 3 pi 100 mM MgCl2 -ATP blanding, og 0,25-5 uM protein.
- Inkluderer en puffer kun negativ kontrol tilstand, hvor intet protein tilsættes.
- Fjern 5 pi fra reaktionen ved tiden 0, fortyndes 1:50 i den fremstillede 1,5 ml rør indeholdende 245 pi HNG buffer, og straks fryse prøven i tøris / ethanol-bad.
- Inkuber reaktioner ved 37 ° C for at tillade ATP-hydrolyse at forekomme i 1 time. Ved hvert interval (15, 30, 45 og 60 min), fjernes 5 pi prøver fra reaktionen og tilføje til mærkede prøveglas indeholdende HNG buffer som i trin 1.6.
- Ved afslutningen af ATP hydrolysereaktionen, flytte fortyndede prøver til en -80 ° C fryser for lagring. For at sikre, at alle prøver er helt frosset, vente mindst 10 minutter, før du fortsætter.
2. Der inkuberes Prøver indeholdende Free Pi med påvisningsreagens
- Optø fortyndede prøver indeholdende ATP hydrolyse reaktionsprodukter alikvoter ved hvert tidspunkt (opnået fra trin 1.6 og 1.7) ved stuetemperatur.
- Opsæt en 96-brønds plade indeholdende prøver og fosfat standarder.
- I en 0,5 ml tuvære fortyndes phosphat standard (forsynet med Pi påvisningsreagens) fra 800 uM til 40 uM ved tilsætning 5,5 pi af 800 pM standard til 104,5 pi HNG buffer. Bland godt, og der tilsættes 100 pi af denne 40 pM Pi standard til brønd A1 i en 96-brønds plade.
- Tilføj 50 pi HNG buffer til hul B1-H1 for 1: 1 serielle fortyndinger af Pi standard.
- Fjern 50 gi 40 pM Pi fra godt A1 og tilføje til 50 pi assay buffer i godt B1, mix, og fjern 50 pi fra godt B1 og føje til godt C1, fortsættende fortyndinger gennem godt G1. Kassér 50 pi fra godt G1 efter blanding for at sikre hver brønd har samme volumen. Nå H1 bør indeholde kun buffer for at skabe en Pi standard fra 40 til 0 pM.
BEMÆRK: Hvis en yderligere faktor (såsom en inhibitor) er blevet tilføjet til prøverne, skabe en standardkurve indeholder denne faktor til at kontrollere for ændringer i fosfat frigivelse eller absorbans under disse betingelser. - Der tilsættes 50 pi af hver Sample i to eksemplarer til pladen. Tilsæt prøver fra samme tidspunkt i kolonne vertikalt (prøve 1 gang 0 = A2, A3, prøve 2 tiden 0 = B2, B3) og forskellige tidspunkter vandret. Dette giver mulighed for op til 8 prøver og 5 tidspunkter per plade.
- Brug en steril pipette til fjernelse nok malakitgrønt / molybdat Pi påvisningsreagens at tilføje 100 pi til hver af brøndene med prøver og standarder (reagens nødvendig (ml) = 0,1 x antal prøver og standarder) og tilføje til en skål for nem pipettering ved anvendelse af en multikanal pipette. Hæld ikke afsløring reagens direkte i fadet, da Pi forurening er sandsynlig.
- Ved hjælp af en multikanal pipette, tilsættes 100 pi af Pi påvisningsreagens til hver brønd, og der blandes ved forsigtigt at pipettere op og ned en konsistent antal gange uden at indføre bobler, fortrinsvis i rækkefølge fra de sidste tidspunkter til de første tidspunkter.
- Inkubér pladen i 25 minutter ved stuetemperatur, eller ifølge manufacturer anvisninger.
3. kvantificere Resultater Brug af en Microplate Reader
- Læse absorbansen af prøverne ved 650 nm med en absorbans-mikropladelæser.
- Lav en Pi standardkurve. Ved hjælp af en plotning software, tegne absorbansværdierne for PI standardprøver versus koncentration for at finde en ligning anvendes til at løse for mængden af phosphat i hver prøve.
- Beregn ATPase aktivitet for hver prøve ved at kalibrere med phosphat standard. Fosfat frigivet = (OD 650 - y-aksen) / hældning.
- Gennemsnit samlede Pi fra dubletter af hver prøve. Fratræk puffer kun kontrol absorbans læsning fra dette nummer. Gang dette med fortyndingsfaktoren (50 i vores eksempel).
- Bestem nmol Pi frigivet pr pmol protein. Graftegning disse værdier for hvert tidspunkt i et kinetisk assay bør give lineære anfald af mindst R = 0,99 (Figur 1); Hvis not kan assayet justeres med mere eller mindre protein eller en længere eller kortere inkubationstid.
- Repræsenterer resultaterne som nmol Pi / pmol protein / min (figur 2, 3), eller som nmol Pi / ug protein / min, hvis det ønskes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vitro-aktiviteten af T2S ATPase Epse kan stimuleres ved copurification af Epse med det cytoplasmatiske domæne af EpsL (Epse-cytoEpsL) og tilsætning af den sure phospholipid cardiolipin 12. Det er også muligt at bestemme rollen af bestemte Epse rester i ATP-hydrolyse ved at sammenligne aktiviteten af vildtype (WT) til variante former af proteinet ved hjælp af denne assay. Her er effekten af at erstatte to lysinrester i Epse zinkbindingsdomænet måles ved at sammenligne ATPase aktivitet af oprenset WT Epse-cytoEpsL til Epse K417AK419A-cytoEpsL variant. I figur 1 phosphatfrigivelse forløber lineært i løbet af en 1 time kinetisk assay, et krav til nøjagtig kvantificering af kinetisk ATPase-aktivitet. Figur 2 viser data fra de samme oprensede proteinprøver som figur 1, der blev analyseret tre gange in duplo og kvantificeret i form afGennemsnittet af phosphat frigivelse. Disse data viser, at K417 og K419 synes at være vigtige for Epse ATPase-aktivitet. Sammenligning af ustimulerede (ingen cardiolipin) ATPase-aktivitet satser (figur 3) viser imidlertid, at K417 og K419 ikke bidrager til Epse basale aktivitet, men snarere til proteinets evne til at blive stimuleret af cardiolipin. De positivt ladede lysiner i Epse zink-bindende domæne kan interagere direkte med de negativt ladede phospholipider, dermed bidrage til phospholipid-medierede stimulering af Epse ATPase aktivitet.
Figur 1: Phosphate er frigivet lineært i en Kinetic ATPase assay En time kinetisk cardiolipin-stimuleret ATPase assay sammenligning phosphat tab på 0,5 uM WT Epse-cytoEpsL til Epse K417AK419A-cytoEpsL med bovint serumalbumin (BSA) analyseres som.en negativ kontrol. Data [mængde frigjort phosphat (y-akse) versus tid (x-akse)] blev plottet og underkastet lineær regressionsanalyse. Hældningen repræsenterer hastigheden af ATP hydrolyse. En repræsentativ graf med lineær regression ligninger for de tre proteiner er vist. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:.. Dobbelt Lysin Mutationer i Epse zinkbindingsdomænet Reducer stimuleret ATPase aktivitet resulterer i 1 time kinetiske cardiolipin-stimuleret ATPase assay med de samme proteiner og betingelser som i figur 1 Assays blev udført tre separate gange i teknisk duplo, og den sats af ATP-hydrolyse blev beregnet som nmol phosphat genereret pr minut pr uM pr otein bruge lineær regression ligninger. De gennemsnitlige resultater med standard fejl vises. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Dobbelt lysin Mutationer i Epse zinkbindingsdomænet ikke forstyrrer Ustimulerede ATPase aktivitet Overnight (16 timer) endepunkt ustimuleret (ingen cardiolipin) ATPase assay sammenligne aktiviteten af 5 uM WT Epse-cytoEpsL til Epse K417AK419A-cytoEpsL med BSA. som en negativ kontrol. Assays blev udført tre separate gange i teknisk duplo, og gennemsnitlige resultater med standardfejl er vist. Det basale niveau af ikke-stimulerede Epse ATPase-aktivitet undersøgt over en 16 timers periode er ~ 1.000 gange lavere end 1 time kinetisk cardiolipin-stimuleret aktivitet.e.com/files/ftp_upload/54305/54305fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette er en generel protokol til måling in vitro ATPase aktivitet af oprensede proteiner til biokemisk karakterisering. Denne metode er let optimeres; for eksempel kan justere mængden af protein, puffer og salt sammensætninger, temperatur og varierende assayet længde og intervaller (herunder forøge det samlede antal intervaller) at forbedre aktivitet kvantificering. Kommercielt tilgængelige malakitgrønt-baserede reagenser er meget følsomme, og kan detektere små mængder af frit phosphat (~ 50 pmol i 100 pi). På grund af dette assay følsomhed, er det afgørende at bruge engangs plast ware, ultrarent vand, buffere, og reagenser blottet for kontaminerende fosfat. Efter oprensning af proteiner, anbefales størrelseseksklusion eller ionbytningschromatografi for at forbedre proteinrenhed og fjerne kontaminanter.
For proteiner, der udviser svag in vitro ATPase-aktivitet, kan stimulanser tilsættes til reaktionsblandingen for at forbedre enzymatic aktivitet. Mange faktorer, der stimulerer ATPase-aktivitet er blevet karakteriseret. For eksempel, cardiolipin og andre membran lipider, klient proteiner af chaperoner såsom Hsp90, og andre proteiner involveret i støtte specifikke konformationer eller miljøer, hvor ATPaser fungere 13-15. Vores laboratorium først karakteriseret Epse ved at rense monomerer med svag ATPase aktivitet sammenlignet med homologe ATPaser 6. Senere opdagede vi, at når Epse blev renset sammen med det cytoplasmatiske domæne af EpsL, et transmembrant protein og bindingspartner Epse i T2S systemet, tilsætning af sure phospholipider, såsom cardiolipin til reaktionsblandingen kraftigt forøget ATPase aktivitet af Epse 12. Denne sandsynlige efterligner betingelserne Epse oplevelser den cytoplasmatiske membran, der kan fremme oligomerisering.
Mange teknikker er blevet anvendt til at kvantificere in vitro ATPase-aktivitet af oprensede proteiner. radioaktivt γ-
Den her beskrevne assay kun består af en phosphat måling frigivelse trin, er meget følsomme, og kan typisk udføres inden for et par timer. Det er også muligt at prepare en malakitgrønt-substrat at undgå at købe et kit fra en kommerciel leverandør 6,9. En overvejelse før de gennemfører dette assay er, at trinnet mellem tilsætning af phosphat påvisningsreagens og under absorbansaflæsninger er relativt tidsfølsomme og skal være mellem 20-30 min. Denne grundlæggende protokol kan anvendes til at bestemme den rolle, stimulanser (som beskrevet), antagonister underenheder, domæner og specifikke rester i ATPase-aktivitet 15,16,18,19. Dette assay kan også udvides til at måle aktiviteten af phosphataser eller andre enzymer, der frigiver phosphat under katalyse. Derudover kan denne fremgangsmåde anvendes til high-throughput screening for ATPase-inhibitorer 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES buffer | Fisher | BP310-500 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Fisher | BP41325 | |
| 96-well plates (clear, flat-bottom) | VWR | 82050-760 | |
| BIOMOL Green | Enzo Life Sciences | BML-AK111 | Preferred phosphate detection reagent. Caution: irritant. |
| Microplate reader | BioTek Synergy or comparable | ||
| Prism 5 | GraphPad Software |
References
- Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (7), 519-529 (2005).
- Baker, T. A., Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochimica et Biophysica Acta. 1823 (1), 15-28 (2012).
- Maxson, M. E., Grinstein, S. The vacuolar-type H+-ATPase at a glance - more than a proton pump. J Cell Sci. 127 (23), 4987-4993 (2014).
- Planet, P. J., Kachlany, S. C., DeSalle, R., Figurski, D. H. Phylogeny of genes for secretion NTPases: Identification of the widespread tadA subfamily and development of a diagnostic key for gene classification. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2503-2508 (2001).
- Robien, M. A., Krumm, B. E., Sandkvist, M., Hol, W. G. J. Crystal Structure of the Extracellular Protein Secretion NTPase EpsE of Vibrio cholerae. J Mol Biol. 333 (3), 657-674 (2003).
- Camberg, J. L., Sandkvist, M. Molecular analysis of the Vibrio cholerae type II secretion ATPase EpsE. J Bacteriol. 187 (1), 249-256 (2005).
- Sandkvist, M. Type II secretion and pathogenesis. Infect Immun. 69 (6), 3523-3535 (2001).
- Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Webb, M. R. Direct, Real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).
- Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: An improvement and evaluation. J Biochem Biophys Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
- Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. A microassay for ATPase. Anal Biochem. 169 (2), 312-318 (1988).
- Harder, K. W., Owen, P., Wong, L. K. H., Aebersold, R., Clark-Lewis, I., Jirik, F. R. Characterization and kinetic analysis of the intracellular domain of human protein tyrosine phosphatase β (HPTP β) using synthetic phosphopeptides. Biochem J. 298 (2), 395-401 (1994).
- Camberg, J. L., Johnson, T. L., Patrick, M., Abendroth, J., Hol, W. G., Sandkvist, M. Synergistic stimulation of EpsE ATP hydrolysis by EpsL and acidic phospholipids. EMBO J. 26 (1), 19-27 (2006).
- McLaughlin, S. H., Smith, H. W., Jackson, S. E. Stimulation of the weak ATPase activity of human Hsp90 by a client protein. J Mol Biol. 315 (4), 787-798 (2002).
- Shiue, S., Kao, K., Leu, W., Chen, L., Chan, N., Hu, N. XpsE oligomerization triggered by ATP binding, not hydrolysis, leads to its association with XpsL. EMBO J. 25 (7), 1426-1435 (2006).
- Ghosh, A., Hartung, S., van der Does, C., Tainer, J. A., Albers, S. V. Archaeal flagellar ATPase motor shows ATP-dependent hexameric assembly and activity stimulation by specific lipid binding. Biochem J. 437 (1), 43-52 (2011).
- Savvides, S. N., et al. VirB11 ATPases are dynamic hexameric assemblies: new insights into bacterial type IV secretion. EMBO J. 22 (9), 1969-1980 (2003).
- Sanghera, J., Li, R., Yan, J. Comparison of the luminescent ADP-Glo assay to a standard radiometric assay for measurement of protein kinase activity. Assay Drug Dev Techn. 7 (6), 615-622 (2009).
- Sherman, D. J., et al. Decoupling catalytic activity from biological function of the ATPase that powers lipopolysaccharide transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), 4982-4987 (2014).
- Zhang, X., et al. Altered cofactor regulation with disease-associated p97/VCP mutations. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (14), E1705-E1714 (2015).
- Rowlands, M. G., Newbatt, Y. M., Prodromou, C., Pearl, L. H., Workman, P., Aherne, W. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Anal Biochem. 327 (2), 176-183 (2004).
