Abstract
Adenosine-trifosfaat hydrolyserende enzymen, of ATPasen, spelen een cruciale rol in een breed scala van cellulaire functies. Deze dynamische eiwitten kunnen energie op te wekken voor het mechanisch werk, zoals eiwitten mensenhandel en degradatie, transport van opgeloste stoffen, en cellulaire bewegingen. De hier beschreven protocol is een eenvoudige test voor het meten van de in vitro activiteit van gezuiverde ATPasen voor functionele karakterisatie. Eiwitten hydrolyseren ATP in een reactie die resulteert in anorganisch fosfaat afgifte en de hoeveelheid fosfaat vrijgemaakt wordt vervolgens gekwantificeerd onder toepassing van een colorimetrische assay. Deze zeer flexibele protocol kan worden aangepast om ATPase-activiteit te meten in kinetische of eindpunt assays. Een representatief protocol is hier voorzien gebaseerd op de activiteit en vereisten van Epse, de AAA + ATPase betrokken type II Uitscheiding in de bacterie Vibrio cholerae. De hoeveelheid gezuiverde eiwit nodig te meten, lengte van de test en het tijdstip en het aantal sampling intervallen, buffer en zoutsamenstelling, temperatuur, co-factoren, stimulerende middelen (indien aanwezig), etc. kunnen afwijken van de hier beschreven en aldus sommige optimalisering nodig zijn. Dit protocol voorziet in een basiskader voor het karakteriseren ATPasen en kan snel worden uitgevoerd en gemakkelijk als nodig aangepast.
Protocol
1. Voer ATP hydrolysereactie met Purified Protein
- Bereid voorraden alle benodigde reagentia voor incubatie met gezuiverde eiwit.
- Bereid 5x HEPES / NaCl / glycerol (HNG) buffer die 100 mM HEPES pH 8,5, 65 mM NaCl en 5% glycerol (of ander testbuffer gebruik).
- Bereid 100 mM MgCl 2 (of ander metaal, indien ATPase metaal-afhankelijk) in water.
- Bereid verse 100 mM ATP in 200 mM Tris Base (denk pH niet verder aan te passen) met behulp van hoge zuiverheid ATP. Aliquot en opslaan van de ATP-voorraad bij -20 ° C niet langer dan een paar weken, als ATP af zal breken na verloop van tijd, en zich te onthouden van invriezen en ontdooien van de ATP-voorraad.
- Premix MgCl2 en ATP in een 1: 1 verhouding net voordat de ATP hydrolysereactie.
- Bereiden en labelen 1,5 ml buisjes voor het nemen van monsters op regelmatige tijdstippen gedurende de reactie. Bereid buisjes om monsters te verzamelen op tijd 0 en op het moment 15, 30,45 en 60 min.
Opmerking: Als alternatief verzamelen monsters slechts op tijdstip 0 en het eindpunt.- Voeg 245 ul 1x HNG buffer aan elke buis om monsters van het ATP hydrolyse reacties 1:50 verdunnen.
- Bereid een bad van droogijs en ethanol voor snel invriezen monsters om de reactie te stoppen. In een rubberen ijsemmer of andere veilige (niet-plastic) container, voeg verschillende stukken van droog ijs en giet genoeg 70-100% ethanol om het droogijs te dekken.
- Verdun gezuiverde eiwit in 1x HNG buffer, voor zover van toepassing (gewoonlijk 5-10 uM), en blijf op ijs.
- Stel de ATP hydrolyse reacties.
- In afzonderlijke buizen van 0,5 ml voor elk monster, de volgende reagentia (in volgorde): H2O (tot een eindvolume van 30 pl), 6 pl 5x HNG of andere buffer, 3 pl 100 mM MgCl 2 -ATP mengsel, en 0,25-5 uM eiwit.
- Onder meer een buffer-enige negatieve controle conditie waarin geen eiwit wordt toegevoegd.
- Verwijderen 5 ul van het reactiemengsel op tijdstip 0, 1:50 verdunnen in de bereide 1,5 ml buis die 245 gl HNG buffer en onmiddellijk bevriezen van het monster in droogijs / ethanol bad.
- Incubeer reacties bij 37 ° C om ATP hydrolyse optreedt gedurende 1 uur. Bij elk interval (15, 30, 45 en 60 min), 5 ul aliquots verwijderd uit het reactiemengsel en voeg aan gemerkt monsterbuizen met HNG buffer in stap 1,6.
- Aan het eind van de hydrolysereactie ATP, verdunde monsters verplaatsen naar een -80 ° C vriezer voor opslag. Om ervoor te zorgen alle monsters zijn volledig bevroren, wacht minstens 10 minuten voordat u verder gaat.
2. Incubate monsters die Gratis Pi met Detection Reagent
- Dooi verdunde monsters met ATP hydrolysereactie porties op elk tijdstip (verkregen van stap 1,6 en 1,7) bij kamertemperatuur.
- Het opzetten van een 96-well plaat met monsters en fosfaat standaarden.
- In een 0,5 ml tute verdunnen standaard fosfaat (Pi voorzien detectiereagens) van 800 uM tot 40 uM door toevoeging van 5,5 pi van 800 pM standaard 104,5 gl HNG buffer. Meng goed en voeg 100 ul van deze 40 pM Pi standaard goed A1 van een 96-wells plaat.
- Voeg 50 ul HNG buffer aan putjes B1-H1 voor 1: 1 seriële verdunningen van de Pi-standaard.
- Verwijder 50 pi 40 pM Pi uit goed A1 en voeg aan 50 pl assaybuffer in zowel B1, mixen en verwijdert 50 gl uit goed B1 en voeg goed C1, aanhoudende verdunningen met zowel G1. Gooi 50 gl van zowel G1 na menging te verzekeren elk putje heeft hetzelfde volume. Goed H1 mogen alleen buffer tot een norm vast Pi 40-0 uM bevatten.
OPMERKING: Indien een aanvullende factor (bijvoorbeeld remmer) werd aan de monsters toegevoegd, maakt een standaardcurve die deze factor te controleren veranderingen in fosfaat afgifte of absorptie onder die omstandigheden. - Voeg 50 ul van elk sample in tweevoud op de plaat. samples toe te voegen uit dezelfde tijd punt in de kolommen verticaal (monster 1 keer 0 = A2, A3; sample 2 keer 0 = B2, B3) en verschillende tijdstippen horizontaal. Dit maakt maximaal 8 samples en 5 tijdstippen per plaat.
- Een steriele pipet voldoende malachietgroen / molybdaat Pi detectiereagens verwijderen om 100 ul toe aan elk van de putjes die monsters en standaarden (reagens vereist (ml) = 0,1 x aantal monsters en standaarden) en aan een schotel voor eenvoudige pipetteren met behulp van een multichannel pipet. Niet direct giet de detectie reagens in de schaal, als Pi besmetting dreigt te ontstaan.
- Met een multichannel pipet, voeg 100 ul van de pi detectiereagens aan elk putje en meng door voorzichtig pipetteren en neer een consistent aantal keren zonder dat er luchtbellen, bij voorkeur in volgorde van de laatste tijdstippen aan de eerste tijdstippen.
- Incubeer de plaat gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur, of volgens de mabrikant's richtingen.
3. Resultaten kwantificeren met behulp van een Microplate Reader
- Lees de absorptie van de monsters bij 650 nm onder toepassing van een absorptie microplaat reader.
- Maak een Pi standaard curve. Met behulp van een grafische software, grafiek de absorptiewaarden voor de Pi standaardmonsters tegen de concentratie om een gebruikte vergelijking op te lossen voor de hoeveelheid fosfaat in elk monster te vinden.
- Bereken de ATPase-activiteit voor elk monster door ijken met fosfaat standaard. Fosfaat vrijgegeven = (OD 650 - Y as) / helling.
- Het gemiddelde van de totale Pi van duplicaten van elk monster. Trek de buffer-only control's absorptie het lezen van dit nummer. Vermenigvuldig dit met de verdunningsfactor (50 in ons voorbeeld).
- Bepaal de nmol Pi vrijgegeven per umol eiwit. Grafische deze waarden voor elk tijdpunt in een kinetische proef moet lineaire fits van ten minste R = 0,99 (figuur 1) werd verkregen; als not, kan de test worden aangepast met min of meer eiwitten of kortere of langere incubatietijd.
- Vertegenwoordigen de resultaten als nmol Pi / umol proteïne / min (figuren 2, 3), of als nmol Pi / ug eiwit / min indien gewenst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De in vitro activiteit van de T2S ATPase épse kan worden gestimuleerd door copurification van Epse met het cytoplasmatische domein van EPSL (EPSE-cytoEpsL) en toevoeging van de zure fosfolipide cardiolipine 12. Het is ook mogelijk om de rol van specifieke resten in Epse ATP hydrolyse bepalen door de activiteit van wildtype (WT) voor variante vormen van het eiwit het gebruik van deze assay. Hier wordt het effect van het substitueren twee lysineresten in de EPSE-zink-bindend domein gemeten door ATPase activiteit van gezuiverde WT EPSE-cytoEpsL de EPSE K417AK419A-cytoEpsL variant. In figuur 1, fosfaatemissie verloopt lineair in de loop van een 1 uur kinetische assay, een vereiste voor nauwkeurige kwantificering kinetische ATPase activiteit. Figuur 2 toont gegevens van dezelfde gezuiverde eiwit monsters als figuur 1 dat drie keer werden in tweevoud en gekwantificeerd aangaande metde gemiddelde snelheid van fosfaat release. Deze gegevens tonen dat K417 en K419 blijken belangrijk épse ATPase activiteit. Uit een vergelijking van ongestimuleerde (geen cardiolipine) ATPase activiteitspercentage (figuur 3) laat zien dat K417 en K419 niet bijdragen aan basale activiteit Epse, maar veeleer het vermogen van het eiwit worden gestimuleerd door cardiolipine. De positief geladen lysines in de EPSE-zink-bindend domein kan rechtstreeks interageren met de negatief geladen fosfolipiden en aldus bijdragen aan de fosfolipide-gemedieerde stimulatie van Epse ATPase activiteit.
Figuur 1: Fosfaat lineair vrijgegeven in een Kinetic ATPase Assay Een uur kinetische cardiolipine gestimuleerde ATPase assay vergelijken fosfaatemissie van 0,5 uM WT EPSE-cytoEpsL aan EPSE K417AK419A-cytoEpsL met runderserumalbumine (BSA) bepaald zoals.een negatieve controle. Gegevens [hoeveelheid afgegeven fosfaat (y-as) versus de tijd (x-as)] werden uitgezet en onderworpen aan lineaire regressieanalyse. De helling vertegenwoordigt de snelheid van ATP hydrolyse. Een vertegenwoordiger grafiek met lineaire regressie vergelijkingen voor de drie eiwitten wordt getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:.. Dubbele Lysine Mutaties in EPSE Zinc-bindingsdomein verminderen gestimuleerde ATPase activiteit Resultaten van de 1 hr kinetische cardiolipine gestimuleerde ATPase assay dezelfde eiwitten en omstandigheden als in figuur 1 Testen werden drie afzonderlijke maal uitgevoerd technische duplo en de snelheid van ATP hydrolyse werd berekend als nmol fosfaat geproduceerd per minuut per uM pr otein behulp van lineaire regressie vergelijkingen. De gemiddelde resultaten met standaard foutmelding getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Dubbele Lysine Mutaties in EPSE Zinc-bindingsdomein niet storen gestimuleerde ATPase activiteit overnacht (16 uur) eindpunt ongestimuleerde (geen cardiolipine) ATPase assay vergelijken van de activiteit van 5 uM WT EPSE-cytoEpsL aan EPSE K417AK419A-cytoEpsL met BSA. als een negatieve controle. Testen werden drie afzonderlijke keer uitgevoerd in technische duplo en gemiddelde resultaten met de standaard fout wordt getoond. De basale niveau van niet-gestimuleerde Epse ATPase-activiteit getest gedurende een 16 uur periode ~ 1000 keer lager dan 1 hr kinetic-cardiolipine gestimuleerde activiteit.e.com/files/ftp_upload/54305/54305fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit is een algemeen protocol voor het meten van ATPase-activiteit in vitro van gezuiverde eiwitten voor biochemische karakterisatie. Deze werkwijze is eenvoudig geoptimaliseerd; bijvoorbeeld het aanpassen van de hoeveelheid proteïne, buffer en zout samenstellingen, temperatuur, en het variëren van de lengte en assay intervallen (inclusief de bevordering totaal aantal intervallen) kan activiteit kwantificering verbeteren. In de handel verkrijgbare malachietgroen-gebaseerde reagentia zijn zeer gevoelig en kunnen kleine hoeveelheden vrij fosfaat te detecteren (~ 50 pmol in 100 pl). Vanwege de gevoeligheid van deze test, is het cruciaal om wegwerp plastic ware, ultrapuur water, buffers en reagentia verstoken van verontreinigende fosfaat gebruiken. Na het zuiveren van eiwitten, wordt de grootte uitsluiting of ionuitwisselingschromatografie aanbevolen om eiwit zuiverheid te verbeteren en te verwijderen verontreinigingen.
Voor eiwitten weergeven weak in vitro ATPase activiteit kan genotmiddelen worden toegevoegd om de reactie te verbeteren enzymatic activiteit. Vele factoren die ATPase activiteit te stimuleren zijn gekarakteriseerd. Bijvoorbeeld, cardiolipine en andere membraanlipiden, cliënt eiwitten van chaperones zoals Hsp90 en andere eiwitten die betrokken zijn rond specifieke conformaties of omgevingen waarin ATPasen functioneren 13-15. Ons laboratorium eerst gekarakteriseerd épse door zuivering monomeren met zwakke ATPase activiteit vergeleken met homologe ATPasen 6. We later ontdekt dat wanneer épse werd meegezuiverde met het cytoplasmatische domein van EPSL, een transmembraan eiwit en bindingspartner van Epse in het systeem T2S toevoeging van zure fosfolipiden zoals cardiolipine aan het reactiemengsel sterk gegroeid in de ATPase activiteit van Epse 12. Dit waarschijnlijk bootst de voorwaarden Epse ervaringen bij de cytoplasmatische membraan dat oligomerisatie kunnen bevorderen.
Vele technieken zijn gebruikt om in vitro ATPase activiteit van gezuiverde eiwitten kwantificeren. radioactieve γ-
De hier beschreven assay uit slechts één fosfaatemissie meetstap, is zeer gevoelig en kan kenmerkend worden uitgevoerd binnen een paar uur. Het is ook mogelijk om preparopnieuw een malachietgroen-substraat om te voorkomen dat de aankoop van een kit van een commerciële leverancier 6,9. Een overweging voor de aanvang van deze test is dat de stap tussen het toevoegen van het fosfaat detectie reagens en het nemen van absorptie metingen is relatief tijdgevoelige en moet tussen de 20-30 min. Dit eenvoudige protocol kan worden gebruikt om de rol van stimulerende bepalen (zoals beschreven), antagonisten, subeenheden, domeinen en specifieke residuen in ATPase activiteit 15,16,18,19. Deze test kan ook worden uitgebreid tot de activiteit van fosfatasen of andere enzymen die fosfaat vrijgeven tijdens katalyse meten. Bovendien kan deze werkwijze worden toegepast bij hoge doorvoer screening ATPase inhibitors 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES buffer | Fisher | BP310-500 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Fisher | BP41325 | |
| 96-well plates (clear, flat-bottom) | VWR | 82050-760 | |
| BIOMOL Green | Enzo Life Sciences | BML-AK111 | Preferred phosphate detection reagent. Caution: irritant. |
| Microplate reader | BioTek Synergy or comparable | ||
| Prism 5 | GraphPad Software |
References
- Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (7), 519-529 (2005).
- Baker, T. A., Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochimica et Biophysica Acta. 1823 (1), 15-28 (2012).
- Maxson, M. E., Grinstein, S. The vacuolar-type H+-ATPase at a glance - more than a proton pump. J Cell Sci. 127 (23), 4987-4993 (2014).
- Planet, P. J., Kachlany, S. C., DeSalle, R., Figurski, D. H. Phylogeny of genes for secretion NTPases: Identification of the widespread tadA subfamily and development of a diagnostic key for gene classification. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2503-2508 (2001).
- Robien, M. A., Krumm, B. E., Sandkvist, M., Hol, W. G. J. Crystal Structure of the Extracellular Protein Secretion NTPase EpsE of Vibrio cholerae. J Mol Biol. 333 (3), 657-674 (2003).
- Camberg, J. L., Sandkvist, M. Molecular analysis of the Vibrio cholerae type II secretion ATPase EpsE. J Bacteriol. 187 (1), 249-256 (2005).
- Sandkvist, M. Type II secretion and pathogenesis. Infect Immun. 69 (6), 3523-3535 (2001).
- Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Webb, M. R. Direct, Real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).
- Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: An improvement and evaluation. J Biochem Biophys Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
- Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. A microassay for ATPase. Anal Biochem. 169 (2), 312-318 (1988).
- Harder, K. W., Owen, P., Wong, L. K. H., Aebersold, R., Clark-Lewis, I., Jirik, F. R. Characterization and kinetic analysis of the intracellular domain of human protein tyrosine phosphatase β (HPTP β) using synthetic phosphopeptides. Biochem J. 298 (2), 395-401 (1994).
- Camberg, J. L., Johnson, T. L., Patrick, M., Abendroth, J., Hol, W. G., Sandkvist, M. Synergistic stimulation of EpsE ATP hydrolysis by EpsL and acidic phospholipids. EMBO J. 26 (1), 19-27 (2006).
- McLaughlin, S. H., Smith, H. W., Jackson, S. E. Stimulation of the weak ATPase activity of human Hsp90 by a client protein. J Mol Biol. 315 (4), 787-798 (2002).
- Shiue, S., Kao, K., Leu, W., Chen, L., Chan, N., Hu, N. XpsE oligomerization triggered by ATP binding, not hydrolysis, leads to its association with XpsL. EMBO J. 25 (7), 1426-1435 (2006).
- Ghosh, A., Hartung, S., van der Does, C., Tainer, J. A., Albers, S. V. Archaeal flagellar ATPase motor shows ATP-dependent hexameric assembly and activity stimulation by specific lipid binding. Biochem J. 437 (1), 43-52 (2011).
- Savvides, S. N., et al. VirB11 ATPases are dynamic hexameric assemblies: new insights into bacterial type IV secretion. EMBO J. 22 (9), 1969-1980 (2003).
- Sanghera, J., Li, R., Yan, J. Comparison of the luminescent ADP-Glo assay to a standard radiometric assay for measurement of protein kinase activity. Assay Drug Dev Techn. 7 (6), 615-622 (2009).
- Sherman, D. J., et al. Decoupling catalytic activity from biological function of the ATPase that powers lipopolysaccharide transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), 4982-4987 (2014).
- Zhang, X., et al. Altered cofactor regulation with disease-associated p97/VCP mutations. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (14), E1705-E1714 (2015).
- Rowlands, M. G., Newbatt, Y. M., Prodromou, C., Pearl, L. H., Workman, P., Aherne, W. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Anal Biochem. 327 (2), 176-183 (2004).
