We beschrijven een basisprotocol voor het kwantificeren van in vitro ATPase-activiteit. Dit protocol kan worden geoptimaliseerd op basis van het activiteitsniveau en de vereisten voor een bepaalde gezuiverde ATPase.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Adenosine-trifosfaat hydrolyserende enzymen, of ATPasen, spelen een cruciale rol in een breed scala van cellulaire functies. Deze dynamische eiwitten kunnen energie op te wekken voor het mechanisch werk, zoals eiwitten mensenhandel en degradatie, transport van opgeloste stoffen, en cellulaire bewegingen. De hier beschreven protocol is een eenvoudige test voor het meten van de in vitro activiteit van gezuiverde ATPasen voor functionele karakterisatie. Eiwitten hydrolyseren ATP in een reactie die resulteert in anorganisch fosfaat afgifte en de hoeveelheid fosfaat vrijgemaakt wordt vervolgens gekwantificeerd onder toepassing van een colorimetrische assay. Deze zeer flexibele protocol kan worden aangepast om ATPase-activiteit te meten in kinetische of eindpunt assays. Een representatief protocol is hier voorzien gebaseerd op de activiteit en vereisten van Epse, de AAA + ATPase betrokken type II Uitscheiding in de bacterie Vibrio cholerae. De hoeveelheid gezuiverde eiwit nodig te meten, lengte van de test en het tijdstip en het aantal sampling intervallen, buffer en zoutsamenstelling, temperatuur, co-factoren, stimulerende middelen (indien aanwezig), etc. kunnen afwijken van de hier beschreven en aldus sommige optimalisering nodig zijn. Dit protocol voorziet in een basiskader voor het karakteriseren ATPasen en kan snel worden uitgevoerd en gemakkelijk als nodig aangepast.
Inleiding
ATPases zijn integrale enzymen in veel processen in alle levenskoninkrijken. ATPasen fungeren als moleculaire motoren die de energie van ATP-hydrolyse gebruiken om diverse reacties aan te drijven, zoals eiwittransport, ontvouwen en assemblage; replicatie en transcriptie; cellulaire stofwisseling; spierbeweging; celbeweeglijkheid; en ionenpompwerking1-3. Sommige ATPasen zijn transmembraaneiwitten die betrokken zijn bij het transporteren van opgeloste stoffen door membranen, andere zijn cytoplasmatisch en kunnen geassocieerd zijn met een biologisch membraan zoals het plasmamembraan of die van organellen.
AAA+ ATPasen (ATPasen geass....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voer ATP hydrolysereactie met Purified Protein
- Bereid voorraden alle benodigde reagentia voor incubatie met gezuiverde eiwit.
- Bereid 5x HEPES / NaCl / glycerol (HNG) buffer die 100 mM HEPES pH 8,5, 65 mM NaCl en 5% glycerol (of ander testbuffer gebruik).
- Bereid 100 mM MgCl 2 (of ander metaal, indien ATPase metaal-afhankelijk) in water.
- Bereid verse 100 mM ATP in 200 mM Tris Base (denk pH niet verder aan te passen) met behulp van hoge zuiverheid ATP. Aliquot en opslaan van de ATP-voorraad bij -20 ° C niet langer dan een paar weken, als ATP af zal breken na verloop van tijd, en zich te onthouden van invriezen en ont....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De in vitro activiteit van de T2S ATPase épse kan worden gestimuleerd door copurification van Epse met het cytoplasmatische domein van EPSL (EPSE-cytoEpsL) en toevoeging van de zure fosfolipide cardiolipine 12. Het is ook mogelijk om de rol van specifieke resten in Epse ATP hydrolyse bepalen door de activiteit van wildtype (WT) voor variante vormen van het eiwit het gebruik van deze assay. Hier wordt het effect van het substitueren twee lysineresten in de EPSE-zink-bi.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit is een algemeen protocol voor het meten van ATPase-activiteit in vitro van gezuiverde eiwitten voor biochemische karakterisatie. Deze werkwijze is eenvoudig geoptimaliseerd; bijvoorbeeld het aanpassen van de hoeveelheid proteïne, buffer en zout samenstellingen, temperatuur, en het variëren van de lengte en assay intervallen (inclusief de bevordering totaal aantal intervallen) kan activiteit kwantificering verbeteren. In de handel verkrijgbare malachietgroen-gebaseerde reagentia zijn zeer gevoelig en kunnen .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen de financiering erkennen van een National Institutes of Health-subsidie RO1AI049294 (aan M. S.).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| HEPES buffer | Fisher | BP310-500 | |
| Natriumchloride | Fisher | BP358-212 | |
| Magnesiumchloride | Fisher | BP214-500 | |
| Adenosinetrifosfaat (ATP) | Fisher | BP41325 | |
| 96-wells platen (helder, platte bodem) | VWR | 82050-760 | |
| BIOMOL Green | Enzo Life Sciences | BML-AK111 | Voorkeursfosfaat detectie reagens. Let op: irriterend. |
| Microplate reader | BioTek Synergy of vergelijkbaar | ||
| Prism 5 | GraphPad Software |
Referenties
- Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (7), 519-529 (2005).
- Baker, T. A., Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochimica et Biophysica Acta. 1823 (1), 15....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
