Abstract
enzymes triphosphate-hydrolyser adénosine, ou ATPases, jouent un rôle essentiel dans un large éventail de fonctions cellulaires. Ces protéines dynamiques peuvent générer de l'énergie pour le travail mécanique, comme le trafic de protéines et la dégradation, le transport de soluté, et les mouvements cellulaires. Le protocole décrit ici est un dosage de base pour mesurer l'activité in vitro des ATPases purifiés pour la caractérisation fonctionnelle. Les protéines hydrolysent l'ATP dans une réaction qui entraîne la libération de phosphate inorganique, et la quantité de phosphate libéré est ensuite quantifié en utilisant un dosage colorimétrique. Ce protocole hautement adaptable peut être ajustée pour mesurer l'activité d'ATPase dans les essais cinétiques ou le terminal. Un protocole représentatif est fourni ici sur la base de l'activité et les exigences de Epse, l'AAA + ATPase impliqué dans Type II Sécrétion dans la bactérie Vibrio cholerae. La quantité de protéine purifiée nécessaire pour mesurer l'activité, la durée de l'essai et le moment et le nombre de saintervalles mpling, tampon et de la composition de sel, température, co-facteurs, les stimulants ( le cas échéant), etc. peuvent varier de ceux décrits ici, et donc une certaine optimisation peuvent être nécessaires. Ce protocole fournit un cadre de base pour ATPases caractérisant et peut être effectuée rapidement et facilement ajustée si nécessaire.
Protocol
1. Effectuer ATP hydrolyse Réaction avec de la protéine purifiée
- Préparer les stocks de tous les réactifs nécessaires pour incubation avec de la protéine purifiée.
- Préparer 5x HEPES / NaCl / glycérol (HNG) contenant 100 mM de HEPES pH 8,5, 65 mM de NaCl et 5% de glycerol (ou un autre tampon d'essai selon le cas).
- Préparer 100 mM MgCl 2 (ou autre métal, si ATPase est en métal-dépendant) dans l' eau.
- Préparer frais mM ATP 100 dans 200 Tris base mM (ne pas ajuster le pH plus loin) en utilisant la haute ATP de pureté. Aliquoter et stocker le stock ATP à -20 ° C pendant plus de quelques semaines, que l'ATP se décomposera au fil du temps, et de ne pas le gel et le dégel du stock ATP.
- Premix MgCl2 et ATP à un rapport 1: 1 juste avant la mise en place de la réaction d'hydrolyse de l' ATP.
- Préparer et étiqueter tubes de 1,5 ml pour prélever des échantillons à intervalles réguliers tout au long de la réaction. Préparer des tubes pour recueillir des échantillons au temps 0 et au moment 15, 30,45 et 60 minutes.
NOTE: Comme alternative, prélever des échantillons seulement au temps 0 et le point de terminaison.- Ajouter tampon 1x HNG 245 pi à chaque tube afin de diluer les échantillons prélevés dans les réactions d'hydrolyse de l'ATP 1:50.
- Préparer un bain de glace sèche et d'éthanol pour la congélation rapide des échantillons pour arrêter la réaction. Dans un seau à glace en caoutchouc ou un autre coffre-fort (non plastique) récipient, ajouter plusieurs morceaux de glace sèche et versez délicatement assez 70-100% d'éthanol pour couvrir la glace sèche.
- Diluer protéine purifiée dans un tampon HNG 1x, le cas échéant (typiquement 5-10 uM), et garder sur la glace.
- Mettre en place les réactions d'hydrolyse de l'ATP.
- Dans 0,5 ml tubes séparés pour chaque échantillon, ajouter les réactifs suivants (dans l' ordre): H 2 O (jusqu'à un volume final de 30 pi), 6 pi 5x HNG ou un autre tampon, 3 ul mM MgCl 100 2 -ATP mélange, et 0,25 à 5 protéine iM.
- Inclure une seule mémoire tampon condition de contrôle négatif dans lequel aucune protéine est ajoutée.
- Retirer 5 ul de la réaction au temps 0, diluer à 1:50 dans le tube de 1,5 ml préparé contenant 245 tampon HNG ul, et geler immédiatement l'échantillon dans le bain de glace / éthanol sec.
- Incuber les réactions à 37 ° C pour permettre l'hydrolyse de l'ATP de se produire pendant 1 heure. A chaque intervalle (15, 30, 45 et 60 min), enlever aliquotes de 5 ul de la réaction et ajouter à tubes d'échantillons marqués contenant un tampon HNG comme à l'étape 1.6.
- A la fin de la réaction d'hydrolyse de l'ATP, de déplacer les échantillons dilués dans un congélateur C -80 ° C pendant le stockage. Pour assurer que tous les échantillons sont complètement gelés, attendre au moins 10 minutes avant de poursuivre.
2. Les échantillons Incuber contenant Pi gratuit avec le réactif de détection
- décongeler les échantillons contenant de l'ATP dilué des aliquotes de la réaction d'hydrolyse à chaque point de temps (obtenues à partir des étapes 1.6 et 1.7) à la température ambiante.
- Mettre en place une plaque à 96 puits contenant des échantillons et des étalons de phosphate.
- Dans un ml tu 0,5soit, diluer le standard de phosphate (fourni avec le réactif de détection Pi) à partir de 800 uM à 40 uM en y ajoutant 5,5 ul du tampon HNG 800 pm à la norme 104,5 ul. Bien mélanger et ajouter 100 pi de cette 40 uM norme Pi bien A1 d'une plaque de 96 puits.
- Ajouter un tampon HNG 50 ul aux puits B1-H1 à 1: 1 des dilutions en série de la norme Pi.
- Retirer 50 ul de 40 uM Pi du puits A1 et ajouter au tampon d'essai de 50 pi dans le puits B1, mélanger et retirer 50 ul du puits B1 et ajouter ainsi C1, dilutions poursuivies par G1 bien. Jeter 50 pi de G1 bien après mélange pour assurer chaque puits a le même volume. Eh bien H1 ne doit contenir que tampon pour créer une norme Pi 40-0 uM.
NOTE: Si un facteur supplémentaire (tel qu'un inhibiteur) a été ajouté aux échantillons, créer une courbe standard contenant ce facteur pour contrôler les changements dans la libération de phosphate ou absorbance dans ces conditions. - Ajouter 50 ul de chaque sample en double exemplaire à la plaque. Ajouter des échantillons à partir du même point de temps dans les colonnes verticalement (échantillon de 1 heure 0 = A2, A3; échantillon 2 temps 0 = B2, B3) et différents points de temps horizontalement. Cela permet jusqu'à 8 échantillons et 5 points de temps par plaque.
- Utilisez une pipette stérile pour éliminer assez molybdate réactif malachite verte / Pi détection d'ajouter 100 pi à chacun des puits contenant des échantillons et des normes (réactif nécessaire (ml) = 0,1 x nombre d'échantillons et des normes) et ajouter à un plat pour pipetage facile à l'aide d'une pipette multicanaux. Ne pas verser le réactif de détection directement dans le plat, car la contamination Pi est susceptible de se produire.
- En utilisant une pipette multicanaux, ajouter 100 ul du réactif de détection Pi dans chaque puits et mélanger soigneusement pipetant un nombre constant de fois sans bulles d'introduction, de préférence dans l'ordre depuis les derniers points de temps pour les premiers points de temps.
- Incuber la plaque pendant 25 min à température ambiante, ou selon la maLes directions de structeur.
3. Résultats quantifient en utilisant un lecteur de microplaques
- Lire l'absorbance des échantillons à 650 nm en utilisant un lecteur de microplaques absorbance.
- Faire une courbe standard Pi. L'utilisation d'un logiciel graphique, graphique les valeurs d'absorbance pour les échantillons standards Pi par rapport à la concentration en vue de trouver une équation utilisée pour résoudre pour la quantité de phosphate dans chaque échantillon.
- Calculer l'activité de l'ATPase pour chaque échantillon en calibrant avec le standard de phosphate. Phosphate libéré = (DO 650 - Y interception) / pente.
- La moyenne du total Pi de doubles de chaque échantillon. Soustraire la lecture d'absorbance de la commande de mémoire tampon uniquement à partir de ce numéro. Multiplier par le facteur de dilution (50 dans notre exemple).
- Déterminer la Pi nmol libérée par la protéine pmol. Graphes ces valeurs pour chaque point de temps dans un essai cinétique devrait donner des crises linéaires d'au moins R = 0,99 (figure 1); Si not, le dosage peut être ajusté avec plus ou moins de protéines ou d'un temps plus ou moins incubation.
- Représenter les résultats comme nmol Pi / pmol protéine / min (figures 2, 3), ou sous forme de protéine nmol Pi / pg / min si on le souhaite.
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Representative Results
L'activité in vitro de la T2S ATPase Epse peut être stimulée par copurification de Epse avec le domaine cytoplasmique de EpsL (Epse-cytoEpsL) et ajout de la cardiolipine phospholipide acide 12. Il est également possible de déterminer le rôle de certains résidus Epse dans hydrolyse de l'ATP en comparant l'activité de type sauvage (WT) des variantes de formes de la protéine à l'aide de ce test. Ici, l'effet de substituer deux résidus de lysine dans le domaine de liaison au zinc Epse est mesurée en comparant l'activité ATPase de WT Epse-cytoEpsL purifié à la variante Epse K417AK419A-cytoEpsL. Sur la figure 1, la libération du phosphate se déroule de façon linéaire au cours d'un essai de cinétique de 1 h, une exigence pour une quantification précise de l' activité de l' ATPase cinétique. La figure 2 montre les données à partir des mêmes échantillons de protéine purifiés comme la figure 1 qui ont été testées trois fois en double exemplaire et quantifiés en terme dele taux moyen de la libération de phosphate. Ces données montrent que K417 et K419 semblent être importantes pour l'activité ATPase Épse. Toutefois, la comparaison des non stimulées (pas cardiolipine) le taux d'activité de l' ATPase (figure 3) montre que K417 et K419 ne contribuent pas à l' activité de base de Épse mais plutôt à la capacité de la protéine à être stimulée par la cardiolipine. Les lysines chargés positivement dans le domaine de liaison au zinc Epse peuvent interagir directement avec les phospholipides chargés négativement, contribuant ainsi à la stimulation de phospholipides médiation de l'activité Epse ATPase.
Figure 1: Phosphate est libéré Linéairement dans un Kinetic ATPase Assay Une heure cinétique cardiolipine stimulée par dosage ATPase comparant phosphate libération de 0,5 uM WT Epse-cytoEpsL à Epse K417AK419A-cytoEpsL avec de l' albumine de sérum bovin (BSA) dosé comme.un contrôle négatif. Données [quantité de phosphate libéré (axe y) en fonction du temps (axe x)] ont été représentés graphiquement et on les soumet à une analyse par régression linéaire. La pente représente le taux d'hydrolyse de l'ATP. Un graphique représentant les équations de régression linéaire pour les trois protéines est indiquée. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:.. Double Lysine Mutations dans Epse Zinc-Binding Domain plus Stimulé ATPase Activité Résultats du 1 h cinétique ATPase essai de cardiolipine stimulée avec les mêmes protéines et conditions que dans la Figure 1 Les analyses ont été effectuées à trois reprises en double technique et la taux d'hydrolyse de l'ATP a été calculé sous forme de phosphate de nmol généré par minute par uM pr otein en utilisant des équations de régression linéaire. Les résultats moyens avec erreur standard sont affichées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Double Lysine Mutations dans Epse Zinc-Binding Domain ne pas interférer avec non stimulé l' activité ATPase de nuit (16 h) endpoint non stimulées (pas cardiolipine) ATPase essai comparant l'activité de 5 uM WT Epse-cytoEpsL à Epse K417AK419A-cytoEpsL avec BSA. en tant que témoin négatif. Les analyses ont été effectuées à trois reprises en double technique et résultats moyens avec erreur standard est affichée. Le niveau de base de l'activité Epse ATPase non stimulées dosés sur une période de 16 heures est ~ 1000 fois l'activité de cardiolipine stimulée cinétique inférieure à 1 h.e.com/files/ftp_upload/54305/54305fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ceci est un protocole général pour la mesure de l'activité ATPase in vitro de protéines purifiées pour la caractérisation biochimique. Cette méthode est facilement optimisée; par exemple, en ajustant la quantité de protéines, un tampon et des compositions de sel, la température, et à faire varier la durée de l'essai et les intervalles (y compris l'augmentation du nombre total d'intervalles) peut améliorer l'activité de quantification. réactifs verts à base de malachite disponibles dans le commerce sont très sensibles et peuvent détecter de petites quantités de phosphate libre (~ 50 pmol dans 100 pi). En raison de la sensibilité de ce test, il est crucial d'utiliser vaisselle jetable en plastique, l'eau ultrapure, des tampons et des réactifs dépourvus de contamination phosphate. Après la purification des protéines, de la taille d'exclusion ou la chromatographie par échange d'ions est recommandé pour améliorer la pureté des protéines et éliminer les contaminants.
Pour des protéines présentant une faible activité ATPase in vitro, les stimulants peuvent être ajoutés à la réaction pour améliorer eactivité nzymatic. De nombreux facteurs qui stimulent l'activité ATPase ont été caractérisés. Par exemple, la cardiolipine et d' autres lipides membranaires, les protéines clientes des chaperonnes telles que Hsp90, et d' autres protéines impliquées dans des conformations d' appui ou dans des environnements particuliers dans lesquels fonctionnent les ATPases 13-15. Notre premier laboratoire caractérisée Epse en purifiant des monomères avec une faible activité ATPase par rapport à ATPases homologues 6. Nous avons découvert plus tard que lorsque Épse est copurifié avec le domaine cytoplasmique de EpsL, une protéine transmembranaire et le partenaire de liaison de Épse dans le système T2S, l' addition de phospholipides acides , tels que la cardiolipine dans le mélange réactionnel fortement accru l'activité d'ATPase de Épse 12. Cette probable imite les conditions des expériences Epse à la membrane cytoplasmique qui peut favoriser oligomérisation.
De nombreuses techniques ont été utilisées pour quantifier l' activité ATPase in vitro de protéines purifiées. γ- radioactifs
Le test décrit ici consiste en une seule étape de mesure de la libération de phosphate, est très sensible, et peut généralement être effectué dans quelques heures. Il est également possible de prépare un substrat vert contenant de la malachite pour éviter l' achat d' un kit à partir d' un fournisseur commercial 6,9. Une considération avant d'entreprendre cette analyse est que l'étape entre l'ajout du réactif de détection de phosphate et de prendre des mesures d'absorption est relativement sensible au temps et doit être comprise entre 20-30 min. Ce protocole de base peut être utilisé pour déterminer le rôle des stimulants (comme décrit), des antagonistes des sous - unités, des domaines et des résidus spécifiques dans ATPase 15,16,18,19. Ce dosage peut également être étendu pour mesurer l'activité des phosphatases ou d'autres enzymes qui libèrent du phosphate durant la catalyse. En outre, cette méthode peut être appliquée au criblage à haut débit d'inhibiteurs d' ATPase 20.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES buffer | Fisher | BP310-500 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Fisher | BP41325 | |
| 96-well plates (clear, flat-bottom) | VWR | 82050-760 | |
| BIOMOL Green | Enzo Life Sciences | BML-AK111 | Preferred phosphate detection reagent. Caution: irritant. |
| Microplate reader | BioTek Synergy or comparable | ||
| Prism 5 | GraphPad Software |
References
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