Abstract
Adenosintriphosphat-hydrolysierende Enzyme oder ATPase, eine entscheidende Rolle in einer Vielfalt von Zellfunktionen spielen. Diese dynamischen Proteine können Energie für die mechanische Arbeit, wie zum Beispiel Proteintransport und Abbau, Transport gelöster Stoffe und zelluläre Bewegungen erzeugen. Das hier beschriebene Protokoll ist ein einfaches Assay zur Messung der in vitro - Aktivität von gereinigtem ATPasen für die funktionelle Charakterisierung. Proteine hydrolysieren ATP in einer Reaktion, die in anorganischen Phosphatfreisetzung resultiert, und die Menge an Phosphat freigesetzt wird dann quantifiziert eines kolorimetrischen Assay. Das hochflexible Protokoll kann eingestellt werden ATPase-Aktivität in kinetische oder Endpunkt-Assays zu messen. Ein repräsentatives Protokoll ist vorgesehen , bezogen auf die Aktivität und Anforderungen EPSE umfasste die AAA + ATPase in Type II Secretion in dem Bakterium Vibrio cholerae. Die Menge an gereinigtem Protein benötigt Aktivität zu messen, die Länge des Tests und der Zeitpunkt und die Anzahl der sampling Intervallen, Puffer und Salzzusammensetzung, der Temperatur, Co-Faktoren, Stimulantien (falls vorhanden), usw. können hier von den beschriebenen abweichen, und somit kann eine gewisse Optimierung erforderlich sein. Dieses Protokoll stellt ein Grundgerüst für die Charakterisierung ATPasen und kann schnell und einfach eingestellt wie erforderlich durchgeführt werden.
Protocol
1. Führen Sie die ATP-Hydrolyse-Reaktion mit gereinigtem Protein
- Bereiten Sie Bestände an alle notwendigen Reagenzien für die Inkubation mit gereinigten Protein.
- Bereiten 5x HEPES / NaCl / Glycerin (HNG) -Puffer, enthaltend 100 mM HEPES pH 8,5, 65 mM NaCl und 5% Glycerin (oder anderen Assaypuffer wie geeignet).
- Bereiten 100 mM MgCl 2 (oder einem anderen Metall, wenn ATPase Metall abhängig ist) in Wasser.
- Bereiten Sie frische 100 mM ATP in 200 mM Tris Base (nicht einstellen pH-Wert weiter) hoher Reinheit ATP verwendet wird. Aliquotieren und lagern Sie das ATP-Lager bei -20 ° C nicht länger als ein paar Wochen, als ATP im Laufe der Zeit zusammenbrechen wird, und unterlassen das Einfrieren und die ATP-Lager Auftauen.
- Premix MgCl 2 und ATP in einem Verhältnis 1: 1 kurz vor der ATP - Hydrolyse - Reaktion einrichten.
- Bereiten Sie und beschriften 1,5-ml-Röhrchen für das Sammeln von Proben in regelmäßigen Abständen während der Reaktion. Bereiten Röhrchen zu sammeln Proben zum Zeitpunkt 0 und zum Zeitpunkt 15, 30,45 und 60 min.
HINWEIS: Als Alternative zu sammeln Proben nur zum Zeitpunkt 0 und dem Endpunkt.- In 245 ul 1x HNG Puffer in jedes Röhrchen, um Proben von den ATP-Hydrolysereaktionen 01.50 gesammelt zu verdünnen.
- Bereiten Sie ein Bad aus Trockeneis und Ethanol schnell Proben Einfrieren der Reaktion zu stoppen. In einem Gummi Eiskübel oder anderen sicheren (nicht Kunststoff) Behälter, fügen Sie mehrere Stücke von Trockeneis und sorgfältig genug 70-100% Ethanol gießen Sie das Trockeneis zu decken.
- Verdünnen gereinigtes Protein in 1x HNG-Puffer, gegebenenfalls (in der Regel 5 bis 10 & mgr; M), und halten Sie auf dem Eis.
- Stellen Sie die ATP-Hydrolyse-Reaktionen auf.
- In separaten 0,5 - ml - Röhrchen für jede Probe, die folgenden Reagenzien (in dieser Reihenfolge): H 2 O (bis zu einem Gesamtvolumen von 30 & mgr; l), 6 ul 5x HNG oder andere Puffer, 3 ul 100 mM MgCl 2 -ATP Mischung, und 0,25-5 uM Protein.
- Fügen Sie einen Puffer-nur negative Kontrolle Zustand, in dem kein Protein zugesetzt wird.
- Entfernen Sie 5 ul aus der Reaktion zum Zeitpunkt 0, verdünnte 01.50 in den vorbereiteten 1,5 ml Röhrchen mit 245 ul HNG-Puffer, und sofort gefrieren die Probe in der Trockeneis / Ethanol-Bad.
- Inkubieren Reaktionen bei 37 ° C ATP Hydrolyse zu ermöglichen, für 1 h auftritt. In jedem Intervall (15, 30, 45 und 60 min), Entfernen 5 ul Aliquots aus dem Reaktions und fügen Röhren markierte Probe enthält HNG-Puffer, wie in Schritt 1.6.
- Am Ende der ATP Hydrolysereaktion bewegen verdünnten Proben auf einen -80 ° C Gefrierschrank für die Lagerung. Um sicherzustellen, dass alle Proben vollständig gefroren sind, warten Sie mindestens 10 Minuten, bevor Sie fortfahren.
2. Inkubieren Proben mit freien Pi mit Nachweisreagenz
- Auftau verdünnten Proben Aliquots ATP Hydrolysereaktion zu jedem Zeitpunkt enthält, (erhalten aus den Schritten 1.6 und 1.7) bei Raumtemperatur.
- Richten Sie eine 96-Well-Platte mit Proben und Phosphat-Standards.
- In einer 0,5 ml tusein, verdünnen das Phosphat-Standard (mit Pi Nachweisreagenz versehen) von 800 um bis 40 um 5,5 ul der 800 um Standard zu 104,5 ul HNG Puffer hinzuzufügen. Gut mischen, und fügen Sie 100 ul dieser 40 uM Pi-Standard gut A1 einer 96-Well-Platte.
- In 50 ul HNG-Puffer in Vertiefungen B1-H1 für 1: 1 serielle Verdünnungen des Pi-Standard.
- Entfernen Sie 50 ul 40 uM Pi aus gut A1 und in den 50 & mgr; l Testpuffer in gut B1, mischen, und entfernen Sie 50 ul von gut B1 und in den gut C1, weiterhin Verdünnungen durch gut G1. Entsorgen 50 ul von gut G1 nach dem Mischen jeder Vertiefung, um sicherzustellen, das gleiche Volumen hat. Nun H1 sollte nur Puffer enthalten, um einen Pi-Standard 40-0 uM erstellen.
HINWEIS: Wenn ein zusätzlicher Faktor (wie ein Inhibitor) wurde zu den Proben hinzugefügt wurde, erstellen Sie eine Standardkurve, diesen Faktor für Veränderungen in der Phosphatfreisetzung oder Absorption unter diesen Bedingungen zu steuern, enthält. - In 50 ul jeder sample in zweifacher Ausfertigung an die Platte. In Proben aus dem gleichen Zeitpunkt in Spalten vertikal (Probe 1 Zeit 0 = A2, A3; Probe 2 Mal 0 = B2, B3) und verschiedenen Zeitpunkten in horizontaler Richtung. Auf diese Weise können bis zu 8 Proben und 5 Zeitpunkten pro Platte.
- Eine sterile Pipette genug Malachitgrün / Molybdat Pi Nachweisreagenz zu entfernen, um eine Schale zum einfachen Pipettieren mit 100 & mgr; l zu jeder der Vertiefungen, die Proben und Standards (Reagenz benötigt (ml) = 0,1 x Anzahl der Proben und Standards) und fügen mit einer Mehrkanalpipette. gießen Sie das Nachweisreagenz Sie nicht direkt in die Schale, wie Pi Verunreinigung auftreten dürfte.
- durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren eine konsistente Anzahl von Zeiten ohne Einführung von Blasen, vorzugsweise in der Reihenfolge von der letzten Zeitpunkten zu den ersten Zeitpunkten mit einer Mehrkanalpipette, 100 & mgr; l des Pi-Nachweisreagens in jede Vertiefung und mischen.
- Die Platte für 25 Minuten bei Raumtemperatur oder nach der mahersteller der Richtungen.
3. Quantifizieren Ergebnisse eines Mikroplatten-Reader verwenden
- Die Extinktion der Proben bei 650 nm eine Extinktion Mikrotiterplatten-Lesegerät verwendet wird.
- Machen Sie einen Pi-Standardkurve. Mit einer Grafiksoftware, Graph, der die Absorptionswerte für die Pi-Standardproben gegen die Konzentration, um eine Gleichung zu finden verwendet, um die Menge an Phosphat, die in jeder Probe zu lösen.
- Berechnen Sie die ATPase-Aktivität für jede Probe, indem sie mit dem Phosphat-Standard zu kalibrieren. Phosphat freigesetzt = (OD 650 - Y Intercept) / Steigung.
- Der Mittelwert der Gesamt Pi aus Duplikate jeder Probe. Subtrahieren Sie die Puffer nur Absorptionswert der Kontrolle von dieser Nummer. Multipliziert mit dem Verdünnungsfaktor (50 in unserem Beispiel).
- Bestimmen Sie die Pi nmol pro umol Protein freigesetzt. Graphische Darstellung dieser Werte für jeden Zeitpunkt in einem kinetischen Test sollte linear Anfällen von mindestens R = 0,99 (Abbildung 1) ergeben; wenn not, kann der Test mit mehr oder weniger Protein oder eine längere oder kürzere Inkubationszeit eingestellt werden.
- Stellen die Ergebnisse als nmol Pi / umol Protein / min (2, 3) oder als nmol Pi / & mgr; g Protein / min , falls gewünscht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die in vitro Aktivität der ATPase T2S EPSE kann durch gemeinsame Reinigung von EPSE mit der zytoplasmatischen Domäne von EPSL (EPSE-cytoEpsL) und Zugabe der sauren Phospholipid Cardiolipin 12 stimuliert werden. Es ist auch möglich, die Rolle bestimmter EPSE Rückstände in ATP-Hydrolyse zu bestimmen, unter Verwendung dieses Assay Aktivität von Wildtyp (WT) zu varianten Formen des Proteins verglichen. Hier wird die Wirkung der Substitution von zwei Lysinreste in der EPSE Zink-Bindungsdomäne wird durch einen Vergleich ATPase-Aktivität von gereinigtem WT EPSE-cytoEpsL zum EPSE K417AK419A-cytoEpsL Variante gemessen. In Figur 1 verläuft Phosphatfreisetzung linear über den Verlauf einer 1 Std kinetischer Assay eine Anforderung für eine genaue Quantifizierung von kinetischer ATPase Aktivität. 2 zeigt Daten aus der gleichen gereinigten Proteinproben wie in Abbildung 1, die dreimal in zweifacher Ausfertigung getestet wurden und quantifiziert bezüglichdie mittlere Geschwindigkeit der Phosphatfreisetzung. Diese Daten zeigen, dass die K417 und K419 erscheinen für Epse ATPase-Aktivität wichtig. Der Vergleich von unstimulierten (keine Cardiolipin) ATPase Aktivitätsraten (Figur 3) zeigt , dass K417 und K419 nicht EPSE die basale Aktivität beitragen , sondern auf die Fähigkeit des Proteins , das durch Cardiolipin stimuliert werden. Die positiv geladenen Lysine in der EPSE Zink-Bindungsdomäne kann mit den negativ geladenen Phospholipiden direkt interagieren, was zu dem Phospholipid-vermittelte Stimulation der EPSE ATPase-Aktivität beiträgt.
Abbildung 1: Phosphat wird freigegeben linear in einer Kinetic ATPase Assay Eine Stunde kinetische Cardiolipin-stimulierte ATPase - Assay verglichen Phosphatfreisetzung von 0,5 uM WT Epse-cytoEpsL zu Epse K417AK419A-cytoEpsL mit Rinderserumalbumin (BSA) getestet , wie.eine negative Kontrolle. Daten [Menge an freigesetztem Phosphat (y-Achse) gegen die Zeit (x-Achse)] wurden aufgetragen, und auf der linearen Regressionsanalyse unterzogen. Die Steigung stellt die Rate der ATP-Hydrolyse. Eine repräsentative Graph mit linearen Regressionsgleichungen für die drei Proteine gezeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Fig . 2:. Doppel Lysine Mutations in EPSE Zink-bindende Domäne stimulierte ATPase - Aktivität reduzieren Ergebnisse der 1 hr kinetische Cardiolipin-stimulierte ATPase - Assay mit denselben Proteinen und Bedingungen wie in Abbildung 1 Die Tests wurden drei getrennte Male in technischen zweifach durchgeführt , und die Rate der ATP-Hydrolyse wurde als nmol Phosphat pro Minute erzeugt, berechnet pro uM pr otein lineare Regressionsgleichungen. Die mittleren Ergebnisse mit Standardfehler angezeigt werden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Doppel Lysine Mutationen in Epse Zink-Bindungsdomäne nicht stören Nichtstimulierte ATPase Aktivität über Nacht (16 h) Endpunkt nicht stimulierte (kein Cardiolipin) ATPase Assay , um die Aktivität von 5 & mgr; M WT Epse-cytoEpsL zu Epse K417AK419A-cytoEpsL mit BSA zu vergleichen. als negative Kontrolle. Die Tests wurden durchgeführt, drei getrennte Male in technischen Duplikat und mittleren Ergebnisse mit Standardfehler dargestellt. Das Grundniveau der unstimulierten Epse ATPase-Aktivität über einen Zeitraum 16 Stunden getestet ist ~ 1000-fach niedriger als 1 Stunde kinetische Cardiolipin-stimulierte Aktivität.e.com/files/ftp_upload/54305/54305fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dies ist ein allgemeines Protokoll für die in vitro ATPase Aktivität von gereinigten Proteinen für die biochemische Charakterisierung zu messen. Dieses Verfahren ist leicht optimiert; beispielsweise die Menge an Protein, Puffer und Salzzusammensetzungen Einstellen der Temperatur und der Variation der Testlänge und Intervalle (einschließlich der Gesamtzahl der Intervalle Erhöhung) können Aktivitäts Quantifizierung verbessern. Im Handel erhältliche Malachitgrün-basierenden Reagenzien sind sehr empfindlich und können geringe Mengen an freiem Phosphat (~ 50 pmol in 100 ul) zu erkennen. Wegen dieser Empfindlichkeit des Assays ist es entscheidend, Einweg-Kunststoff-Geschirr, Reinstwasser, Puffer und Reagenzien zu verwenden, ohne Phosphat zu kontaminieren. Nach der Reinigung von Proteinen, Grßenausschluß oder Ionenaustauschchromatographie wird empfohlen Proteinreinheit zu verbessern und Verunreinigungen zu entfernen.
Für Proteine schwach in vitro ATPase - Aktivität anzeigt, Stimulantien können der Reaktion zugesetzt werden , e zu verbessernnzymatic Aktivität. Viele Faktoren, die ATPase-Aktivität stimulieren, charakterisiert. Zum Beispiel, Cardiolipin und andere Membranlipide, Client - Proteine von Chaperonen wie Hsp90 und anderen beteiligten Proteine bei der Unterstützung von bestimmten Konformationen oder Umgebungen , in denen ATPasen funktionieren 13-15. Unser Labor charakterisiert erste Epse durch Monomere mit schwachen ATPase - Aktivität im Vergleich zu homologe ATPase 6 zu reinigen. Wir entdeckten , daß , wenn später EPSE mit der zytoplasmatischen Domäne von EPSL, einem Transmembranprotein und der Bindungspartner EPSE im T2S System Zugabe von sauren Phospholipide wie Cardiolipin zu der Reaktionsmischung stark die ATPase - Aktivität von EPSE um 12 gemeinsam gereinigten wurde. Diese wahrscheinlich ahmt die Bedingungen Epse Erfahrungen bei der Cytoplasmamembran, die Oligomerisierung fördern kann.
Viele Techniken wurden verwendet , um in vitro ATPase Aktivität der gereinigten Proteine zu quantifizieren. Radioaktive γ-
Der Test hier beschriebene besteht aus nur einem Phosphatfreisetzung Meßschritt, ist sehr empfindlich und kann in der Regel innerhalb von wenigen Stunden durchgeführt werden. Es ist auch möglich, prepare ein Malachitgrün haltiges Substrat zu vermeiden , ein Kit von einem kommerziellen Anbieter 6,9 Kauf. Eine Überlegung, bevor Sie diesen Test Bezeichnung ist, dass der Schritt zwischen dem Hinzufügen der Phosphat-Nachweisreagenz und unter Extinktionsablesungen ist relativ zeitempfindlich und müssen zwischen 20-30 min. Dieses Basisprotokoll kann verwendet werden , um die Rolle von Stimulanzien zu bestimmen (wie beschrieben), Antagonisten, Untereinheiten, Domänen und spezifische Reste in ATPase Aktivität 15,16,18,19. Dieser Test kann auch die Aktivität von Phosphatasen und andere Enzyme zur Messung erweitert werden, die während der Katalyse Phosphat freizusetzen. Zusätzlich kann dieses Verfahren zum Hochdurchsatz - Screening für ATPase - Inhibitoren 20 angewendet werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES buffer | Fisher | BP310-500 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Fisher | BP41325 | |
| 96-well plates (clear, flat-bottom) | VWR | 82050-760 | |
| BIOMOL Green | Enzo Life Sciences | BML-AK111 | Preferred phosphate detection reagent. Caution: irritant. |
| Microplate reader | BioTek Synergy or comparable | ||
| Prism 5 | GraphPad Software |
References
- Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (7), 519-529 (2005).
- Baker, T. A., Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochimica et Biophysica Acta. 1823 (1), 15-28 (2012).
- Maxson, M. E., Grinstein, S. The vacuolar-type H+-ATPase at a glance - more than a proton pump. J Cell Sci. 127 (23), 4987-4993 (2014).
- Planet, P. J., Kachlany, S. C., DeSalle, R., Figurski, D. H. Phylogeny of genes for secretion NTPases: Identification of the widespread tadA subfamily and development of a diagnostic key for gene classification. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2503-2508 (2001).
- Robien, M. A., Krumm, B. E., Sandkvist, M., Hol, W. G. J. Crystal Structure of the Extracellular Protein Secretion NTPase EpsE of Vibrio cholerae. J Mol Biol. 333 (3), 657-674 (2003).
- Camberg, J. L., Sandkvist, M. Molecular analysis of the Vibrio cholerae type II secretion ATPase EpsE. J Bacteriol. 187 (1), 249-256 (2005).
- Sandkvist, M. Type II secretion and pathogenesis. Infect Immun. 69 (6), 3523-3535 (2001).
- Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Webb, M. R. Direct, Real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).
- Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: An improvement and evaluation. J Biochem Biophys Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
- Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. A microassay for ATPase. Anal Biochem. 169 (2), 312-318 (1988).
- Harder, K. W., Owen, P., Wong, L. K. H., Aebersold, R., Clark-Lewis, I., Jirik, F. R. Characterization and kinetic analysis of the intracellular domain of human protein tyrosine phosphatase β (HPTP β) using synthetic phosphopeptides. Biochem J. 298 (2), 395-401 (1994).
- Camberg, J. L., Johnson, T. L., Patrick, M., Abendroth, J., Hol, W. G., Sandkvist, M. Synergistic stimulation of EpsE ATP hydrolysis by EpsL and acidic phospholipids. EMBO J. 26 (1), 19-27 (2006).
- McLaughlin, S. H., Smith, H. W., Jackson, S. E. Stimulation of the weak ATPase activity of human Hsp90 by a client protein. J Mol Biol. 315 (4), 787-798 (2002).
- Shiue, S., Kao, K., Leu, W., Chen, L., Chan, N., Hu, N. XpsE oligomerization triggered by ATP binding, not hydrolysis, leads to its association with XpsL. EMBO J. 25 (7), 1426-1435 (2006).
- Ghosh, A., Hartung, S., van der Does, C., Tainer, J. A., Albers, S. V. Archaeal flagellar ATPase motor shows ATP-dependent hexameric assembly and activity stimulation by specific lipid binding. Biochem J. 437 (1), 43-52 (2011).
- Savvides, S. N., et al. VirB11 ATPases are dynamic hexameric assemblies: new insights into bacterial type IV secretion. EMBO J. 22 (9), 1969-1980 (2003).
- Sanghera, J., Li, R., Yan, J. Comparison of the luminescent ADP-Glo assay to a standard radiometric assay for measurement of protein kinase activity. Assay Drug Dev Techn. 7 (6), 615-622 (2009).
- Sherman, D. J., et al. Decoupling catalytic activity from biological function of the ATPase that powers lipopolysaccharide transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), 4982-4987 (2014).
- Zhang, X., et al. Altered cofactor regulation with disease-associated p97/VCP mutations. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (14), E1705-E1714 (2015).
- Rowlands, M. G., Newbatt, Y. M., Prodromou, C., Pearl, L. H., Workman, P., Aherne, W. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Anal Biochem. 327 (2), 176-183 (2004).
