Abstract
אנזימים אדנוזין hydrolyzing-אדנוזין, או ATPases, לשחק תפקיד קריטי במגוון תחומי פעילות התאים. חלבונים דינמיים אלה יכולים לייצר אנרגיה לעבודה מכאנית, כגון סחר חלבון ושפלה, תחבורה מומסת, ותנועות הסלולר. הפרוטוקול המתואר כאן הוא assay בסיסי למדידת הפעילות חוץ גופייה של ATPases המטוהר עבור אפיון פונקציונלי. חלבונים hydrolyze ATP בתגובה כי התוצאות שחרור פוספטים אנאורגניים, ואת כמות פוספט שוחררה לאחר מכן ונרשמת באמצעות assay colorimetric. ניתן להתאים מאוד זה פרוטוקול להתאמה כדי למדוד את פעילות ATPase מבחני קינטית או נקודת הסיום. פרוטוקול נציג מסופק כאן מבוסס על פעילות ודרישות של EpsE אא"א + ATPase מעורב Type II הפרשת ב החיידק Vibrio cholerae. כמות החלבון מטוהר צורך למדוד פעילות, האורך של assay ואת העיתוי מספר saבמרווחי mpling, חיץ רכב מלח, טמפרטורה, שיתוף גורמים, ממריצים (אם בכלל), וכו 'עשוי להשתנות מאלו המתוארים כאן, וכך כמה אופטימיזציה עשוי להיות נחוץ. פרוטוקול זה מספק מסגרת בסיסית ATPases המאפיינת וניתן לבצעו במהירות להתאים בקלות במידת הצורך.
Protocol
1. בצע תגובת ATP הידרוליזה עם חלבונים מטוהרים
- הכן מניות של כל ריאגנטים נדרשים דגירה עם חלבונים מטוהרים.
- הכן 5x HEPES / NaCl / גליצרול (HNG) מאגר המכיל 100 מ"מ HEPES pH 8.5, 65 mM NaCl, ו -5% גליצרול (או חיץ assay אחרים על פי הצורך).
- כן 100 מ"מ MgCl 2 (או מתכת אחרת, אם ATPase הוא תלוי מתכת) במים.
- הכן טרי 100 מ"מ ATP ב 200 מ"מ טריס הבסיס (לא להתאים את pH נוספת) באמצעות ATP טוהר גבוהה. Aliquot ולאחסן את המניה ATP ב -20 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מכמה שבועות, כמו ATP יהיה לשבור לאורך זמן, ולהימנע הקפאה להפשרה מניית ATP.
- Premix MgCl 2 ו- ATP ביחס של 1: 1 רק לפני הגדרת התגובה הידרוליזה ATP.
- להכין תווית 1.5 מ"ל צינורות לאיסוף דגימות במרווחים קבועים לאורך התגובה. הכן צינורות לאיסוף דגימות בשלב 0 ו בשלב 15, 30,45, ו 60 דקות.
הערה: כחלופה, לאסוף דגימות רק בזמן 0 ואת נקודת הסיום.- הוסף חוצץ HNG 1x 245 μl על צינור אחד כדי לדלל דגימות שנאספו התגובות הידרוליזה ATP 1:50.
- כן אמבט קרח אתנול יבשים להקפאת דגימות במהירות כדי לעצור את התגובה. בתוך דלי קרח גומי או בטוחים אחרים (לא פלסטיק) מיכל, להוסיף כמה חתיכות של קרח יבש ובזהירות לשפוך מספיק 70-100% אתנול לכיסוי קרח יבש.
- לדלל חלבונים מטוהרים במאגר HNG 1x, על פי הצורך (בדרך כלל 5-10 מיקרומטר), ולשמור על הקרח.
- הגדר את התגובות הידרוליזה ATP.
- ב 0.5 מ"ל צינורות נפרדים עבור כל דגימה, מוסיפים את ריאגנטים הבאים (לפי הסדר): H 2 O (עד לנפח סופי של 30 μl), 6 μl 5x HNG או חיץ אחר, 3 μl 100 מ"מ MgCl 2 תערובת -ATP, ו 0.25-5 חלבון מיקרומטר.
- כלול תנאי בקרה שלילי חיץ-היחידה שבה אין חלבון הוא הוסיף.
- הסר 5 μl מן התגובה בזמן 0, לדלל 01:50 בצינור 1.5 מ"ל מוכן המכיל חיץ 245 μl HNG, ומיד להקפיא את הדוגמה באמבט קרח / אתנול יבש.
- דגירת תגובות ב 37 ° C כדי לאפשר הידרוליזה ATP להתרחש במשך שעה 1. בכל מרווח (15, 30, 45, ו -60 דק '), להסיר 5 aliquots μl מן התגובה ולהוסיף דוגמיות שכותרתו המכיל HNG חיץ כמו בשלב 1.6.
- בסוף תגובת הידרוליזה ATP, להעביר בדילול דגימות במקפיא -80 מעלות צלזיוס לאחסון. כדי להבטיח את כל דגימות קפואות לחלוטין, להמתין לפחות 10 דקות לפני שתמשיך.
2. דוגמאות דגירה המכילים Pi חינם עם איתור מגיב
- הפשרה בדילול דגימות המכילות aliquots תגובת הידרוליזה ATP בכל נקודת זמן (המתקבלות צעדים 1.6 ו 1.7) בטמפרטורת חדר.
- הגדרת צלחת 96-היטב המכילה דגימות וסטנדרטים פוספט.
- בתוך 0.5 מ"ל tuלהיות, לדלל את רמת פוספט (מסופק עם מגיב זיהוי Pi) מ 800 מיקרומטר עד 40 מיקרומטר על ידי הוספת 5.5 μl של למאגר HNG 800 מיקרומטר רגיל 104.5 μl. מערבבים היטב, ולהוסיף 100 μl של 40 מיקרומטר זה Pi סטנדרטי היטב A1 של צלחת 96-היטב.
- הוסף 50 μl HNG חיץ לבארות B1-H1 טוב 1: 1 דילולים סידוריים של תקן Pi.
- הסר 50 μl של 40 מיקרומטר Pi מבאר A1 ולהוסיף למאגר assay 50 μl ב B1 היטב, לערבב, ולהסיר 50 μl מבאר B1 ולהוסיף גם C1, דילולים ועד ל G1 היטב. מחק 50 μl מבאר G1 לאחר ערבוב כדי להבטיח היטב כל יש את אותו נפח. ובכן H1 צריך להכיל חיץ רק ליצור תקן Pi מן 40 עד 0 מיקרומטר.
הערה: אם גורם נוסף (כגון מעכבים) נוסף הדגימות, ליצור עקומת סטנדרט המכילה גורמים לשלוט על שינויים במהדורה פוספט או ספיג בתנאים אלה. - הוסף 50 μl של כל sample בשני עותקים לצלחת. להוסיף דוגמאות מאותה נקודת זמן בטורים אנכית (זמן מדגם 1 0 = A2, A3; מדגם 2 זמן 0 = B2, B3) ו בנקודות זמן שונות אופקית. זה מאפשר עד 8 דגימות ו -5 נקודות זמן לכל צלחת.
- השתמש pipet סטרילי להסיר מספיק מלכיט מגיב זיהוי Pi ירוק / molybdate להוסיף 100 μl לכל אחד בארות המכיל דגימות ותקנים (מגיב הצורך (מ"ל) = 0.1 x מספר דוגמאות וסטנדרטים) ולהוסיף לצלחת עבור pipetting קל באמצעות pipet הרב ערוצית. אין לשפוך מגיב זיהוי ישירות לתוך התבשיל, כמו זיהום Pi צפוי להתרחש.
- שימוש pipet רב ערוצית, להוסיף 100 μl של מגיב זיהוי Pi היטב כל ומערבבים ידי pipetting למעלה בזהירות למטה מספר עקבי של פעמים ללא בועות מציגות, רצוי בסדר עדיפות מהנקודות בפעם האחרונות לנקודות לראשונה.
- דגירה הצלחת במשך 25 דקות בטמפרטורת החדר, או על פי maכיוונים של nufacturer.
3. תוצאות לכמת באמצעות קורא microplate
- קראו את הספיגה של הדגימות ב 650 ננומטר באמצעות קורא microplate ספיג.
- הפוך עקומת סטנדרט Pi. באמצעות תוכנת גרפים, גרף את הערכים הספיגים עבור דגימות תקן Pi לעומת ריכוז כדי למצוא משוואה להשתמש כדי לפתור את כמות הפוספט מדגם זה.
- חשב את פעילות ATPase עבור כל דגימה על ידי כיול עם תקן פוספט. פוספט שוחרר = (OD 650 - ליירט Y) / המדרון.
- ממוצע לצרכן הכולל כפילויות של כל דגימה. הפחת את הקריאה הספיגה של שליטת החיץ בלבד ממספר זה. הכפל זאת על ידי גורם לדילול (50 בדוגמה שלנו).
- קבע את Pi nmol שוחרר לכל חלבון μmol. Graphing ערכים אלה עבור כל נקודת זמן ב assay הקינטית אמור להניב מתאים ליניארי של לפחות R = 0.99 (איור 1); אם not, assay יכול להיות מותאם עם יותר או פחות חלבון או זמן דגירה ארוך או קצר.
- מייצגים את התוצאות כפי nmol Pi / μmol חלבון / min (איורים 2, 3), או כפי nmol Pi / מיקרוגרם חלבון / min אם תרצה בכך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פעילות חוץ גופית של EpsE T2S ATPase יכול להיות מגורה על ידי copurification של EpsE עם תחום cytoplasmic של EpsL (EpsE-cytoEpsL) ותוספת של cardiolipin פוספוליפידים חומצי 12. כמו כן ניתן לקבוע את התפקיד של שאריות EpsE מסוימות הידרוליזה ATP על ידי השוואת פעילות של סוג בר (WT) כדי הגירסות שונות של החלבון באמצעות assay. הנה, את ההשפעה של החלפת שתי שאריות ליזין בתחום אבץ מחייב EpsE נמדדת על ידי השוואת פעילות ATPase של מטוהרים WT EpsE-cytoEpsL החלופה K417AK419A-cytoEpsL EpsE. באיור 1, שחרור פוספט ממשיך באופן ליניארי במהלך של assay הקינטית 1 hr, דרישת כימות מדויקת של פעילות ATPase קינטית. איור 2 מציג נתונים מאותו דגימות החלבון מטוהרות כמו איור 1 כי היו assayed שלוש פעמים כפולות ונרשמות במונחים שלשיעור ממוצע של שחרור פוספט. נתונים אלה מראים כי K417 ו K419 להיראות חשוב לפעילות EpsE ATPase. עם זאת, השוואה של unstimulated (לא cardiolipin) מחירים פעילות ATPase (איור 3) מראה כי K417 ו K419 לא תרמו לפעילות הבסיס של EpsE אלא ליכולת של החלבון להיות מגורה על ידי cardiolipin. Lysines בעלי מטען חשמלי חיובי בתחום אבץ מחייב EpsE יכול לתקשר ישירות עם פוספוליפידים טעונים שלילית, ובכך לתרום את הגירוי בתיווך פוספוליפידים הפעילות EpsE ATPase.
איור 1: פוספט הוא פורסם באופן ליניארי ב assay קינטי ATPase שעה אחת הקינטית מגורה cardiolipin assay ATPase השוואת שחרור פוספט של 0.5 מיקרומטר WT EpsE-cytoEpsL כדי EpsE K417AK419A-cytoEpsL עם אלבומין בסרום שור (BSA) assayed כפי.כביקורת שלילית. נתונים [כמות פוספט שוחרר (ציר y) לעומת הזמן (ציר x)] היו זממו ו נתון ניתוח רגרסיה ליניארית. השיפוע מייצג את שיעור הידרוליזה ATP. גרף נציג עם משוואות רגרסיה ליניארית במשך שלושת החלבונים מוצג. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:.. Double ליזין מוטציות EpsE אבץ-Binding Domain להפחית מאולצת ATPase פעילות תוצאות של assay ATPase הקינטית 1 hr מגורה cardiolipin עם אותו החלבונים ותנאים כמו באיור 1 מבחנים בוצעו שלוש פעמים נפרדות בשני עותקים טכניים שיעור הידרוליזה ATP חושב כמו פוספט nmol שנוצר לדקה לכל מיקרומטר pr otein באמצעות משוואות רגרסיה ליניארית. התוצאות הממוצעות עם סטיית התקן מוצגות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: Double ליזין מוטציות EpsE האבץ-Binding Domain אינו מפריע unstimulated ATPase פעילות הלילה (16 שעות) נקודת סיום unstimulated (לא cardiolipin) assay ATPase השוואת הפעילות של 5 מיקרומטר WT EpsE-cytoEpsL כדי EpsE K417AK419A-cytoEpsL עם BSA. כביקורת שלילית. מבחנים בוצעו שלוש פעמים נפרדות בשני עותקים טכניים ותוצאות ממוצעות עם סטיית התקן מוצגות. רמת הבסיס של פעילות unstimulated EpsE ATPase assayed על פני תקופה של 16 שעות הוא ~ 1,000 פי הנמוך מ -1 hr הקינטית פעילות מגורה cardiolipin.e.com/files/ftp_upload/54305/54305fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זהו פרוטוקול כללי למדידת בפעילות ATPase במבחנה של חלבונים מטוהרים לאפיון ביוכימיים. שיטה זו מותאמת במיוחד בקלות; למשל, התאמת כמות חלבון, חיץ ויצירות מלח, טמפרטורה, וגיוון האורך ומרווחי assay (כולל הגדלת המספר הכולל של מרווחים) יכול לשפר quantitation פעילות. זמין מסחרי ריאגנטים ירוק מבוססת מלכיט רגיש מאוד, והוא יכול לזהות כמויות קטנות של פוספט חינם (~ 50 pmol ב 100 μl). בשל הרגישות של assay זה, חשוב להשתמש כלי פלסטיק חד פעמיים, מי ultrapure, מאגרים, ריאגנטים נטולי זיהום פוספט. לאחר חלבונים מטהרים, הדרת גודל או כרומטוגרפיה חילוף יונים מומלצת לשפר טוהר חלבון ולהסיר מזהמים.
עבור חלבונים המוצגים חלשים בפעילות ATPase במבחנה, ממריצים ניתן להוסיף התגובה כדי לשפר דוארפעילות nzymatic. גורמים רבים המעודדים פעילות ATPase מתאפיינים. לדוגמה, cardiolipin ושומנים קרום אחרים, חלבוני הלקוח של מלווים כגון Hsp90, וחלבונים אחרים המעורבים בתמיכה תצורות או בסביבות מסוימות שבהן ATPases לתפקד 13-15. המעבדה שלנו ראשונה מאופיינת EpsE ידי טיהורם מונומרים עם פעילות ATPase חלשה לעומת ATPases ההומולוגי 6. אנו מאוחר יותר גילינו שכאשר EpsE היה copurified עם תחום cytoplasmic של EpsL, חלבון הטרנסממברני ושותף עקדת EpsE במערכת T2S, תוספת של פוספוליפידים חומציים כגון cardiolipin לתערובת התגובה הגדילה את פעילות ATPase מאוד של EpsE 12. מחק סביר זה התנאים חוויות EpsE על הממברנה cytoplasmic שעשויה לקדם oligomerization.
שימשו טכניקות רבות לכמת פעילות במבחנה ATPase של חלבונים מטוהרים. γ- רדיואקטיביים
Assay המתואר כאן מורכב צעד מדידת שחרור פוספט אחד בלבד, הוא רגיש מאוד, ובדרך כלל ניתן לבצע תוך מספר שעות. כמו כן ניתן prepaמחדש מצע ירוק המכיל מלכיט להימנע רכישת ערכה מרוכל מסחרי 6,9. שיקול אחד לפני ביצוע assay זה הינו שהצעד בין הוספת מגיב איתור פוספט ולקיחת קריאות ספיגת הוא יחסית זמן רגיש חייב להיות בין 20-30 דקות. פרוטוקול בסיסי זה יכול לשמש כדי לקבוע את התפקיד של חומרים ממריצים (כמתואר), יריבים, יחידות משנה, תחומים, ושאריות ספציפיות בפעילות ATPase 15,16,18,19. assay זה יכול להתארך גם למדוד את הפעילות של phosphatases או אנזימים אחרים המשחררים פוספט במהלך קטליזה. בנוסף, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על הקרנת תפוקה גבוהה עבור מעכבי ATPase 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES buffer | Fisher | BP310-500 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Fisher | BP41325 | |
| 96-well plates (clear, flat-bottom) | VWR | 82050-760 | |
| BIOMOL Green | Enzo Life Sciences | BML-AK111 | Preferred phosphate detection reagent. Caution: irritant. |
| Microplate reader | BioTek Synergy or comparable | ||
| Prism 5 | GraphPad Software |
References
- Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (7), 519-529 (2005).
- Baker, T. A., Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochimica et Biophysica Acta. 1823 (1), 15-28 (2012).
- Maxson, M. E., Grinstein, S. The vacuolar-type H+-ATPase at a glance - more than a proton pump. J Cell Sci. 127 (23), 4987-4993 (2014).
- Planet, P. J., Kachlany, S. C., DeSalle, R., Figurski, D. H. Phylogeny of genes for secretion NTPases: Identification of the widespread tadA subfamily and development of a diagnostic key for gene classification. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2503-2508 (2001).
- Robien, M. A., Krumm, B. E., Sandkvist, M., Hol, W. G. J. Crystal Structure of the Extracellular Protein Secretion NTPase EpsE of Vibrio cholerae. J Mol Biol. 333 (3), 657-674 (2003).
- Camberg, J. L., Sandkvist, M. Molecular analysis of the Vibrio cholerae type II secretion ATPase EpsE. J Bacteriol. 187 (1), 249-256 (2005).
- Sandkvist, M. Type II secretion and pathogenesis. Infect Immun. 69 (6), 3523-3535 (2001).
- Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Webb, M. R. Direct, Real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).
- Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: An improvement and evaluation. J Biochem Biophys Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
- Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. A microassay for ATPase. Anal Biochem. 169 (2), 312-318 (1988).
- Harder, K. W., Owen, P., Wong, L. K. H., Aebersold, R., Clark-Lewis, I., Jirik, F. R. Characterization and kinetic analysis of the intracellular domain of human protein tyrosine phosphatase β (HPTP β) using synthetic phosphopeptides. Biochem J. 298 (2), 395-401 (1994).
- Camberg, J. L., Johnson, T. L., Patrick, M., Abendroth, J., Hol, W. G., Sandkvist, M. Synergistic stimulation of EpsE ATP hydrolysis by EpsL and acidic phospholipids. EMBO J. 26 (1), 19-27 (2006).
- McLaughlin, S. H., Smith, H. W., Jackson, S. E. Stimulation of the weak ATPase activity of human Hsp90 by a client protein. J Mol Biol. 315 (4), 787-798 (2002).
- Shiue, S., Kao, K., Leu, W., Chen, L., Chan, N., Hu, N. XpsE oligomerization triggered by ATP binding, not hydrolysis, leads to its association with XpsL. EMBO J. 25 (7), 1426-1435 (2006).
- Ghosh, A., Hartung, S., van der Does, C., Tainer, J. A., Albers, S. V. Archaeal flagellar ATPase motor shows ATP-dependent hexameric assembly and activity stimulation by specific lipid binding. Biochem J. 437 (1), 43-52 (2011).
- Savvides, S. N., et al. VirB11 ATPases are dynamic hexameric assemblies: new insights into bacterial type IV secretion. EMBO J. 22 (9), 1969-1980 (2003).
- Sanghera, J., Li, R., Yan, J. Comparison of the luminescent ADP-Glo assay to a standard radiometric assay for measurement of protein kinase activity. Assay Drug Dev Techn. 7 (6), 615-622 (2009).
- Sherman, D. J., et al. Decoupling catalytic activity from biological function of the ATPase that powers lipopolysaccharide transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), 4982-4987 (2014).
- Zhang, X., et al. Altered cofactor regulation with disease-associated p97/VCP mutations. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (14), E1705-E1714 (2015).
- Rowlands, M. G., Newbatt, Y. M., Prodromou, C., Pearl, L. H., Workman, P., Aherne, W. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Anal Biochem. 327 (2), 176-183 (2004).
