Abstract
Adenosine Triphosphate-hydrolyzing एंजाइमों, या ATPases, सेलुलर कार्यों की एक विविध सरणी में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। ये गतिशील प्रोटीन ऐसे प्रोटीन की तस्करी और गिरावट, घुला हुआ पदार्थ परिवहन, और सेलुलर आंदोलनों के रूप में यांत्रिक काम करते हैं, के लिए ऊर्जा उत्पन्न कर सकते हैं। यहां वर्णित प्रोटोकॉल कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए शुद्ध ATPases की इन विट्रो गतिविधि को मापने के लिए एक बुनियादी परख है। प्रोटीन एक प्रतिक्रिया है कि अकार्बनिक फॉस्फेट रिलीज में यह परिणाम में एटीपी hydrolyze, और फास्फेट की मात्रा को मुक्त कराया तो एक वर्णमिति परख का उपयोग quantitated है। यह अत्यधिक अनुकूलनीय प्रोटोकॉल गतिज या समापन बिंदु assays में ATPase गतिविधि को मापने के लिए समायोजित किया जा सकता है। एक प्रतिनिधि प्रोटोकॉल गतिविधि और Epse की आवश्यकताओं के आधार पर यहां प्रदान की जाती है, एएए + ATPase प्रकार द्वितीय स्राव जीवाणु विब्रियो कोलरा में शामिल किया गया। शुद्ध प्रोटीन की मात्रा गतिविधि को मापने की जरूरत है, परख की लंबाई और समय और दक्षिण अफ्रीका की संख्याmpling अंतराल, बफर और नमक संरचना, तापमान, सह कारकों, उत्तेजक (अगर कोई है), आदि यहाँ वर्णित उन लोगों से भिन्न हो सकते हैं, और इस तरह कुछ अनुकूलन आवश्यक हो सकता है। इस प्रोटोकॉल निस्र्पक ATPases के लिए एक बुनियादी ढांचा प्रदान करता है और जल्दी से किया जा सकता है और आसानी से आवश्यक के रूप में समायोजित।
Protocol
1. शुद्ध प्रोटीन के साथ एटीपी हाइड्रोलिसिस प्रतिक्रिया प्रदर्शन
- शुद्ध प्रोटीन के साथ ऊष्मायन के लिए सभी आवश्यक अभिकर्मकों का स्टॉक तैयार है।
- 5x HEPES / NaCl / ग्लिसरॉल (HNG) 100 मिमी HEPES पीएच 8.5, 65 मिमी NaCl, और 5% ग्लिसरॉल (या अन्य परख बफर के रूप में उपयुक्त) युक्त बफर तैयार करें।
- (या अन्य धातु यदि ATPase धातु पर निर्भर है) 100 मिमी 2 MgCl तैयार पानी में।
- उच्च शुद्धता एटीपी का उपयोग कर (आगे पीएच को समायोजित नहीं है) 200 मिमी Tris बेस में ताजा 100 मिमी एटीपी तैयार करें। अशेष और कुछ सप्ताह से अधिक समय के लिए कोई -20 डिग्री सेल्सियस पर एटीपी शेयर की दुकान, के रूप में एटीपी समय के साथ टूट जाएगा, और ठंड और एटीपी शेयर विगलन से बचना चाहिए।
- Premix 2 MgCl और एटीपी एक 1: 1 के अनुपात सिर्फ एटीपी हाइड्रोलिसिस प्रतिक्रिया स्थापित करने से पहले।
- तैयार है और प्रतिक्रिया के दौरान नियमित अंतराल पर नमूने एकत्र करने के लिए 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों लेबल। 0 समय और समय 15, 30 पर नमूने एकत्र करने के लिए ट्यूबों तैयार,45, और 60 मिनट।
नोट: एक विकल्प के रूप में, केवल समय 0 और समापन बिंदु पर नमूने इकट्ठा।- आदेश एटीपी हाइड्रोलिसिस प्रतिक्रियाओं 01:50 से एकत्र नमूनों को कमजोर करने के लिए प्रत्येक ट्यूब के लिए 245 μl 1x HNG बफर जोड़ें।
- जल्दी ठंड के नमूने प्रतिक्रिया को रोकने के लिए सूखी बर्फ और इथेनॉल के एक स्नान तैयार करें। एक रबर बर्फ बाल्टी या अन्य सुरक्षित (गैर-प्लास्टिक) कंटेनर में, सूखी बर्फ के कई टुकड़े जोड़ने के लिए और ध्यान से सूखी बर्फ कवर पर्याप्त 70-100% इथेनॉल डालना।
- 1x HNG बफर में शुद्ध प्रोटीन पतला, उचित (आमतौर पर 5-10 माइक्रोन) के रूप में, और बर्फ पर रख।
- एटीपी हाइड्रोलिसिस प्रतिक्रियाओं सेट करें।
- प्रत्येक नमूना के लिए अलग से 0.5 मिलीलीटर ट्यूबों में, निम्न अभिकर्मकों जोड़ने (आदेश): एच 2 ओ, 6 μl 5x HNG या अन्य बफर, 3 μl 100 मिमी 2 MgCl -ATP मिश्रण (30 μl के अंतिम मात्रा तक) और 0.25-5 सुक्ष्ममापी प्रोटीन।
- एक बफर केवल नकारात्मक नियंत्रण शर्त है जिसमें कोई प्रोटीन जोड़ा जाता है को शामिल करें।
- 0 समय पर प्रतिक्रिया से 5 μl निकालें, तैयार 1.5 मिलीलीटर 245 μl HNG बफर युक्त ट्यूब 1:50 पतला, और तुरंत सूखी बर्फ / इथेनॉल स्नान में नमूना फ्रीज।
- सेते 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रियाओं एटीपी हाइड्रोलिसिस 1 घंटे के लिए घटित करने के लिए अनुमति देने के लिए। प्रत्येक अंतराल (15, 30, 45, और 60 मिनट) पर, प्रतिक्रिया से 5 μl aliquots हटाने और लेबल नमूना 1.6 चरण में के रूप में HNG बफर युक्त ट्यूबों में जोड़ें।
- एटीपी हाइड्रोलिसिस प्रतिक्रिया के अंत में, भंडारण के लिए एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर को पतला नमूने ले जाते हैं। सुनिश्चित करने के लिए सभी नमूनों को पूरी तरह से जमे हुए हैं, आगे बढ़ने से पहले कम से कम 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
2. सेते नमूने पता लगाने अभिकर्मक साथ नि: शुल्क गड़बड़ी युक्त
- पिघलना पतला हर समय बिंदु पर एटीपी हाइड्रोलिसिस प्रतिक्रिया aliquots युक्त नमूने कमरे के तापमान पर (कदम 1.6 और 1.7 से प्राप्त)।
- एक 96 अच्छी तरह से नमूने और फॉस्फेट मानकों युक्त थाली सेट करें।
- एक 0.5 मिलीलीटर टू मेंहो सकता है, 800 माइक्रोन के मानक 104.5 μl को HNG बफर के 5.5 μl जोड़कर फॉस्फेट मानक (गड़बड़ी का पता लगाने अभिकर्मक के साथ प्रदान की) 800 माइक्रोन के 40 माइक्रोन के लिए से पतला। अच्छी तरह मिक्स, और यह 40 माइक्रोन के गड़बड़ी मानक के 100 μl करने के लिए अच्छी तरह से एक 96 अच्छी तरह से थाली के A1 जोड़ें।
- 1 के लिए कुओं बी 1 एच 1 से 50 μl HNG बफर जोड़ें: गड़बड़ी मानक के 1 धारावाहिक dilutions।
- अच्छी तरह A1 से 40 माइक्रोन के गड़बड़ी के 50 μl निकालें और अच्छी तरह बी 1 में 50 μl परख बफर को जोड़ने, मिश्रण, और अच्छी तरह बी 1 से 50 μl हटाने और जारी रखने के dilutions अच्छी तरह G1 के माध्यम से अच्छी तरह से सी 1 में जोड़ें। प्रत्येक अच्छी तरह से एक ही मात्रा है कि यह सुनिश्चित करने के लिए मिश्रण के बाद अच्छी तरह से G1 से 50 μl त्यागें। खैर एच 1 40 0 से माइक्रोन के लिए एक अनुकरणीय मानक बनाने के लिए केवल बफर शामिल करना चाहिए।
नोट: एक अतिरिक्त कारक (जैसे एक अवरोध के रूप में) के नमूनों में जोड़ दिया गया है, उस कारक उन परिस्थितियों में फॉस्फेट रिहाई या absorbance में परिवर्तन के लिए नियंत्रित करने के लिए युक्त एक मानक वक्र पैदा करते हैं। - प्रत्येक samp के 50 μl जोड़ेथाली करने के लिए दो प्रतियों में ले। और अलग अलग समय बिंदुओं क्षैतिज; कॉलम में एक ही समय बिंदु खड़ी (नमूना 2 समय 0 = बी 2, बी 3 नमूना 1 समय 0 = ए 2, ए 3) से नमूने जोड़ें। यह अप करने के लिए 8 नमूने और प्लेट प्रति 5 समय बिंदुओं के लिए अनुमति देता है।
- पर्याप्त मैलाकाइट हरी / molybdate गड़बड़ी का पता लगाने अभिकर्मक दूर करने के लिए एक बाँझ pipet का उपयोग करें (अभिकर्मक की जरूरत (एमएल) = नमूने और मानकों के 0.1 एक्स संख्या) नमूने और मानकों युक्त कुओं में से प्रत्येक के लिए 100 μl जोड़ने के लिए और आसान pipetting के लिए एक डिश के लिए जोड़ एक मल्टीचैनल pipet का उपयोग। पता लगाने अभिकर्मक डिश में सीधे डालना मत करो, के रूप में गड़बड़ी संदूषण होने की संभावना है।
- एक मल्टीचैनल pipet का प्रयोग, गड़बड़ी का पता लगाने अभिकर्मक के 100 μl प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए शुरू करने के बुलबुले के बिना, पिछली बार अंक से पहली बार अंक में जोड़ने के लिए और बेहतर क्रम में ध्यान से ऊपर pipetting द्वारा और समय के अनुरूप एक नंबर नीचे मिश्रण।
- , या एमए के अनुसार कमरे के तापमान पर 25 मिनट के लिए थाली सेतेnufacturer के निर्देशों।
3. एक microplate रीडर का उपयोग quantitate परिणाम
- एक absorbance microplate रीडर का उपयोग कर 650 एनएम पर नमूने के absorbance पढ़ें।
- एक अनुकरणीय मानक वक्र बनाओ। एक रेखांकन सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, क्रम में प्रत्येक नमूने में फॉस्फेट की राशि के लिए हल करने के लिए इस्तेमाल एक समीकरण खोजने के लिए एकाग्रता बनाम गड़बड़ी मानक नमूनों के लिए absorbance के मूल्यों ग्राफ।
- फॉस्फेट मानक के साथ औजार से प्रत्येक नमूना के लिए ATPase गतिविधि की गणना। फास्फेट जारी किया = (आयुध डिपो 650 - वाई अवरोधन) / ढलान।
- प्रत्येक नमूने की डुप्लिकेट से कुल गड़बड़ी औसत। इस नंबर से बफर केवल नियंत्रण के absorbance पढ़ने घटाएँ। कमजोर पड़ने कारक द्वारा इस गुणा (हमारे उदाहरण में 50)।
- nmol गड़बड़ी μmol प्रोटीन प्रति जारी की निर्धारित करते हैं। एक काइनेटिक परख में हर समय बिंदु के लिए इन मूल्यों रेखांकन कम से कम आर = 0.99 (चित्रा 1) के रेखीय फिट बैठता उपज चाहिए; यदि nओटी, परख कम या ज्यादा प्रोटीन या एक लंबा या छोटा ऊष्मायन समय के साथ समायोजित किया जा सकता है।
- Nmol गड़बड़ी / μmol प्रोटीन / मिनट के रूप में परिणाम (आंकड़े 2, 3), या के रूप में nmol गड़बड़ी / माइक्रोग्राम प्रोटीन / मिनट अगर वांछित प्रतिनिधित्व करते हैं।
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Representative Results
T2S ATPase Epse की इन विट्रो गतिविधि EpsL (Epse-cytoEpsL) के cytoplasmic डोमेन और अम्लीय फॉस्फोलिपिड cardiolipin 12 के अलावा के साथ Epse के copurification द्वारा प्रेरित किया जा सकता है। यह भी इस परख का उपयोग प्रोटीन के संस्करण रूपों को जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) की गतिविधि की तुलना द्वारा एटीपी हाइड्रोलिसिस में विशेष Epse अवशेषों की भूमिका निर्धारित करने के लिए संभव है। इधर, Epse जस्ता बाध्यकारी डोमेन में दो लाइसिन अवशेषों प्रतिस्थापन के प्रभाव Epse K417AK419A-cytoEpsL संस्करण के लिए शुद्ध गुम्मट Epse-cytoEpsL की ATPase गतिविधि की तुलना द्वारा मापा जाता है। चित्रा 1 में, फॉस्फेट रिलीज एक 1 घंटा गतिज परख, गतिज ATPase गतिविधि की सटीक मात्रा का ठहराव के लिए एक आवश्यकता के पाठ्यक्रम पर रैखिक आय। कि दो प्रतियों में तीन बार यत्न किया और quantitated थे चित्रा 1 के रूप में एक ही शुद्ध प्रोटीन के नमूनों से 2 से पता चलता डेटा चित्रा के अनुसारफॉस्फेट रिहाई का मतलब दर। इन आंकड़ों से पता चलता है कि K417 और K419 Epse ATPase गतिविधि के लिए महत्वपूर्ण होने के लिए दिखाई देते हैं। हालांकि, unstimulated (कोई cardiolipin) ATPase गतिविधि की दरों की तुलना (चित्रा 3) से पता चलता है कि K417 और K419 Epse के बेसल गतिविधि के लिए बल्कि प्रोटीन की क्षमता cardiolipin द्वारा प्रेरित किया जा करने के लिए योगदान नहीं है। Epse जस्ता बाध्यकारी डोमेन में सकारात्मक आरोप लगाया lysines सीधे नकारात्मक आरोप लगाया फॉस्फोलिपिड के साथ बातचीत कर सकते हैं, इस प्रकार Epse ATPase गतिविधि के फॉस्फोलिपिड की मध्यस्थता उत्तेजना में योगदान दे।
चित्रा 1: फास्फेट एक काइनेटिक ATPase परख में रैखिक जारी है एक घंटे गतिज cardiolipin उत्तेजित ATPase परख गोजातीय सीरम albumin के साथ Epse K417AK419A-cytoEpsL 0.5 माइक्रोन के गुम्मट Epse-cytoEpsL की रिहाई फॉस्फेट की तुलना (बीएसए) के रूप में यत्न किया।एक नकारात्मक नियंत्रण। डाटा [जारी किया फॉस्फेट (शाफ़्ट) बनाम समय (एक्स अक्ष) की राशि] साजिश रची और रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण के अधीन थे। ढलान एटीपी हाइड्रोलिसिस की दर का प्रतिनिधित्व करता है। तीन प्रोटीन के लिए रेखीय प्रतिगमन समीकरणों के साथ एक प्रतिनिधि ग्राफ दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2:।। डबल लाइसिन उत्परिवर्तनों Epse जिंक बाध्यकारी डोमेन कम प्रेरित ATPase गतिविधि में चित्रा 1 के रूप में ही प्रोटीन और शर्तों के साथ 1 घंटा गतिज cardiolipin उत्तेजित ATPase परख के परिणाम Assays तकनीकी डुप्लिकेट और में तीन अलग-अलग कई बार प्रदर्शन किया गया एटीपी हाइड्रोलिसिस की दर माइक्रोन के जनसंपर्क प्रति प्रति मिनट उत्पन्न nmol फॉस्फेट के रूप में गणना की गई रेखीय प्रतिगमन समीकरण का उपयोग कर otein। मानक त्रुटि के साथ मतलब परिणाम प्रदर्शित कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: डबल लाइसिन उत्परिवर्तनों Epse जिंक बाध्यकारी डोमेन में unstimulated ATPase गतिविधि के साथ हस्तक्षेप नहीं करते रातोंरात (16 घंटा) समापन बिंदु unstimulated (कोई cardiolipin) ATPase परख बीएसए के साथ Epse K417AK419A-cytoEpsL करने के लिए 5 माइक्रोन के गुम्मट Epse-cytoEpsL की गतिविधि की तुलना। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में। Assays तकनीकी दो प्रतियों में तीन अलग-अलग कई बार प्रदर्शन किया गया और मानक त्रुटि के साथ मतलब परिणाम दिखाया गया है। unstimulated Epse ATPase गतिविधि एक 16 घंटा अवधि में यत्न के बेसल स्तर से कम 1 घंटा गतिज cardiolipin उत्तेजित गतिविधि ~ 1,000 गुना है।e.com/files/ftp_upload/54305/54305fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
यह जैव रासायनिक लक्षण वर्णन के लिए शुद्ध प्रोटीन की इन विट्रो ATPase गतिविधि को मापने के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल है। इस विधि को आसानी से अनुकूलित है; उदाहरण के लिए, प्रोटीन, बफर और नमक रचनाएं, तापमान, और परख लंबाई बदलती और अंतराल (अंतराल की कुल संख्या में वृद्धि सहित) की राशि का समायोजन गतिविधि quantitation सुधार कर सकते हैं। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मैलाकाइट हरे-आधारित अभिकर्मकों अत्यधिक संवेदनशील होते हैं, और मुक्त फॉस्फेट की थोड़ी मात्रा का पता लगाने कर सकते हैं (~ 100 μl में 50 pmol)। इस परख की संवेदनशीलता के कारण, यह डिस्पोजेबल प्लास्टिक के बर्तन, ultrapure पानी, buffers, और फॉस्फेट contaminating से रहित अभिकर्मकों का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। शुद्ध प्रोटीन के बाद, आकार अपवर्जन या आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी प्रोटीन पवित्रता में सुधार लाने और दूषित पदार्थों को दूर करने के लिए सिफारिश की है।
इन विट्रो ATPase गतिविधि में कमजोर प्रदर्शित प्रोटीन के लिए, उत्तेजक ई बढ़ाने के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए जोड़ा जा सकता हैnzymatic गतिविधि। कई कारक हैं जो ATPase गतिविधि को प्रोत्साहित विशेषता किया गया है। उदाहरण के लिए, cardiolipin और अन्य झिल्ली लिपिड के लिए, इस तरह के रूप में HSP90 chaperones, और अन्य विशेष रचना या वातावरण के समर्थन में शामिल प्रोटीन की ग्राहक प्रोटीन, जिसमें ATPases 13-15 कार्य करते हैं। हमारी प्रयोगशाला पहले मुताबिक़ ATPases 6 की तुलना में कमजोर ATPase गतिविधि के साथ monomers सफ़ाई से Epse होती है। हम बाद में पता चला है कि जब Epse EpsL के cytoplasmic डोमेन, एक transmembrane प्रोटीन और T2S प्रणाली में Epse के बंधन साथी के साथ copurified किया गया था, इस तरह की प्रतिक्रिया मिश्रण को cardiolipin के रूप में अम्लीय फॉस्फोलिपिड के अलावा बहुत Epse 12 के ATPase गतिविधि में वृद्धि हुई। यह संभावना mimics शर्तों cytoplasmic झिल्ली कि oligomerization को बढ़ावा देने के कर सकते हैं पर Epse अनुभव।
कई तकनीकों शुद्ध प्रोटीन की इन विट्रो ATPase गतिविधि यों इस्तेमाल किया गया है। रेडियोधर्मी γ-
परख यहाँ वर्णित है, केवल एक फॉस्फेट रिलीज माप कदम के होते अत्यधिक संवेदनशील है, और आम तौर पर कुछ घंटा के भीतर किया जा सकता है। यह prepa करने के लिए भी संभव हैएक मैलाकाइट हरी युक्त सब्सट्रेट फिर एक वाणिज्यिक विक्रेता 6.9 से एक किट की खरीद से बचने के लिए। इस परख शुरू करने से पहले एक विचार है कि फॉस्फेट पता लगाने अभिकर्मक जोड़ने और absorbance रीडिंग लेने के बीच कदम अपेक्षाकृत समय के प्रति संवेदनशील है और 20-30 मिनट के बीच होना चाहिए। यह बुनियादी प्रोटोकॉल (के रूप में वर्णित), विरोधी, सब यूनिटों, डोमेन, और विशिष्ट ATPase गतिविधि 15,16,18,19 में अवशेष उत्तेजक की भूमिका निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह परख भी फास्फेटेजों या अन्य एंजाइमों कि कटैलिसीस के दौरान फॉस्फेट रिलीज की गतिविधि को मापने के लिए बढ़ाया जा सकता है। साथ ही, इस विधि ATPase अवरोधकों 20 के लिए उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए लागू किया जा सकता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES buffer | Fisher | BP310-500 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Fisher | BP41325 | |
| 96-well plates (clear, flat-bottom) | VWR | 82050-760 | |
| BIOMOL Green | Enzo Life Sciences | BML-AK111 | Preferred phosphate detection reagent. Caution: irritant. |
| Microplate reader | BioTek Synergy or comparable | ||
| Prism 5 | GraphPad Software |
References
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