Abstract
Adenosina trifosfato enzimi-idrolisi, o ATPasi, svolgono un ruolo critico in una gamma diversificata di funzioni cellulari. Queste proteine dinamici in grado di generare energia per il lavoro meccanico, come il traffico di proteine e il degrado, trasporto dei soluti, e movimenti cellulari. Il protocollo qui descritto è un metodo semplice per misurare l'attività in vitro di ATPasi purificata per la caratterizzazione funzionale. Proteine idrolizzano ATP in una reazione che provoca il rilascio inorganica fosfato e la quantità di fosfato liberato viene poi quantizzati utilizzando un saggio colorimetrico. Questo protocollo altamente adattabile può essere regolata per misurare l'attività ATPasi in saggi cinetici o endpoint. Un protocollo rappresentativo è qui fornito in base all'attività e requisiti di EPSE, AAA + ATPasi coinvolta nella secrezione di tipo II nel batterio Vibrio cholerae. La quantità di proteina purificata necessaria per misurare l'attività, la lunghezza del test e la sincronizzazione e il numero di saintervalli mpling, buffer e la composizione del sale, temperatura, co-fattori, stimolanti (se presente), ecc possono variare da quelli qui descritti, e quindi un po 'di ottimizzazione può essere necessario. Questo protocollo fornisce un quadro di base per ATPasi caratterizzano e può essere eseguita rapidamente e facilmente regolato come necessario.
Protocol
1. Eseguire ATP idrolisi di reazione con proteina purificata
- Preparare scorte di tutti i reagenti necessari per l'incubazione con proteina purificata.
- Preparare tampone 5x HEPES / NaCl / glicerolo (HNG) contenente 100 mM HEPES pH 8,5, 65 mM NaCl, e il 5% glicerolo (o altro tampone a seconda dei casi).
- Preparare 100 mM MgCl 2 (o altro metallo, se ATPasi è in metallo-dipendente) in acqua.
- Preparare fresco 100 mM ATP a 200 mm Tris Base (non regolare il pH ulteriormente) con alta ATP purezza. Aliquota e memorizzare il titolo ATP a -20 ° C per non più di un paio di settimane, come l'ATP si rompe nel corso del tempo, e astenersi dal congelamento e scongelamento del titolo ATP.
- Premix MgCl 2 e ATP in un rapporto 1: 1 appena prima di impostare la reazione di idrolisi dell'ATP.
- Preparare ed etichettare provette da 1,5 ml per la raccolta di campioni a intervalli regolari durante la reazione. Preparare le provette per raccogliere campioni al tempo 0 e al tempo 15, 30,45, e 60 min.
NOTA: In alternativa, raccogliere campioni solo in fase 0 e il punto finale.- Aggiungere 245 microlitri di buffer 1x HNG ad ogni provetta in modo da diluire campioni raccolti dalle reazioni di idrolisi dell'ATP 1:50.
- Preparare un bagno di ghiaccio secco ed etanolo per il congelamento rapido campioni per arrestare la reazione. In un secchio di ghiaccio gomma o contenitore altra cassetta di sicurezza (non di plastica), aggiungere alcuni pezzi di ghiaccio secco e versare attentamente abbastanza 70-100% di etanolo per coprire il ghiaccio secco.
- Diluire proteina purificata in un tampone HNG 1x, a seconda dei casi (tipicamente 5-10 micron), e tenere in ghiaccio.
- Impostare le reazioni di idrolisi dell'ATP.
- In separati 0,5 ml provette per ogni campione, aggiungere le seguenti reagenti (in ordine): H 2 O (fino ad un volume finale di 30 microlitri), 6 microlitri 5x HNG o altro buffer, 3 microlitri 100 mM MgCl 2 -ATP miscela, e 0,25-5 proteine micron.
- Includere un buffer di sola condizione di controllo negativo in cui è stata aggiunta alcuna proteina.
- Rimuovere 5 ml dalla reazione al tempo 0, diluire 1:50 nella provetta da 1,5 ml preparato contenente 245 microlitri di buffer HNG, e congelare immediatamente il campione in condizioni di asciutto bagno di ghiaccio / etanolo.
- Incubare le reazioni a 37 ° C per consentire idrolisi dell'ATP a verificarsi per 1 ora. Ad ogni intervallo (15, 30, 45 e 60 min), rimuovere 5 aliquote microlitri dalla reazione e aggiungere al provettoni etichettati contenenti tampone HNG come al punto 1.6.
- Al termine della reazione di idrolisi dell'ATP, spostare campioni diluiti in un congelatore C -80 ° per la conservazione. Per garantire tutti i campioni sono completamente congelati, attendere almeno 10 minuti prima di procedere.
2. I campioni Incubare contenenti libero Pi con Detection Reagent
- Scongelare i campioni diluiti contenenti aliquote reazione di idrolisi dell'ATP in ogni momento (ottenuti da misure 1.6 e 1.7) a temperatura ambiente.
- Impostare una piastra a 96 pozzetti contenenti i campioni e gli standard di fosfati.
- In un ml tu 0,5essere, diluire lo standard di fosfato (fornito con il reagente di rilevamento Pi) da 800 micron a 40 micron con l'aggiunta di 5,5 ml di buffer HNG 800 micron standard per 104,5 ml. Mescolare bene e aggiungere 100 ml di questa 40 micron di serie Pi a ben A1 di una piastra a 96 pozzetti.
- Aggiungere tampone HNG 50 microlitri di pozzi B1-H1 per 1: 1 diluizioni seriali dello standard Pi.
- Rimuovere 50 ml di 40 mM Pi dal pozzetto A1 e aggiungere al tampone 50 microlitri nel pozzetto B1, mescolare, e rimuovere 50 ml da ben B1 e aggiungere al ben C1, diluizioni continui attraverso ben G1. Scartare 50 ml da ben G1 dopo la miscelazione per assicurare ogni pozzetto ha lo stesso volume. Ebbene H1 dovrebbe contenere solo buffer per creare uno standard Pi 40 a 0 pM.
NOTA: Se un fattore aggiuntivo (come un inibitore) è stato aggiunto ai campioni, creare una curva standard contenente quel fattore di controllo per i cambiamenti nel rilascio fosfato o assorbanza in queste condizioni. - Aggiungere 50 ml di ogni SAMPLe in duplice copia alla piastra. Aggiungere campioni dallo stesso punto temporale in colonne verticali (campione 1 ora 0 = A2, A3; campione 2 tempo 0 = B2, B3) e differenti tempi orizzontalmente. Questo permette fino a 8 campioni e 5 punti temporali per piastra.
- Utilizzare una pipetta sterile per rimuovere abbastanza verde malachite molibdato reagente di rilevamento / Pi aggiungere 100 ml a ciascuno dei pozzetti contenenti campioni e gli standard (reagente necessario (ml) = 0,1 x numero di campioni e gli standard) e aggiungere ad un piatto per una facile pipettaggio usando una pipetta multicanale. Non versare il reagente di rilevamento direttamente nel piatto, come la contaminazione Pi è probabile che si verifichi.
- Usando una pipetta multicanale, aggiungere 100 ml di reagente di rilevamento Pi in ogni pozzetto e mescolare accuratamente pipettando su e giù un consistente numero di volte senza bolle introduzione, preferibilmente nell'ordine da ultimi punti temporali ai primi punti temporali.
- Incubare la piastra per 25 min a temperatura ambiente, o secondo la maindicazioni nufacturer.
3. Risultati quantificare utilizzando un lettore di micropiastre
- Leggere l'assorbanza dei campioni a 650 nm con un lettore di micropiastre assorbanza.
- Effettuare una curva standard Pi. Utilizzando un software grafici, grafico i valori di assorbanza per i campioni standard Pi funzione della concentrazione al fine di trovare una equazione utilizzata per risolvere per la quantità di fosfato in ciascun campione.
- Calcolare l'ATPasi per ogni campione calibrando con lo standard di fosfato. Fosfato rilasciato = (OD 650 - Y intercetta) / pendio.
- Nella media del totale Pi da duplicati di ogni campione. Sottrarre lettura di assorbanza del controllo del buffer solo da questo numero. Moltiplicate questo per il fattore di diluizione (50 nel nostro esempio).
- Determinare il Pi nmol rilasciato per proteine micromol. Rappresentazione grafica questi valori per ogni punto temporale in un saggio cinetica dovrebbe produrre attacchi lineari di almeno R = 0,99 (figura 1); Se not, il dosaggio può essere regolato con più o meno proteina o un tempo di incubazione più lungo o più breve.
- Rappresentano i risultati come nmol Pi / mol proteina / min (figure 2, 3), o come nmol Pi / mg proteine / min se desiderato.
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Representative Results
L'attività in vitro del T2S ATPasi Epse può essere stimolato da copurification del Epse con il dominio citoplasmatico di EPSL (Epse-cytoEpsL) e l'aggiunta di acido cardiolipina fosfolipide 12. È anche possibile determinare il ruolo di particolari residui Epse a idrolisi confrontando l'attività di tipo selvatico (WT) per forme varianti della proteina utilizzando questo saggio. Qui, l'effetto di sostituire due residui di lisina nel dominio zinc-binding Epse viene misurata confrontando ATPasi attività di purificato WT EPSE-cytoEpsL alla variante EPSE K417AK419A-cytoEpsL. Nella figura 1, il rilascio di fosfato procede linearmente nel corso di un 1 ora dosaggio cinetica, un requisito per accurata quantificazione dell'attività ATPasi cinetica. Figura 2 mostra i dati dagli stessi campioni di proteine purificate da figura 1 che sono stati analizzati tre volte in duplicato e quantificato in termini diIl tasso medio di rilascio di fosfato. Questi dati dimostrano che K417 e K419 sembrano essere importanti per l'attività Epse ATPasi. Tuttavia, il confronto di non stimolate (non cardiolipina) tassi di attività ATPasi (Figura 3) mostra che K417 e K419 non contribuiscono all'attività basale di Epse ma piuttosto la capacità della proteina di essere stimolato da cardiolipina. Le lisine carica positiva nel dominio zinc-binding Epse possono interagire direttamente con i fosfolipidi a carica negativa, contribuendo così alla stimolazione fosfolipide-mediata di attività EPSE ATPasi.
Figura 1: fosfato viene rilasciato linearmente in una cinetica ATPasi Assay Un'ora cinetica cardiolipina-stimolata saggio ATPasi confrontando rilascio di fosfato di 0,5 micron WT-Epse cytoEpsL per Epse K417AK419A-cytoEpsL con albumina sierica bovina (BSA) dosati come.un controllo negativo. Dati [quantità di fosfato liberato (asse y) in funzione del tempo (asse x)] sono stati tracciati e sottoposti ad analisi di regressione lineare. La pendenza rappresenta il tasso di idrolisi dell'ATP. Viene visualizzato un grafico rappresentativo con le equazioni di regressione lineare per le tre proteine. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:.. Doppio Lisina mutazioni nel Epse zinco-dominio di legame Ridurre stimolata ATPasi attività Risultati del cinetica saggio ATPasi cardiolipina stimolata 1 ora con le stesse proteine e le condizioni in figura 1 saggi sono stati eseguiti tre volte separate in duplice copia tecnica e la tasso di idrolisi dell'ATP è stato calcolato come fosfato nmol generato al minuto per micron pr otein utilizzando le equazioni di regressione lineare. Vengono visualizzati i risultati medi con errore standard. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Doppio Lisina mutazioni nel Epse zinco-dominio di legame non interferiscono con stimolate ATPasi attività Overnight (16 ore) endpoint non stimolate (senza cardiolipina) saggio ATPasi a confronto l'attività di 5 micron WT Epse-cytoEpsL per Epse K417AK419A-cytoEpsL con BSA. come controllo negativo. I dosaggi sono stati eseguiti tre volte separate in duplice copia tecnica e risultati medi con errore standard è mostrato. Il livello basale di non stimolato attività Epse ATPasi analizzati nel corso di un periodo di 16 ore è ~ 1.000 volte inferiore a 1 ora cinetica attività cardiolipina-stimolata.e.com/files/ftp_upload/54305/54305fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo è un protocollo generale per la misurazione dell'attività di ATPasi vitro di proteine purificate per la caratterizzazione biochimica. Questo metodo può essere facilmente ottimizzato; per esempio, regolando la quantità di proteine, tampone e composizioni di sale, la temperatura, e variando la lunghezza del test e intervalli (compreso l'aumento del numero totale di intervalli) può migliorare l'attività di quantificazione. Disponibili in commercio malachite reagenti verde-based sono molto sensibili, e in grado di rilevare piccole quantità di fosfati (~ 50 pmoli in 100 ml). A causa della sensibilità di questo saggio, è fondamentale utilizzare software usa e getta di plastica, acqua ultrapura, tamponi e reagenti privi di contaminanti fosfati. Dopo proteine purificante, è raccomandato l'esclusione dimensioni o la cromatografia a scambio ionico per migliorare la purezza delle proteine e rimuovere i contaminanti.
Per proteine visualizzazione debole ATPasi vitro, stimolanti possono essere aggiunti alla reazione per migliorare el'attività nzymatic. Molti fattori che stimolano l'attività ATPasi sono stati caratterizzati. Ad esempio, cardiolipina e altri lipidi di membrana, proteine clienti di accompagnatori, come Hsp90, e altre proteine coinvolte nel sostegno particolari conformazioni o ambienti in cui ATPases funzione 13-15. Il nostro laboratorio prima caratterizzata Epse purificando monomeri con l'attività ATPasi debole rispetto a ATPases omologhi 6. Abbiamo poi scoperto che quando Epse stata copurified con il dominio citoplasmatico di EPSL, una proteina transmembrana e partner legante di Epse nel sistema T2S, aggiunta di fosfolipidi acidi come cardiolipina alla miscela di reazione aumentata notevolmente l'attività di ATPasi EPSE 12. Questo probabilmente imita le condizioni esperienze Epse a livello della membrana citoplasmatica che possono promuovere oligomerizzazione.
Molte tecniche sono state utilizzate per quantificare in vitro ATPasi attività delle proteine purificate. γ- radioattivo
Il test qui descritto è costituito da un solo passo di misura rilascio di fosfato, è altamente sensibile, e può tipicamente essere eseguita entro pochi hr. È anche possibile prepare un substrato verde contenente malachite per evitare l'acquisto di un kit da un fornitore commerciale 6,9. Una considerazione prima di intraprendere questo saggio è che il passo tra l'aggiunta del reagente di rilevamento di fosfato e prendendo le letture di assorbanza è relativamente tempo sensibile e deve essere compreso tra 20-30 minuti. Questo protocollo di base può essere utilizzato per determinare il ruolo di stimolanti (come descritto), antagonisti, subunità, domini e residui specifici ATPasi attività 15,16,18,19. Questo test può anche essere esteso per misurare l'attività di fosfatasi o altri enzimi che rilasciano fosfato durante la catalisi. Inoltre, questo metodo può essere applicato a screening ad alto rendimento per gli inibitori ATPasi 20.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES buffer | Fisher | BP310-500 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Fisher | BP41325 | |
| 96-well plates (clear, flat-bottom) | VWR | 82050-760 | |
| BIOMOL Green | Enzo Life Sciences | BML-AK111 | Preferred phosphate detection reagent. Caution: irritant. |
| Microplate reader | BioTek Synergy or comparable | ||
| Prism 5 | GraphPad Software |
References
- Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (7), 519-529 (2005).
- Baker, T. A., Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochimica et Biophysica Acta. 1823 (1), 15-28 (2012).
- Maxson, M. E., Grinstein, S. The vacuolar-type H+-ATPase at a glance - more than a proton pump. J Cell Sci. 127 (23), 4987-4993 (2014).
- Planet, P. J., Kachlany, S. C., DeSalle, R., Figurski, D. H. Phylogeny of genes for secretion NTPases: Identification of the widespread tadA subfamily and development of a diagnostic key for gene classification. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2503-2508 (2001).
- Robien, M. A., Krumm, B. E., Sandkvist, M., Hol, W. G. J. Crystal Structure of the Extracellular Protein Secretion NTPase EpsE of Vibrio cholerae. J Mol Biol. 333 (3), 657-674 (2003).
- Camberg, J. L., Sandkvist, M. Molecular analysis of the Vibrio cholerae type II secretion ATPase EpsE. J Bacteriol. 187 (1), 249-256 (2005).
- Sandkvist, M. Type II secretion and pathogenesis. Infect Immun. 69 (6), 3523-3535 (2001).
- Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Webb, M. R. Direct, Real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).
- Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: An improvement and evaluation. J Biochem Biophys Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
- Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. A microassay for ATPase. Anal Biochem. 169 (2), 312-318 (1988).
- Harder, K. W., Owen, P., Wong, L. K. H., Aebersold, R., Clark-Lewis, I., Jirik, F. R. Characterization and kinetic analysis of the intracellular domain of human protein tyrosine phosphatase β (HPTP β) using synthetic phosphopeptides. Biochem J. 298 (2), 395-401 (1994).
- Camberg, J. L., Johnson, T. L., Patrick, M., Abendroth, J., Hol, W. G., Sandkvist, M. Synergistic stimulation of EpsE ATP hydrolysis by EpsL and acidic phospholipids. EMBO J. 26 (1), 19-27 (2006).
- McLaughlin, S. H., Smith, H. W., Jackson, S. E. Stimulation of the weak ATPase activity of human Hsp90 by a client protein. J Mol Biol. 315 (4), 787-798 (2002).
- Shiue, S., Kao, K., Leu, W., Chen, L., Chan, N., Hu, N. XpsE oligomerization triggered by ATP binding, not hydrolysis, leads to its association with XpsL. EMBO J. 25 (7), 1426-1435 (2006).
- Ghosh, A., Hartung, S., van der Does, C., Tainer, J. A., Albers, S. V. Archaeal flagellar ATPase motor shows ATP-dependent hexameric assembly and activity stimulation by specific lipid binding. Biochem J. 437 (1), 43-52 (2011).
- Savvides, S. N., et al. VirB11 ATPases are dynamic hexameric assemblies: new insights into bacterial type IV secretion. EMBO J. 22 (9), 1969-1980 (2003).
- Sanghera, J., Li, R., Yan, J. Comparison of the luminescent ADP-Glo assay to a standard radiometric assay for measurement of protein kinase activity. Assay Drug Dev Techn. 7 (6), 615-622 (2009).
- Sherman, D. J., et al. Decoupling catalytic activity from biological function of the ATPase that powers lipopolysaccharide transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), 4982-4987 (2014).
- Zhang, X., et al. Altered cofactor regulation with disease-associated p97/VCP mutations. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (14), E1705-E1714 (2015).
- Rowlands, M. G., Newbatt, Y. M., Prodromou, C., Pearl, L. H., Workman, P., Aherne, W. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Anal Biochem. 327 (2), 176-183 (2004).
