Abstract
アデノシン三リン酸加水分解酵素、またはATPアーゼは、細胞機能の多様な配列に重要な役割を果たしています。これらの動的なタンパク質は、タンパク質輸送および分解、溶質輸送、および細胞の動きとして、機械的な作業のためのエネルギーを生成することができます。ここで説明するプロトコルは、機能的な特徴付けのために精製されたATPアーゼのインビトロ活性を測定するための基本的なアッセイです。タンパク質は、無機リン酸の放出をもたらす反応でATPを加水分解し、遊離したリン酸塩の量を、比色アッセイを用いて定量されます。この高度に適応プロトコルは、運動またはエンドポイントアッセイにおいてATPアーゼ活性を測定するために調整することができます。代表的なプロトコルは活動とEPSEの要件に基づいて、ここで提供され、AAA + ATPアーゼは、細菌コレラ菌にタイプIIの分泌に関与します。活性を測定するために必要な精製されたタンパク質の量は、アッセイの長さおよびSAのタイミングおよび数mpling間隔は、緩衝液および塩組成、温度、補因子、刺激剤（もしあれば）、 等は、ここで説明したものと異なる場合があり、したがって、いくつかの最適化が必要であってもよいです。このプロトコルは、特徴付けるATPアーゼのための基本的な枠組みを提供し、迅速に行われ、容易に、必要に応じて調整することができます。
Protocol
1.精製タンパク質とATP加水分解反応を行います
- 精製タンパク質とのインキュベーションのために必要なすべての試薬の株式を準備します。
- 100mMのHEPES pHは8.5、65 mMのNaClおよび5％グリセロール（またはその他の適切なアッセイバッファー）を含む5倍HEPES /食塩/グリセロール（HNG）バッファを準備します。
- （ATPアーゼは、金属依存している場合、または他の金属）を水に100のMgCl 2を準備します。
- 高純度のATPを用いて、200 mMトリス塩基（さらにpHを調整しない）で新鮮な100mMのATPを準備します。 ATPは時間をかけて分解し、そしてATPストックを凍結し、解凍を控えるよう、もはや数週間以上のために-20℃でATPストックをアリコートし、保管しません。
- ちょうどATP加水分解反応をセットアップする前に1：1の比率でプレミックスのMgCl 2およびATP。
- 反応の間、一定の間隔でサンプルを収集するために1.5ミリリットルのチューブを準備し、ラベルを付けます。時間0で、かつ時間15、30でサンプルを収集するためのチューブを準備し、45、および60分。
注：別の方法として、唯一の時間0およびエンドポイントでサンプルを収集します。- ATP加水分解反応1時50分から採取された試料を希釈するために、各チューブに245μlの1×HNGバッファを追加します。
- すぐに反応を停止したサンプルを凍結するためにドライアイスとエタノールのバスを準備します。ゴムアイスバケットまたは他の安全な（非プラスチック）容器の中で、ドライアイスのいくつかの部分を追加し、慎重にドライアイスをカバーするのに十分な70から100パーセントのエタノールを注ぎます。
- （通常5〜10μM）必要に応じて、1×HNG緩衝液中で精製したタンパク質を希釈し、そして氷上に保ちます。
- ATP加水分解反応を設定します。
- 各サンプルの別々の0.5ミリリットルのチューブでは、以下の試薬 を順に追加：H（30μlの最終容量まで）2 O、6μlの5倍HNGまたは他のバッファー、3μlの100のMgCl 2 -ATP混合物を、および0.25から5μMタンパク質。
- 何のタンパク質を添加していないされているバッファのみの負の制御条件が含まれます。
- 、時間0での反応から5μLを削除する245μlのHNG緩衝液を含む準備された1.5mlチューブに1:50に希釈し、直ちにドライアイス/エタノール浴中でサンプルを凍結します。
- ATP加水分解は、1時間に発生できるようにするために、37℃で反応をインキュベートします。各区間（15、30、45、および60分）で、反応から5μlのアリコートを削除し、ステップ1.6のようにHNG緩衝液を含む標識試料管に追加します。
- ATPの加水分解反応の終了時に、貯蔵のために-80℃の冷凍庫に希釈したサンプルを移動させます。すべての試料が完全に凍結されていることを確認するには、続行する前に少なくとも10分を待ちます。
検出試薬で無料のPiを含む2.インキュベートサンプル
- 各時点でのATP加水分解反応のアリコートを含む融解希釈した試料は、室温で（ステップ1.6および1.7から得られました）。
- サンプルおよびリン酸塩標準を含む96ウェルプレートをセットアップ。
- 0.5ミリリットルのTUで104.5μlのHNGバッファに標準800μMの5.5μLを添加することにより、40μMに800μMから（Piの検出試薬に付属）、リン酸標準を希釈し、こと。よく混合し、96ウェルプレートのウェルA1に、この40μMPiを標準の100μlを添加します。
- パイ規格の1の連続希釈：1のためのウェルB1-H1に50μlのHNGのバッファを追加します。
- よくA1から40μMPiを50μlのを削除し、よくB1に50μlのアッセイバッファーに追加し、混ぜ、よくB1から50μLを削除してもG1を介して、よくC1に継続的な希釈液を追加します。各ウェルが同じボリュームを持って確保するために混合した後も、G1から50μLを捨てます。まあH1は40から0μMにPiの標準を作成するための唯一のバッファが含まれている必要があります。
注：追加の要因は、（このような阻害剤など）をサンプルに添加されている場合は、それらの条件の下でリン酸放出または吸光度の変化を制御するために、その要因を含む標準曲線を作成します。 - 各SAMPの50μLを追加プレートに二重にル。水平方向と異なる時間点、垂直列に同じ時点からのサンプル（サンプル2時間0 = B2、B3サンプル1時間0 = A2、A3）を追加します。これは、プレートあたり最大8個のサンプルと5つの時点を可能にします。
- サンプルおよび標準を含むウェル（試薬必要（ミリリットル）=サンプルおよび標準の0.1 x個）のそれぞれに100μlを添加するのに十分なマラカイトグリーン/モリブデン酸Piの検出試薬を除去するために、滅菌ピペットを使用して、簡単にピペット操作のための皿に追加マルチチャンネルピペットを使用して。 Piの汚染が発生する可能性があるとして、皿に直接検出試薬をかけないでください。
- マルチチャンネルピペットを用いて、好ましくは、第1の時点への最後の時点から順に、慎重に気泡を導入することなく、ピペッティングと時間の一貫した数ダウンすることにより、各ウェルにPiの検出試薬の100μlを添加し、混合します。
- 室温で25分間プレートをインキュベートし、またはミリアンペアに従ってnufacturerの指示。
マイクロプレートリーダーを使用した3定量結果
- 吸光マイクロプレートリーダーを用いて650 nmでサンプルの吸光度を読みます。
- Piの標準曲線を作成します。グラフ作成ソフトウェアを使用して、各試料中のリン酸量を解くために使用される式を見つけるために、濃度に対するPiの標準サンプルについて吸光度値をグラフ。
- リン酸標準で校正することにより、各サンプルのATPase活性を計算します。リン酸解放=（OD 650 - Y切片）/傾き。
- 各サンプルの重複からの総パイを平均します。この番号からバッファのみの対照の吸光度の読み取りを引きます。希釈係数（この例では50）で、これを乗算します。
- マイクロモルのタンパク質当たりに放出されるnmolのPiを決定します。動態アッセイにおいて、各時点のためにこれらの値をグラフ化することは、少なくともR = 150（ 図1）の線形フィットをもたらすべきです。 n個の場合OT、アッセイは、多かれ少なかれタンパク質又はより長いまたはより短いインキュベーション時間で調整することができます。
- 所望であれば、ナノモルのPi /モルタンパク質/分（ 図2、図 3）、またはナノモルPI /μgタンパク質/分として結果を表します。
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Representative Results
T2S ATPアーゼEPSEのin vitro活性は、細胞質EPSLのドメイン（EPSE-cytoEpsL）と酸性リン脂質カルジオリピン12を加えてEPSEの同時精製によって刺激することができます。このアッセイを用いてタンパク質の変異形態を、野生型（WT）の活性を比較することにより、ATP加水分解の特定EPSE残基の役割を決定することも可能です。ここで、EPSE亜鉛結合ドメイン内の2つのリジン残基を置換することの効果はEPSE K417AK419A-cytoEpsLバリアントに精製されたWT EPSE-cytoEpsLのATPase活性を比較することによって測定されます。 図1では、リン酸のリリースでは、1時間動的アッセイ、運動ATPase活性の正確な定量化のための要件にわたって直線的に進行する。連で3回分析し、定量化した図1と同様の精製タンパク質サンプルから2データを示す図の面ではリン酸の放出の平均速度。これらのデータは、K417とK419はEPSE ATPase活性のために重要であると思われることを示しています。しかし、刺激されていない（無カルジオリピン）ATPase活性率の比較（ 図3）は、K417とK419はEPSEの基礎活性にではなく、カルジオリピンによって刺激されるタンパク質の能力に寄与しないことを示しています。 EPSEの亜鉛結合ドメイン内の正に荷電したリシンは、直接このようEPSE ATPase活性のリン脂質媒介刺激に貢献し、負に帯電したリン脂質と相互作用することができます。
図1： リン酸は、キネティックATPアーゼアッセイに直線的にリリースされた 1時間の運動カルジオリピン刺激ATPアーゼアッセイとしてアッセイしたウシ血清アルブミン（BSA）とのEPSE K417AK419A-cytoEpsLに0.5μMWT EPSE-cytoEpsLのリン酸の放出を比較します。ネガティブコントロール。データ【時間に対する放出されたリン酸塩（y軸）（x軸）の量]をプロットし、線形回帰分析に供しました。勾配は、ATP加水分解の速度を表します。 3タンパク質のための線形回帰式を持つ代表的なグラフが示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：EPSE 亜鉛結合ドメインは刺激ATPアーゼ活性を低下させるでダブルリジン変異 、図1と同じタンパク質との条件で1時間の運動カルジオリピン刺激ATPアーゼアッセイの結果アッセイは、技術的な重複で3回に分けを行ったと。 ATP加水分解の速度は、μMPRあたり毎分発生ナノモルリン酸として計算しました線形回帰式を用いてotein。標準誤差と平均の結果が表示されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： ダブルリジン変異EPSEドメインは、非刺激ATPアーゼ活性を妨害しない亜鉛結合一晩（16時間）エンドポイント刺激されていない（無カルジオリピン）ATPアーゼアッセイにおける BSAでEPSE K417AK419A-cytoEpsLに5μMWT EPSE-cytoEpsLの活性を比較します。ネガティブコントロールとして。アッセイは、技術連で3回に分けを行い、標準誤差と平均の結果が示されています。 16時間にわたってアッセイした非刺激EPSE ATPase活性の基礎レベルは、1時間の運動カルジオリピン刺激活性より〜千倍低いです。e.com/files/ftp_upload/54305/54305fig2large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
これは、生化学的な特徴付けのために精製されたタンパク質のin vitroでのATPase活性に測定するための一般的なプロトコルです。この方法は、容易に最適化されています。例えば、蛋白質、緩衝液および塩組成物の量、温度を調整し、アッセイ長さ（間隔の合計数を増やすなど）の間隔を変化させると、活性定量を改善することができます。市販のマラカイトグリーンベースの試薬は非常に敏感であり、遊離リン酸（100μl中〜50ピコモル）の少量を検出することができます。このため、アッセイの感度が、使い捨てのプラスチック製品、超純水、緩衝液、およびリン酸を汚染を欠いた試薬を使用することが重要です。タンパク質を精製した後、サイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーは、タンパク質の純度を改善し、汚染物質を除去することをお勧めします。
インビトロの ATPase活性に弱い表示タンパク質について、刺激は、電子を向上させるために反応に添加することができますnzymatic活動。 ATPase活性を刺激する多くの要因が特徴付けられています。例えば、カルジオリピン及び他の膜脂質、などのHsp90のようなシャペロンのクライアントタンパク質、およびATPアーゼは13から15を機能される特定の立体構造や環境をサポートするに関与する他のタンパク質。私たちの研究室では、最初の相同ATPアーゼ6に比べて弱いATPアーゼ活性を有する単量体を精製することによってEPSEを特徴とします。私たちは、後でEPSEはT2SシステムにおけるEPSLの細胞質ドメイン、膜貫通型タンパク質とEPSEの結合パートナーと一緒に精製されたときに、このような反応混合物にカルジオリピンなどの酸性リン脂質の添加が大幅にEPSE 12のATPase活性を増加させることを発見しました。このオリゴマー化を促進することができる細胞膜での可能性を模倣条件EPSE体験を。
多くの技術は、精製されたタンパク質のin vitroでの ATPアーゼ活性を定量するために使用されています。放射性γ-
ここに記載のアッセイは、唯一のリン酸塩の放出測定工程から成る非常に敏感であり、典型的には数時間以内に行うことができます。それはprepaすることも可能ですマラカイトグリーン含有基材再商業ベンダー6,9からキットを購入しないようにします。このアッセイを実施する前に、一つの考慮事項は、リン酸検出試薬を添加し、吸光度測定を取るとの間の段差は比較的時間に敏感であり、20〜30分の間でなければならないということです。この基本的なプロトコルは、刺激（記載されているように）、アンタゴニスト、サブユニット、ドメイン、およびATPase活性15,16,18,19における特定の残基の役割を決定するために使用することができます。このアッセイはまた、触媒中のリン酸を放出するホスファターゼまたは他の酵素の活性を測定するために拡張することができます。さらに、この方法は、ATPase阻害剤20のための高スループットスクリーニングに適用することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES buffer | Fisher | BP310-500 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Fisher | BP41325 | |
| 96-well plates (clear, flat-bottom) | VWR | 82050-760 | |
| BIOMOL Green | Enzo Life Sciences | BML-AK111 | Preferred phosphate detection reagent. Caution: irritant. |
| Microplate reader | BioTek Synergy or comparable | ||
| Prism 5 | GraphPad Software |
References
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