Abstract
아데노신 삼인산 가수 분해 효소, 또는 -ATPase를는 세포 기능의 다양한 배열에 중요한 역할을한다. 이러한 동적 단백질은 단백질 인신 매매 및 저하, 용질 수송, 및 세포의 움직임과 같은 기계적인 작업을위한 에너지를 생성 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 기능적 특성화 -ATPase를 정제의 시험 관내 활성을 측정하기위한 기본적인 분석이다. 단백질은 무기 포스페이트 방출을 초래 반응의 ATP 가수 분해 및 유리 된 인산의 양은 다음 비색 정량 분석법을 사용한다. 이것은 고도로 적응 프로토콜 운동 또는 엔드 포인트 분석에서 ATP 아제 활성을 측정하기 위해 조정될 수있다. 대표적인 프로토콜이 활동과 EPSE의 요구 사항에 따라 여기에 제공되면, AAA + ATP 아제는 박테리아 비브리오 콜레라를 입력 II 분비에 관여. 활성을 측정하기 위해 필요로 정제 된 단백질의 양을 분석의 길이와 SA의 타이밍 및 횟수mpling 간격, 버퍼 소금 조성, 온도, 공동 요인, 각성제 (있는 경우) 등이 여기에 설명하는 것과 다를 수 있습니다, 따라서 약간의 최적화가 필요할 수 있습니다. 이 프로토콜의 특성 -ATPase를위한 기본 틀을 제공하고 신속하게 수행하고 쉽게 필요한 조절 될 수있다.
Protocol
1. 정제 된 단백질과 ATP 가수 분해 반응을 수행
- 정제 된 단백질과 부화에 필요한 모든 시약의 주식을 준비합니다.
- 100 mM의 HEPES pH가 8.5, 65 mM의 염화나트륨, 5 % 글리세롤 (또는 다른 분석 완충액 적절한)을 함유하는 배 HEPES / 염화나트륨 / 글리세롤 (HNG) 버퍼를 준비한다.
- 물 (ATP 아제 금속에 의존하는 경우, 또는 다른 금속) 100 밀리미터의 MgCl 2를 준비합니다.
- 고순도 ATP를 사용 (추가하여 pH를 조정하지 않음) 200 mM 트리스 자료에서 신선한 100 mM의 ATP를 준비합니다. 나누어지는이 ATP가 시간이 지남에 따라 분해되므로, 몇 주 이상 더 이상 -20 ° C에서 ATP 재고를 저장하고, 동결 및 ATP 재고를 해동을 삼가합니다.
- 1에서 프리믹스의 MgCl 2, ATP : 1의 비율로 바로 ATP의 가수 분해 반응을 설정하기 전에.
- 조제 및 반응에 걸쳐 일정한 간격으로 샘플을 수집하는 1.5 ㎖의 튜브 라벨. 시간 0 시간 15, 30에서 샘플을 수집하기 위해 튜브를 준비,45 및 60 분.
참고 : 다른 방법으로, 유일한 시간 0 엔드 포인트에서 샘플을 수집합니다.- ATP에 가수 분해 반응은 1:50에서 수집 한 샘플을 희석하기 위해 각 튜브에 245 μL의 1X HNG 버퍼를 추가한다.
- 신속하게 반응을 정지 샘플을 동결을 위해 드라이 아이스와 에탄올의 목욕을 준비합니다. 고무 얼음 양동이 또는 다른 안전 (비 플라스틱) 용기에 드라이 아이스의 여러 조각을 추가하고 조심스럽게 드라이 아이스를 커버하기에 충분한 70 ~ 100 에탄올을 부어.
- 적절한 (일반적으로 5 ~ 10 μM)로, 1 배 HNG 버퍼에 정제 된 단백질을 희석하고 얼음에 보관하십시오.
- ATP에 가수 분해 반응을 설정합니다.
- 각 샘플에 대해 별도의 0.5 ml의 튜브에서, (순서대로) 다음과 같은 시약을 추가, 6 μl의 5 배 HNG 또는 다른 버퍼, 3 μL 100 밀리미터의 MgCl 2 -ATP 혼합물 (최종 30 μL의 볼륨까지) H 2 O, 및 0.25-5 μm의 단백질.
- 어떤 단백질을 첨가하지 않은 버퍼 전용 대조군 조건을 포함한다.
- 시간 0에서 반응 5 μL를 제거 HNG 245 μL의 버퍼를 포함하는 제조 1.5 ㎖의 튜브에 1:50로 희석하고, 즉시 드라이 아이스 / 에탄올 욕에서 샘플을 동결.
- 37 ° C에서 반응은 ATP 가수 분해는 1 시간 동안 발생할 수 있도록 인큐베이션. 각각의 구간 (15, 30, 45, 60 분), 반응을 5 ㎕의 분취 액을 제거하고, 단계 160에서와 같이 HNG 버퍼를 함유하는 표지 된 샘플 튜브에 추가.
- ATP에 가수 분해 반응의 끝에서, 저장을 위해 -80 ° C에 냉동 희석 샘플을 이동. 모든 샘플이 완전히 고정되어 있는지 확인하려면 계속하기 전에 적어도 10 분을 기다립니다.
검출 시약과 무료 파이를 포함하는 2 품어 샘플
- 각 시점에서의 ATP 가수 분해 반응의 분취 량을 함유하는 희석 된 샘플 녹여 실온에서 (단계 1.6 및 1.7에서 수득).
- 샘플 및 포스페이트 표준을 함유하는 96 웰 플레이트를 설치했다.
- 0.5 ml의 TU에서800 μM 표준 104.5 μL에 HNG 완충액 5.5 μl를 첨가하여 800 μM 40 μM 내지 (PI 검출 시약으로 제공됨) 포스페이트 표준 희석 될. 잘 혼합하고, 96 웰 플레이트의 웰에 A1을이 40 μM 파이 표준의 100 μl를 추가합니다.
- 1 우물 B1-H1에 50 μL의 HNG 버퍼를 추가 파이 표준의 1 직렬 희석.
- 잘 A1에서 40 μM 파이의 50 μl를 제거하고 잘 B1에 50 μl를 분석 버퍼에 추가, 혼합, 잘 B1에서 50 μl를 제거하고 잘 G1을 통해 잘 C1에 계속 희석을 추가합니다. 각 웰은 동일한 볼륨이 보장하는 혼합하여 잘 G1 50 μl를 폐기하십시오. 잘 H1 40 0 μM에 파이 표준을 만들 수있는 유일한 버퍼를 포함해야합니다.
참고 : 추가 요소 (예 : 억제제 등) 샘플에 추가 된 경우, 그 조건 하에서 인산 릴리스 또는 흡광도의 변화를 제어하는 요소를 포함하는 표준 곡선을 작성합니다. - 각 SAMP의 50 μl를 추가접시에 중복으로 제작. 서로 다른 시점 수평, 열에서 같은 시점 수직 (샘플 2 시간 0 = B2, B3 샘플 1 시간 0 = A2, A3가)에서 샘플을 추가합니다. 이는 최대 8 샘플 및 플레이트 당 5 시간 지점 수 있습니다.
- 시료와 표준을 포함하는 웰 (시약 필요 (㎖) = 시료와 표준의 0.1 × 번호) 각 100 μl를 추가하기에 충분한 말라카이트 그린 / 몰리브덴 파이 검출 시약을 제거하기 위해 멸균 피펫을 사용하여 쉽게 피펫 팅에 대한 접시에 추가 멀티 채널 피펫을 사용. 파이 오염이 발생하기 쉽다 같이 접시에 직접 검출 시약을 부어 마십시오.
- 멀티 채널 피펫을 사용하여, 처음 포인트 전회 점에서 바람직 위해 도입 거품 않고 조심스럽게 피펫으로 시간과 일관된 번호 아래 각 웰에 파이 검출 시약 100 μL를 추가 혼합한다.
- 실온에서 25 분 동안 플레이트를 인큐베이션, 또는 MA에 따라nufacturer의 방향.
마이크로 플레이트 리더를 사용하여 3. 정량 결과
- 흡광도 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 650 nm에서 시료의 흡광도를 참조하십시오.
- 파이 표준 곡선을 확인합니다. 그래프 소프트웨어를 사용하여 각 샘플에 인산의 양에 대해 해결하기 위해 사용 된 식을 찾기 위해 농도 대 파이 표준 샘플에 대한 흡광도 값을 그래프.
- 포스페이트 표준을 교정하여 각 샘플에 대한 ATP 아제 활성을 계산한다. 인산 출시 = (OD 650 - Y 절편) / 경사.
- 각 샘플의 중복에서 전체 파이를 평균. 이 번호에서 버퍼 전용 컨트롤의 흡광도 판독 값을 뺍니다. 희석 인자 (예에서는 50)를 곱하면.
- μmol 단백질 당 발표 nmol의 파이를 결정합니다. 역학적 분석에서 각 시점에 대한 이들 값을 그래프로하여 적어도 R = 0.99 (도 1)의 선형 발작을 수득한다; N 경우OT는 분석은 더 많거나 적은 단백질 또는 길거나 짧은 배양 시간이 조정될 수있다.
- nmol의 PI / 단백질 μmol / min으로 같은 결과를 원하는 경우, 또는 nmol의 PI / μg의 단백질 / 분 (3,도 2 등)를 나타낸다.
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Representative Results
T2S ATP 아제 EPSE의 생체 외 활동은 세포질 EpsL (EPSE-cytoEpsL)의 도메인과 산성 인지질 카디오 리핀 (12)의 추가와 함께 EPSE의 copurification에 의해 자극 될 수있다. 또한이 분석을 사용하여 단백질의 변이체 형태를 야생형 (WT)의 활성을 비교함으로써 ATP 가수 분해에 EPSE 특정 잔기의 역할을 결정하는 것도 가능하다. 여기서, EPSE 아연 결합 도메인에 두 개의 리신 잔기로 치환하는 효과가 K417AK419A EPSE-cytoEpsL 변이체를 정제 WT EPSE-cytoEpsL의 ATP 아제 활성을 비교함으로써 측정된다. 도 1에서, 포스페이트 방출은 1 시간 역학적 분석, 운동 ATP 아제 활성의 정확한 정량을위한 요구 사항에 걸쳐 선형 진행한다. 이중으로 세 번 분석하고 정량화 된도 1과 같은 정제 된 단백질 시료 (2)로부터 방송 데이터를 도표 측면에서인산 릴리스의 평균 속도. 이러한 데이터는 K417과 K419은 EPSE ATP 아제 활성에 중요한 것으로 보인다 것으로 나타났다. 그러나 비자극 (NO 리핀) ATPase의 활성 비율의 비교 (도 3) K417 및 K419는 EPSE의 기저 활동보다는 리핀 의해 자극되는 단백질의 기능에 기여하지 않는 것으로 나타났다. EPSE 아연 결합 도메인의 양전하를 띤 리신 직접 따라서 EPSE ATP 아제 활성 인지질 매개 된 자극에 기여 음으로 하전 인지질과 상호 작용할 수있다.
그림 1 :. 인산이 한 시간 운동 카디오 리핀 자극 소 혈청 알부민과 EPSE K417AK419A - cytoEpsL 0.5 μM WT EPSE-cytoEpsL의 인산 자료를 비교 ATP 아제 분석 (BSA)는 운동 ATP 아제 분석에서 선형 출시로 분석된다음성 대조군. 데이터 [대 시간 해제 인산 (Y 축) (x 축)의 양]을 플롯 팅하고 선형 회귀 분석을 실시 하였다. 기울기는 ATP의 가수 분해 속도를 나타낸다. 세 가지 단백질에 대한 선형 회귀 방정식 대표적인 그래프가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :.. 두 번 리신 돌연변이 EPSE는 도메인 자극 ATP 아제 활성을 감소 아연 바인딩 그림 1과 같은 단백질과 조건으로 1 시간 운동 카디오 리핀 자극 ATP 아제 분석의 결과 분석은 기술적 중복과 세 별도의 시간을 수행 하였다 ATP 가수 분해의 속도는 μM PR 분당 생성을 nmol 인산 계산 선형 회귀 방정식을 사용하여 otein. 표준 오차와 평균 결과가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 더블 리신 돌연변이 EPSE 아연 바인딩 도메인에서이 자극되지 ATP 아제 활동을 방해하지 하룻밤 (16 시간) 자극되지 엔드 포인트 BSA와 EPSE K417AK419A - cytoEpsL 5 μM WT EPSE-cytoEpsL의 활성을 비교 (더 카디오 리핀) ATP 아제 분석하지 않습니다. 음성 대조군있다. 분석 기술 중복에 별도의 세 번 수행하고 표준 오차와 평균 결과가 표시됩니다. 16 시간 동안 분석 자극되지 EPSE ATP 아제 활동의 기초 수준은 ~보다 낮은 1 시간 운동 카디오 리핀 자극 활동을 1,000 배이다.e.com/files/ftp_upload/54305/54305fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 생화학 적 특성에 대한 정제 된 단백질의 생체 외 ATP 아제 활동 측정하는 일반적인 프로토콜입니다. 이 방법은 쉽게 최적화되어 있습니다; 예를 들어, 단백질, 완충 염 및 조성물, 온도, 및 상기 분석과 다양한 길이 (간격의 총 개수를 증가 포함) 간격의 양을 조절하는 활성을 정량을 향상시킬 수있다. 시판 말라카이트 그린 기반의 시약은 매우 민감, 무료 인산 소량 검출 할 수있다 (~ 100 μl의 50 pmol의). 따라서 분석의 민감도, 일회용 플라스틱 제품, 초순수, 완충제, 인산염 오염없는 시약을 사용하는 것이 중요하다. 단백질 정제 후, 크기 배제 또는 이온 교환 크로마토 그래피는 단백질의 순도를 향상시키고 불순물을 제거하기 위해 권고된다.
시험관 ATP 아제 활성이 약한 표시 단백질, 각성제 전자를 향상시키기 위해 반응에 첨가 될 수있다nzymatic 활동. ATP 아제 활성을 자극하는 많은 요소가 특징으로하고있다. 예를 들어, 카디오 리핀 및 기타 막 지질를 들어,의 Hsp90와 같은 보호자, 특히 입체 또는 환경을 지원에 관여하는 다른 단백질의 클라이언트 단백질하는 -ATPase를가 13-15를 작동합니다. 우리 연구실은 첫 번째 상동 -ATPase를 6에 비해 약한 ATP 아제 활동 단량체를 정제하여 EPSE을 특징으로한다. 우리는 이후 EPSE가 T2S 시스템 EpsL의 세포질 도메인, 막 횡단 단백질 EPSE의 결합 파트너와 copurified 때, 이러한 반응 혼합물에 리핀 산성 인지질 첨가 크게 EPSE (12)의 ATP 아제 활성이 증가 된 것을 발견했다. 이 가능성을 모방 올리고머를 촉진 할 수있다 세포질 막에서 조건 EPSE 경험을.
대부분의 기술들은 정제 된 단백질의 생체 외 ATP 아제 활성을 정량하는 데 사용되어왔다. 방사성 γ-
여기에 설명 된 분석은, 단지 하나의 포스페이트 방출 측정 단계로 구성 고감도이며, 일반적으로 몇 시간 내에 수행 될 수있다. 그것은 처리장으로도 가능말라 카이트 그린 함유 기판 재 상용 공급 업체 6,9에서 키트를 구매 방지 할 수 있습니다. 이 분석에 착수하기 전에 하나의 고려 사항은 인산 검출 시약을 추가하고 흡광도 판독을 복용 사이의 단계는 상대적으로 시간에 민감한이며, 20 ~ 30 분 사이 여야한다는 것입니다. 이 기본 프로토콜 (설명) ATPase의 활성 15,16,18,19에서, 길항제, 서브 유니트, 도메인 특정 잔기 자극의 역할을 결정하는데 사용될 수있다. 이 분석은 촉매 중에 인산 해제 포스파타제 등의 효소 활성을 측정하기 위해 확장 될 수있다. 또한,이 방법은 ATP 아제 저해제 20 고 처리량 스크리닝에 적용될 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES buffer | Fisher | BP310-500 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Fisher | BP41325 | |
| 96-well plates (clear, flat-bottom) | VWR | 82050-760 | |
| BIOMOL Green | Enzo Life Sciences | BML-AK111 | Preferred phosphate detection reagent. Caution: irritant. |
| Microplate reader | BioTek Synergy or comparable | ||
| Prism 5 | GraphPad Software |
References
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