Abstract
Adenosin trifosfat-hydrolyserende enzymer, eller ATPaser, spille en avgjørende rolle i et mangfoldig utvalg av cellulære funksjoner. Disse dynamiske proteiner kan generere energi til mekanisk arbeid, slik som protein menneskehandel og degradering, oppløst stoff transport, og cellulære bevegelser. Protokollen er beskrevet her er en grunnleggende undersøkelse for å måle in vitro-aktiviteten av rensede ATPaser for funksjonell karakterisering. Proteiner hydrolyserer ATP i en reaksjon som fører til uorganisk fosfat frigjøring, og mengden av fosfat frigjort blir deretter kvantifisert ved hjelp av en kolorimetrisk analyse. Denne svært tilpasningsdyktig protokollen kan tilpasses for å måle ATPase-aktivitet i kinetiske eller endepunkt analyser. En representant protokollen er gitt her er basert på aktiviteten og krav EPSE, AAA + ATPase involvert i Type II Utskillelse i bakterien Vibrio cholerae. Mengden av renset protein som er nødvendig for å måle aktivitet, lengden av analysen og timingen og antallet sampling intervaller, buffer og salt sammensetning, temperatur, co-faktorer, sentralstimulerende midler (hvis noen), etc. kan variere fra det som er beskrevet her, og dermed noen optimalisering kan være nødvendig. Denne protokollen gir en grunnleggende rammeverk for å karakterisere ATPaser og kan utføres raskt og enkelt kan justeres etter behov.
Protocol
1. Utfør ATP Hydrolyse Reaksjon med Purified Protein
- Forbered Beholdning av alle nødvendige reagenser for Inkubasjon med Purified Protein.
- Forbered 5x HEPES / NaCl / glycerol (HNG) buffer inneholdende 100 mM HEPES pH 8,5, 65 mM NaCl, og 5% glycerol (eller annen analysebuffer som det passer).
- Forbered 100 mM MgCl2 (eller annet metall, hvis ATPase er metall-avhengige) i vann.
- Forbered fersk 100 mM ATP i 200 mM Tris Base (ikke justere pH videre) med høy renhet ATP. Delmengde og lagre ATP lager ved -20 ° C ikke lenger enn et par uker, så ATP vil bryte ned over tid, og avstå fra å fryse og tine ATP lager.
- Premix MgCl2 og ATP ved et 1: 1 forhold like før oppsettet av ATP-hydrolyse-reaksjonen.
- Forbered og merke 1,5 ml rør for oppsamling av prøver med jevne mellomrom gjennom reaksjonen. Fremstille rør for å samle inn prøver ved tid 0, og på tidspunktet 15, 30,45, og 60 min.
MERK: Som et alternativ kan samle inn prøver bare ved tiden 0 og endepunktet.- Legg 245 mL 1x HNG-buffer til hvert rør for å fortynne prøver samlet fra ATP-hydrolysereaksjoner 1:50.
- Fremstille et bad av tørris og etanol for raskt å fryse prøvene for å stoppe reaksjonen. I en gummi isen bøtte eller annen safe (non-plast) container, legge til flere stykker av tørris og forsiktig helle nok 70-100% etanol for å dekke tørris.
- Fortynnet renset protein i 1x HNG buffer, etter behov (vanligvis 5-10 mm), og holde på is.
- Sett opp ATP hydrolysereaksjoner.
- I separate 0,5 ml rør for hver prøve, legge til følgende reagenser (i rekkefølge): H 2 O (opp til et sluttvolum på 30 ul), 6 pl 5x HNG eller annen buffer, 3 ul 100 mM MgCl2 -ATP blanding, og 0,25 til 5 mikrometer protein.
- Omfatte en buffer-bare negative kontroll tilstand der ingen protein tilsettes.
- Fjern 5 pl fra reaksjonsblandingen ved tid 0, fortynnes 1:50 i den fremstilte 1,5 ml rør inneholdende 245 ul HNG-buffer, og straks fryse prøven i tørris / etanol-bad.
- Inkuber reaksjoner ved 37 ° C for å tillate ATP-hydrolyse for å forekomme i 1 time. Ved hvert intervall (15, 30, 45, og 60 min), fjern 5 pl aliquoter fra reaksjonsblandingen og tilsett merkede prøverør inneholdende HNG-buffer som i trinn 1.6.
- Ved slutten av ATP-hydrolysereaksjonen, beveger fortynnede prøver til en -80 ° C fryser for lagring. For å sikre at alle prøvene er helt frosset, vent i minst 10 minutter før du fortsetter.
2. Inkuber prøvene inneholder frie Pi med Detection Reagent
- Tine fortynnede prøver inneholdende ATP-hydrolyse reaksjons alikvoter ved hvert tidspunkt (oppnådd fra trinn 1,6 og 1,7) ved romtemperatur.
- Sett opp en 96-brønners plate inneholdende prøver og fosfat standarder.
- I et 0,5 ml tuvære fortynnes fosfat standard (forsynt med Pi deteksjonsreagens) fra 800 uM til 40 uM ved tilsetning av 5,5 pl av 800 pM standard til 104,5 mL HNG-buffer. Bland godt og tilsett 100 ul av dette 40 uM Pi standard brønn A1 av en 96-brønns plate.
- Tilsett 50 mL HNG-buffer til brønner B1-H1 i 1: 1 serielle fortynninger av Pi-standarden.
- Fjern 50 ul av 40 mM Pi fra brønn A1 og legge til 50 pl analysebuffer i godt B1, mikse, og ta 50 ul fra godt B1 og legge til godt C1, fortsetter fortynninger gjennom godt G1. Kast 50 ul fra vel G1 etter blanding for å sikre at hver brønn har det samme volum. Vel H1 bør inneholde bare buffer for å skape en Pi standard 40-0 uM.
MERK: Hvis en tilleggsfaktor (for eksempel en inhibitor) har blitt lagt til prøvene, lage en standardkurve med den faktoren for å kontrollere for endringer i fosfat løslatelse eller absorbans under slike forhold. - Tilsett 50 ul av hver sample i duplikat til plate. Legg prøver fra samme tidspunkt i kolonner vertikalt (prøve en gang 0 = A2, A3, prøve 2 tiden 0 = B2, B3) og forskjellige tidspunkter horisontalt. Dette gjør det mulig for opptil 8 prøver og 5 tidspunkter per plate.
- Bruke en steril pipette for å fjerne nok malakitt grønn / molybdat Pi deteksjonsreagens for å legge til 100 ul til hver av brønnene som inneholdt prøvene og standarder (reagens nødvendig (ml) = 0,1 x antall prøver og standarder) og tilsett til en tallerken for enkel pipettering ved hjelp av en flerkanals pipette. Ikke hell deteksjonsreagensen direkte i formen, som Pi forurensning er sannsynlig.
- Ved hjelp av en flerkanals pipette, tilsett 100 mL av Pi deteksjonsreagensen til hver brønn og bland ved forsiktig pipettering opp og ned en konsekvent antall ganger uten å innføre bobler, fortrinnsvis i rekkefølge fra de siste tidspunkter for de første tidspunkter.
- Platen inkuberes i 25 minutter ved romtemperatur, eller i henhold til manufacturer retninger.
3. kvantifisere resultater ved hjelp av en mikroplateleser
- Les av absorbansen av prøvene ved 650 nm ved hjelp av en absorbans mikroplateleser.
- Lag en Pi standardkurve. Ved hjelp av en grafisk programvare, plotte absorbans verdier for Pi standard prøver versus konsentrasjon for å finne en ligning brukes til å løse for mengden av fosfat i hver prøve.
- Beregn ATPase-aktiviteten for hver prøve ved å kalibrere med fosfat standard. Fosfat utgitt = (OD 650 - Y aksen) / skråning.
- Gjennomsnittlig total Pi fra duplikater av hver prøve. Trekk fra buffer-only kontroll absorbans lesing fra dette nummeret. Multipliser dette med fortynningsfaktoren (50 i vårt eksempel).
- Bestem nmol Pi frigjort per mikromol protein. Grafisk fremstilling av disse verdier for hvert tidspunkt i en kinetisk undersøkelse bør gi lineære anfall av minst en R = 0,99 (figur 1); Hvis not, kan analysen bli justert sammen med mer eller mindre protein eller en lengre eller kortere inkubasjonstid.
- Representerer de resultater som nmol Pi / umol protein / min (figurene 2, 3), eller som nmol Pi / ug protein / min hvis det er ønskelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den in vitro aktivitet av T2S-ATPase EPSE kan stimuleres ved copurification av EPSE med det cytoplasmatiske domene av EpsL (EPSE-cytoEpsL) og tilsetning av den sure fosfolipid kardiolipin 12. Det er også mulig å bestemme rollen av bestemte EPSE rester i ATP-hydrolyse ved å sammenligne aktiviteten av villtype (WT) for å variantformer av proteinet ved hjelp av denne analysen. Her er effekten av å erstatte to lysinrester i EPSE sink-bindende domene målt ved å sammenligne ATPase-aktiviteten av renset WT EPSE-cytoEpsL til EPSE K417AK419A-cytoEpsL variant. I figur 1 forløper fosfat frigivelse lineært i løpet av en 1 time kinetisk undersøkelse, er en forutsetning for nøyaktig kvantifisering av kinetisk ATPase-aktivitet. Figur 2 viser data fra de samme rensede proteinprøver som figur 1 som ble analysert tre ganger i duplikat og kvantifisert i form avgjennomsnittshastigheten av fosfat utgivelse. Disse data viser at K417 og K419 synes å være viktig for EPSE ATPase-aktivitet. Imidlertid sammenligning av ustimulerte (ingen kardiolipin) ATPase-aktivitetsnivå (figur 3) viser at K417 og K419 ikke bidrar til EPSE basal aktivitet, men snarere til proteinets evne til å bli stimulert av kardiolipin. De positivt ladede lysines i EPSE sink-bindende domene kan direkte samhandle med de negativt ladede fosfolipider, og dermed bidra til fosfolipid-mediert stimulering av EPSE ATPase aktivitet.
Figur 1: Fosfat er utgitt lineært i en Kinetic ATPase Assay En time kinetisk kardiolipin-stimulert ATPase-analyse som sammenligner fosfat frigivelse av 0,5 uM WT EPSE-cytoEpsL til EPSE K417AK419A-cytoEpsL med bovint serumalbumin (BSA) ble analysert som.en negativ kontroll. Data [mengde av frigjort fosfat (y-aksen) som funksjon av tid (x-aksen)] ble plottet og underkastet lineær regresjonsanalyse. Skråningen representerer frekvensen av ATP-hydrolyse. En representant graf med lineære regresjon ligninger for de tre proteinene er vist. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:.. Dobbelt Lysin Mutasjoner i EPSE Sink-Binding Domain Reduser stimulert ATPase-aktivitet Resultater av 1 time kinetiske kardiolipin-stimulert ATPase-analyse med de samme proteiner og betingelser som i figur 1 Analyser ble utført tre ganger i teknisk duplikat og den hastighet av ATP-hydrolyse ble beregnet som nmol fosfat generert per minutt per pr pM otein bruker lineær regresjon ligninger. De gjennomsnittlige resultater med standard feil vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Dobbelt Lysin Mutasjoner i EPSE Sink-bindende domene ikke forstyrrer unstimulated ATPase aktivitet Night (16 timer) endepunkt unstimulated (ingen kardiolipin) ATPase-analyse som sammenligner aktiviteten til 5 mikrometer WT EPSE-cytoEpsL til EPSE K417AK419A-cytoEpsL med BSA. som en negativ kontroll. Analyser ble utført tre ganger i teknisk duplikat, og gjennomsnittsresultatene med standardfeil er vist. Basalnivået ustimulert EPSE ATPase-aktiviteten ble analysert i løpet av en 16 timers periode er ~ 1000 ganger lavere enn 1 time kinetisk kardiolipin-stimulert aktivitet.e.com/files/ftp_upload/54305/54305fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette er en generell protokoll for å måle in vitro-ATPase-aktiviteten av rensede proteiner for biokjemisk karakterisering. Denne metoden er lett optimaliseres; for eksempel kan justere mengden av protein, en buffer og saltsammensetninger, temperatur og å variere analysen lengde og intervaller (inkludert øke det totale antall intervaller) bedre aktivitet kvantifisering. Kommersielt tilgjengelige malakittgrønt-baserte reagenser er meget følsomme, og kan detektere små mengder av fritt fosfat (~ 50 pmol i 100 ul). På grunn av denne analysen følsomhet, er det avgjørende å bruke engangs plast ware, ultrarent vann, buffere og reagenser blottet for forurensende fosfat. Etter rensende proteiner, er størrelsen eksklusjon eller ionebytterkromatografi anbefales å forbedre protein renhet og fjerne forurensninger.
For proteiner som viser svak in vitro ATPase-aktivitet, kan stimulerende midler tilsettes til reaksjonsblandingen for å forbedre enzymatic aktivitet. Mange faktorer som stimulerer ATPase aktivitet har vært preget. For eksempel, kardiolipin og andre membranlipider, klient proteiner av anstand som HSP90, og andre proteiner som er involvert i å støtte bestemte conformations eller miljøer der ATPaser fungere 13-15. Vårt laboratorium først preget EPSE ved å rense monomerer med svak ATPase aktivitet sammenlignet med homologe ATPaser 6. Vi senere oppdaget at når EPSE ble copurified med det cytoplasmatiske domene av EpsL, et transmembranprotein og bindingspartner av EPSE i T2S-systemet, tilsetning av sure fosfolipider slik som kardiolipin til reaksjonsblandingen betydelig økt ATPase-aktiviteten av EPSE 12. Denne sannsynlige etterligner forholdene EPSE opplevelser på cytoplasmamembranen som kan fremme oligomeriseringsprosessen.
Mange teknikker er blitt brukt til å kvantifisere in vitro-ATPase-aktiviteten av rensede proteiner. Radioaktivt γ-
Analysen beskrevet her består av bare en fosfat frigivelse måletrinnet, er svært sensitive, og kan vanligvis utføres i løpet av noen få timer. Det er også mulig å behandling anleggre en malakittgrønt holdig substrat for å unngå å kjøpe et kit fra en kommersiell leverandør 6,9. En vurdering før du gjennomfører denne analysen er at trinnet mellom tilsette fosfat deteksjonsreagensen og ta avlesninger er relativt tidssensitiv og må være mellom 20-30 min. Denne grunnleggende protokollen kan brukes for å bestemme rollen til sentralstimulerende midler (som beskrevet), antagonister, underenheter, domener, og spesifikke rester i ATPase-aktivitet 15,16,18,19. Denne analysen kan også bli utvidet til å måle aktiviteten av fosfataser eller andre enzymer som frigjør fosfat under katalyse. I tillegg kan denne fremgangsmåte anvendes på high-throughput screening for ATPase-inhibitorer 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES buffer | Fisher | BP310-500 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Fisher | BP41325 | |
| 96-well plates (clear, flat-bottom) | VWR | 82050-760 | |
| BIOMOL Green | Enzo Life Sciences | BML-AK111 | Preferred phosphate detection reagent. Caution: irritant. |
| Microplate reader | BioTek Synergy or comparable | ||
| Prism 5 | GraphPad Software |
References
- Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (7), 519-529 (2005).
- Baker, T. A., Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochimica et Biophysica Acta. 1823 (1), 15-28 (2012).
- Maxson, M. E., Grinstein, S. The vacuolar-type H+-ATPase at a glance - more than a proton pump. J Cell Sci. 127 (23), 4987-4993 (2014).
- Planet, P. J., Kachlany, S. C., DeSalle, R., Figurski, D. H. Phylogeny of genes for secretion NTPases: Identification of the widespread tadA subfamily and development of a diagnostic key for gene classification. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2503-2508 (2001).
- Robien, M. A., Krumm, B. E., Sandkvist, M., Hol, W. G. J. Crystal Structure of the Extracellular Protein Secretion NTPase EpsE of Vibrio cholerae. J Mol Biol. 333 (3), 657-674 (2003).
- Camberg, J. L., Sandkvist, M. Molecular analysis of the Vibrio cholerae type II secretion ATPase EpsE. J Bacteriol. 187 (1), 249-256 (2005).
- Sandkvist, M. Type II secretion and pathogenesis. Infect Immun. 69 (6), 3523-3535 (2001).
- Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Webb, M. R. Direct, Real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).
- Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: An improvement and evaluation. J Biochem Biophys Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
- Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. A microassay for ATPase. Anal Biochem. 169 (2), 312-318 (1988).
- Harder, K. W., Owen, P., Wong, L. K. H., Aebersold, R., Clark-Lewis, I., Jirik, F. R. Characterization and kinetic analysis of the intracellular domain of human protein tyrosine phosphatase β (HPTP β) using synthetic phosphopeptides. Biochem J. 298 (2), 395-401 (1994).
- Camberg, J. L., Johnson, T. L., Patrick, M., Abendroth, J., Hol, W. G., Sandkvist, M. Synergistic stimulation of EpsE ATP hydrolysis by EpsL and acidic phospholipids. EMBO J. 26 (1), 19-27 (2006).
- McLaughlin, S. H., Smith, H. W., Jackson, S. E. Stimulation of the weak ATPase activity of human Hsp90 by a client protein. J Mol Biol. 315 (4), 787-798 (2002).
- Shiue, S., Kao, K., Leu, W., Chen, L., Chan, N., Hu, N. XpsE oligomerization triggered by ATP binding, not hydrolysis, leads to its association with XpsL. EMBO J. 25 (7), 1426-1435 (2006).
- Ghosh, A., Hartung, S., van der Does, C., Tainer, J. A., Albers, S. V. Archaeal flagellar ATPase motor shows ATP-dependent hexameric assembly and activity stimulation by specific lipid binding. Biochem J. 437 (1), 43-52 (2011).
- Savvides, S. N., et al. VirB11 ATPases are dynamic hexameric assemblies: new insights into bacterial type IV secretion. EMBO J. 22 (9), 1969-1980 (2003).
- Sanghera, J., Li, R., Yan, J. Comparison of the luminescent ADP-Glo assay to a standard radiometric assay for measurement of protein kinase activity. Assay Drug Dev Techn. 7 (6), 615-622 (2009).
- Sherman, D. J., et al. Decoupling catalytic activity from biological function of the ATPase that powers lipopolysaccharide transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), 4982-4987 (2014).
- Zhang, X., et al. Altered cofactor regulation with disease-associated p97/VCP mutations. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (14), E1705-E1714 (2015).
- Rowlands, M. G., Newbatt, Y. M., Prodromou, C., Pearl, L. H., Workman, P., Aherne, W. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Anal Biochem. 327 (2), 176-183 (2004).
