Abstract
enzimas de hidrólise de trifosfato de adenosina, ou ATPases, desempenham um papel crítico num conjunto diversificado de funções celulares. Estas proteínas dinâmicas podem gerar energia para o trabalho mecânico, tais como o tráfico de proteínas e degradação, transporte de soluto e movimentos celulares. O protocolo aqui descrito é um ensaio de base para a medição da actividade in vitro de ATPases purificadas para a caracterização funcional. Proteínas hidrolisar ATP numa reacção que resulta na libertação de fosfato inorgânico, e a quantidade de fosfato libertado é então quantificada utilizando um ensaio colorimétrico. Este protocolo altamente adaptável pode ser ajustado para medir a actividade de ATPase em ensaios cinéticos ou terminal. Um protocolo representante é fornecido aqui com base na atividade e as exigências de Epse, a AAA + ATPase envolvida no Tipo II Secreção na bactéria Vibrio cholerae. A quantidade de proteína purificada necessária para medir a actividade, duração do ensaio e o calendário e número de saintervalos mpling, tampão e a composição de sal, temperatura, co-factores, estimulantes (se houver), etc., podem variar a partir dos descritos aqui, e, assim, alguma optimização pode ser necessário. Este protocolo fornece uma estrutura básica para ATPases que caracterizam e pode ser realizado de forma rápida e facilmente ajustado conforme necessário.
Protocol
1. Execute Reaction ATP hidrólise com Proteína Purificada
- Prepare estoques de todos os reagentes necessários para a incubação com proteína purificada.
- Prepare 5x HEPES / NaCl / glicerol (HNG) contendo tampão HEPES 100 mM, pH 8,5, NaCl 65 mM e glicerol a 5% (ou outro tampão de ensaio conforme o caso).
- Preparação de 100 mM de MgCl2 (ou outro metal, se é de ATPase dependente de metais) em água.
- Prepare fresco ATP 100 mM em 200 mM Tris Base (não ajustar o pH ainda mais), utilizando alta ATP pureza. Alíquotas e armazenar o estoque de ATP a -20 ° C durante não mais do que algumas semanas, como ATP vai quebrar ao longo do tempo, e se abstenham de congelamento e descongelamento o estoque de ATP.
- Pré-mistura de MgCl2 e ATP em uma relação de 1: 1 pouco antes de se a reacção de hidrólise de ATP.
- Preparar e rotular tubos de 1,5 ml para a recolha de amostras em intervalos regulares ao longo da reacção. Preparar tubos para recolher amostras no momento 0 e no momento 15, 30,45 e 60 min.
NOTA: Como alternativa, recolher amostras apenas em tempo de 0 e o ponto final.- Adicionar 245 ul de tampão 1x HNG a cada tubo, a fim de diluir as amostras recolhidas a partir das reações de hidrólise de ATP 1:50.
- Prepara-se uma banho de gelo seco e etanol para congelar rapidamente amostras para parar a reacção. Em um balde de borracha gelo ou recipiente outra segura (não de plástico), adicione vários pedaços de gelo seco e despeje com cuidado suficiente de etanol 70-100% para cobrir o gelo seco.
- Diluir proteína purificada em tampão HNG 1x, conforme apropriado (tipicamente 5-10 mM), e manter em gelo.
- Configurar as reações de hidrólise de ATP.
- Em separados 0,5 ml de tubos para cada amostra, adicionar os seguintes reagentes (por ordem): H2O (até um volume final de 30 ul), 6 ul de 5x tampão HNG ou outra, 3 ul de MgCl 100 mM de 2 -ATP mistura, e 0,25-5 proteína uM.
- Incluir uma única tampão-condicionado de controlo negativo em que é adicionado nenhuma proteína.
- Retirar 5 ul a partir da reacção no tempo 0, dilui-se a 1:50 em o tubo de 1,5 mL contendo 245 uL preparado tampão HNG, e congelar imediatamente a amostra no banho de gelo seco / etanol.
- Incubar as reacções a 37 ° C para permitir a hidrólise do ATP a ocorrer durante 1 h. Em cada intervalo (15, 30, 45, e 60 min), remover aliquotas de 5 ul a partir da reacção e adicionar aos tubos de amostra marcado contendo tampão HNG como no passo 1.6.
- No final da reacção de hidrólise de ATP, mover-se amostras diluídas para um congelador de -80 ° C para armazenamento. Para garantir que todas as amostras são completamente congelado, espere pelo menos 10 minutos antes de prosseguir.
2. As amostras Incubar Contendo gratuito Pi com Detecção de Reagente
- Descongelar as amostras diluídas contendo alíquotas de reacção de hidrólise de ATP em cada ponto de tempo (obtidos a partir dos passos 1,6 e 1,7) à temperatura ambiente.
- Defina-se uma placa de 96 poços contendo amostras e padrões de fosfato.
- Em 0,5 ml de uma TUser, dilui-se o padrão de fosfato (fornecida com o reagente de detecção Pi) a partir de 800 uM a 40 uM por adição de 5,5 mL de tampão HNG a 800 uM padrão de 104,5 ul. Misturar bem e adicionar 100 ul deste padrão 40 pM Pi a bem A1 de uma placa de 96 poços.
- Adicionar tampão HNG 50 ul a poços B1-H1 para 1: 1 de diluições em série do padrão Pi.
- Remover 50 pi de 40 uM de Pi bem A1 e adicionar ao tampão de ensaio 50 uL de B1 bem, misturar e remover a partir de 50 ul bem B1 e adicionar ao Poço C1, continuando através de diluições G1 bem. Descartar 50 ul de G1 bem após a mistura para assegurar a cada poço tem o mesmo volume. Bem H1 deve conter apenas buffer para criar um padrão Pi 40-0 M.
NOTA: Se um factor adicional (tal como um inibidor) foi adicionado às amostras, criar uma curva padrão, contendo esse factor para controlar as variações de libertação de fosfato ou absorvância sob essas condições. - Adicionar 50 ul de cada SAMPle em duplicado à placa. Adicionar amostras a partir do mesmo ponto de tempo em colunas verticalmente (amostra de 1 hora 0 = A2, A3; amostra 2 0 tempo = B2, B3) e diferentes pontos de tempo horizontalmente. Isto permite até 8 amostras e 5 pontos de tempo por placa.
- Usar uma pipeta estéril para remover o reagente suficiente malaquite verde / molibdato Pi detecção para adicionar 100 ul a cada um dos poços que contêm as amostras e padrões (reagente necessários (ml) = 0,1 x número de amostras e os padrões) e adicionar a um prato para facilitar a pipetagem utilizando uma pipeta multicanal. Não despeje o reagente de detecção diretamente no prato, como a contaminação Pi é provável que ocorra.
- Usando uma pipeta multicanal, adicionar 100 uL de reagente de detecção Pi a cada poço e misture cuidadosamente por pipetagem para cima e para baixo um número consistente de vezes sem bolhas de introdução, de um modo preferido, a fim de os últimos pontos de tempo para os primeiros pontos de tempo.
- Incubar a placa durante 25 minutos à temperatura ambiente, ou de acordo com a madireções de nufacturer.
3. Resultados quantificar usando um leitor de microplacas
- Leia a absorvância das amostras a 650 nm usando um leitor de microplacas de absorvância.
- Fazer uma curva padrão Pi. Usando um software de gráficos, o gráfico dos valores de absorção para as amostras padrão Pi em função da concentração, a fim de encontrar uma equação usada para resolver a quantidade de fosfato em cada amostra.
- Calcula-se a actividade de ATPase para cada amostra de calibração com o padrão de fosfato. Fosfato libertado = (OD 650 - Y ordenada) / inclinação.
- Média do total Pi de duplicatas de cada amostra. Subtrair a leitura de absorvância do controlo só de tampão a partir deste número. Multiplique isso pelo fator de diluição (50 no nosso exemplo).
- Determine o Pi nmol libertada por proteína mol. Representação gráfica destes valores para cada ponto de tempo em um ensaio cinético deve render ajuste linear de, pelo menos, R = 0,99 (Figura 1); Se not, o ensaio pode ser ajustado com mais ou menos proteína ou um tempo de incubação mais longo ou mais curto.
- Representam os resultados como nmol de Pi / mol de proteína / min (Figuras 2, 3), ou como proteínas nmol Pi / g / min, se desejado.
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Representative Results
A actividade in vitro da ATPase T2S Epse pode ser estimulada por copurification de Epse com o domínio citoplasmático de EPSL (Epse-cytoEpsL) e adição do ácido 12 cardiolipina fosfolípido. É também possível determinar o papel de determinados resíduos Epse em hidrólise de ATP comparando a actividade do tipo selvagem (WT) para formas variantes da proteína utilizando este ensaio. Aqui, o efeito da substituição de dois resíduos de lisina no domínio de ligação de zinco Epse é medida pela comparação da actividade de ATPase purificada WT Epse-cytoEpsL para a variante Epse K417AK419A-cytoEpsL. Na Figura 1, a libertação de fosfato procede linearmente ao longo do curso de um ensaio cinético 1 h, um requisito para a quantificação exacta de actividade de ATPase cinética. A Figura 2 mostra os dados a partir das mesmas amostras de proteína purificada como Figura 1, que foram ensaiadas três vezes em duplicado e quantificado em termos dea taxa média de liberação de fosfato. Estes dados mostram que K417 e K419 parecem ser importantes para a actividade de ATPase Epse. No entanto, a comparação de cardiolipina (sem) as taxas de actividade ATPase não estimuladas (Figura 3) mostra que K417 e K419 não contribuem para a actividade basal do Epse mas sim para a capacidade da proteína para ser estimulada pela cardiolipina. As lisinas carregadas positivamente no domínio de ligação de zinco Epse pode interagir directamente com os fosfolípidos carregados negativamente, contribuindo assim para a estimulação mediada por fosfolípido de actividade Epse ATPase.
Figura 1: Fosfato de vazamento de forma linear e uma cinética de ATPase ensaio de uma hora cinética ensaio de ATPase comparando a libertação de fosfato de 0,5 uM WT Epse-cytoEpsL para Epse K417AK419A-cytoEpsL com albumina de soro de bovino estimulados-cardiolipina (BSA) como ensaiado.um controlo negativo. Dados [quantidade de fosfato libertado (eixo y) versus tempo (eixo x)] foram representados graficamente e submetido a análise de regressão linear. O declive representa a taxa de hidrólise de ATP. Um gráfico representativo com equações de regressão linear para as três proteínas é mostrado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:.. Duplo Lisina As mutações em Epse zinco-Binding Domain Reduzir Estimulada ATPase actividade resulta da 1 h de ensaio de ATPase estimulada por cardiolipina cinética com as mesmas proteínas e condições como na Figura 1 Os ensaios foram efectuados três vezes separadas em duplicado técnica eo taxa de hidrólise de ATP foi calculada como fosfato nmol gerado por minuto por mM pr otein usando equações de regressão linear. Os resultados médios com erro padrão são exibidos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Duplo Lisina Mutações no Epse Zinc-domínio de ligação não interferem com não estimulados ATPase Atividade durante a noite (16 horas) endpoint não estimulada (sem cardiolipina) ensaio de ATPase comparando a actividade de 5? M WT Epse-cytoEpsL para Epse K417AK419A-cytoEpsL com BSA. como um controlo negativo. Os ensaios foram realizados três vezes separadas em duplicado técnica e resultados médios com erro padrão é mostrado. O nível basal de actividade não estimulada Epse ATPase ensaiada ao longo de um período de 16 horas é de ~ 1000 vezes a actividade estimulada pela cardiolipina cinética menor que 1 hora.e.com/files/ftp_upload/54305/54305fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este é um protocolo geral para a medição da actividade ATPase in vitro de proteínas purificadas para a caracterização bioquímica. Este método é facilmente optimizado; Por exemplo, ajustando a quantidade de proteína, tampão e composições de sal, temperatura, e variando-se o comprimento de ensaio e intervalos (incluindo o aumento do número total de intervalos) pode melhorar a actividade de quantificação. reagentes verde à base de malaquita comercialmente disponíveis são altamente sensíveis, e pode detectar pequenas quantidades de fosfato livre (~ 50 pmol em 100 ul). Devido à sensibilidade deste ensaio, é fundamental utilizar utensílios de plástico descartável, água ultrapura, tampões, reagentes e desprovidas de contaminante fosfato. Depois de proteínas purificadora, de exclusão por tamanhos ou cromatografia de permuta iónica é recomendado para melhorar a pureza da proteína e remoção de contaminantes.
Para proteínas que exibem fraca em actividade de ATPase in vitro, estimulantes podem ser adicionados à reacção e a melhoraratividade nzymatic. Muitos factores que estimulam a actividade de ATPase foram caracterizados. Por exemplo, cardiolipina e outros lípidos de membrana, proteínas chaperonas de cliente, tais como Hsp90, e outras proteínas envolvidas no apoio conformações ou ambientes específicos de ATPases que funcionar 13-15. Nosso laboratório caracterizado pela primeira vez Epse purificando monómeros com a atividade ATPase fraco em comparação com ATPases homólogos 6. Mais tarde descobriu que quando Epse foi copurified com o domínio citoplasmático de EPSL, uma proteína transmembranar e um parceiro de ligação de Epse no sistema T2S, além de fosfolipidos acídicos, tais como a cardiolipina à mistura de reacção um grande aumento da actividade de ATPase de Epse 12. Isso provavelmente imita as condições experiências Epse na membrana citoplasmática que podem promover oligomerização.
Muitas técnicas têm sido usadas para quantificar a actividade ATPase in vitro de proteínas purificadas. γ- radioativo
O ensaio aqui descrito é composto por apenas um passo de medição de libertação de fosfato, é altamente sensível e pode ser tipicamente realizada dentro de algumas horas. Também é possível prepare um substrato verde contendo malaquita para evitar a compra de um kit de um fornecedor comercial 6,9. Uma consideração antes de realizar este ensaio é que o passo de adição de entre o reagente de detecção de fosfato e as leituras de absorvência é relativamente sensível ao tempo e deve estar entre 20-30 min. Este protocolo básico pode ser utilizado para determinar o papel de estimulantes (como descrito), antagonistas, subunidades, domínios e resíduos específicos na actividade da ATPase 15,16,18,19. Este ensaio também pode ser estendido para medir a actividade das fosfatases ou outras enzimas que libertam fosfato durante a catálise. Além disso, este método pode ser aplicado para rastreio de alto rendimento para os inibidores de ATPase 20.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES buffer | Fisher | BP310-500 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Fisher | BP41325 | |
| 96-well plates (clear, flat-bottom) | VWR | 82050-760 | |
| BIOMOL Green | Enzo Life Sciences | BML-AK111 | Preferred phosphate detection reagent. Caution: irritant. |
| Microplate reader | BioTek Synergy or comparable | ||
| Prism 5 | GraphPad Software |
References
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