Abstract
Аденозинтрифосфата-гидролизом ферменты или АТФазы, играют решающую роль в разнообразных клеточных функций. Эти динамические белки могут вырабатывать энергию для механической работы, такими как незаконный оборот белка и деградации, растворенной транспорта и клеточных движений. Протокол , описанный здесь , является основным анализом для измерения активности в пробирке очищенных ATPases для функциональной характеристике. Белки гидролизуются АТФ в реакции, что приводит к неорганическим высвобождение фосфата, и количество фосфата освободила затем количественно с помощью колориметрического анализа. Это хорошо адаптируется протокол может быть настроен для измерения активности АТФазы в кинетических или конечных точек анализов. Представитель протокола приводится здесь основывается на деятельности и требований белка EpsE, ААА + АТФазы участвуют в II типа секрецией бактерии холерных вибрионов. Количество очищенного белка, необходимого для измерения активности, продолжительность анализа и выбор времени и количество SAmpling интервалы, буфер и солевой состав, температура, кофакторы, стимуляторы (если таковые имеются) и т.д. могут отличаться от тех , которые описаны здесь, и , таким образом , некоторые оптимизации могут быть необходимы. Этот протокол обеспечивает базовую основу для характеризации АТФазы и может быть выполнена быстро и легко отрегулировано по мере необходимости.
Protocol
1. Выполните АТФ реакция гидролиза с очищенным белком
- Подготовка запасов всех необходимых реагентов для инкубации с очищенным белком.
- Подготовка 5x HEPES / NaCl / глицерин (HNG) буфера, содержащего 100 мМ HEPES рН 8,5, 65 мМ NaCl и 5% глицерина (или другого буфера для анализа, в зависимости от обстоятельств).
- Подготовьте 100 мМ MgCl 2 (или другой металл, если АТФазы металл-зависимых) в воде.
- Подготовить свежие 100 мМ АТФ в 200 мМ Трис-основание (не доведения рН далее) с использованием высокой чистоты АТФ. Алиготе и хранить запас АТФ при -20 ° С в течение не более чем на несколько недель, а АТФ сломается в течение долгого времени, и воздерживаться от замораживания и оттаивания запас АТФ.
- Премикс MgCl 2 и АТФ в соотношении 1: 1 как раз перед установкой реакции гидролиза АТФ.
- Подготовить и разметить 1,5 мл пробирки для сбора проб через равные промежутки времени в течение всей реакции. Подготовить пробирки для сбора образцов в момент времени 0 и в момент времени 15, 30,45 и 60 мин.
Примечание: В качестве альтернативы, собирают образцы только в момент времени 0 и в конечной точке.- Добавить 245 мкл буфера 1x Хнг в каждую пробирку для разбавления образцов, взятых из реакций гидролиза АТФ 1:50.
- Приготовьте ванну из сухого льда и этанола для быстрого замораживания образцов, чтобы остановить реакцию. В резиновый ведро льда или другого безопасного (не пластик) контейнер, добавьте несколько кусочков сухого льда и осторожно влить достаточно 70-100% этанола, чтобы покрыть сухой лед.
- Развести очищенного белка в 1x буфера HNG, в случае необходимости (обычно 5-10 мкм), и держать на льду.
- Настройка реакции гидролиза АТФ.
- В отдельных 0,5 мл пробирки для каждого образца, добавьте следующие реагенты (в указанном порядке): H 2 O (до конечного объема 30 мкл), 6 мкл 5х Хнг или другого буфера, 3 мкл 2 -АТФ смеси 100 мМ MgCl, и 0,25-5 мкМ белка.
- Включите буферную только отрицательное состояние управления, в котором не добавляют белок.
- Удалить 5 мкл из реакционной смеси в момент времени 0, разбавленным в соотношении 1:50 в приготовленную 1,5 мл пробирку, содержащую 245 мкл буфера HNG, и немедленно заморозить образец в бане сухой лед / этанол.
- Инкубируйте реакции при 37 ° С, чтобы обеспечить гидролиз АТФ, происходит в течение 1 часа. В каждом интервале (15, 30, 45 и 60 мин), удалить 5 мкл аликвоты из реакционной смеси и добавление меченых проб пробирки, содержащие Хнг буфере, как описано на стадии 1.6.
- В конце реакции гидролиза АТФ, переместить разбавленных образцов в -80 ° C морозильнике для хранения. Для того, чтобы гарантировать, что все образцы полностью заморожены, подождите по крайней мере 10 минут, прежде чем продолжить.
2. Инкубируйте образцы, содержащие свободный Pi с детектором Реагент
- Оттаивания разбавленных образцов, содержащих АТФ аликвот реакции гидролиза в каждый момент времени (получен из шагов 1.6 и 1.7) при комнатной температуре.
- Настройка 96-луночный планшет, содержащий образцы и стандарты фосфата.
- В 0,5 мл Tuбыть, разбавить стандарт фосфата (при условии, с реагентом обнаружения Pi) от 800 мкМ до 40 мкМ добавлением 5,5 мкл 800 мкМ стандартного до 104,5 мкл HNG буфера. Хорошо перемешать и добавить 100 мкл этого 40 мкМ стандарта Pi в лунку A1 96-луночного планшета.
- Добавьте 50 мкл буфера для Хнг в лунки B1-H1 для 1: 1 серийные разведения стандарта Pi.
- Удалить 50 мкл 40 мкМ Pi из скважины A1 и добавляют к 50 мкл буфера для анализа в хорошо В1, перемешать, и удалить 50 мкл из скважины B1 и добавить к Лунка C1, сохраняющиеся разведений через скважины G1. Откажитесь 50 мкл из скважины G1 после смешивания, чтобы обеспечить каждую лунку имеет тот же объем. Хорошо H1 должен содержать только буфер, чтобы создать стандарт Pi от 40 до 0 мкМ.
Примечание: Если дополнительный фактор (такой как ингибитор) был добавлен к образцам, создать стандартную кривую, содержащую этот фактор для контроля изменений в фосфатном высвобождения или оптической плотности в этих условиях. - Добавьте 50 мкл каждого SAMPле в двух экземплярах на тарелку. Добавьте образцы из той же временной точке в столбцах по вертикали (образец 1 раз 0 = А2, А3; образец 2 раз 0 = В2, В3) и разные временные точки в горизонтальном направлении. Это позволяет до 8 проб и 5 временных точек на чашку.
- С помощью стерильной пипетки, чтобы удалить достаточное количество малахитовый зеленый / молибдат детектирующий реагент Pi, чтобы добавить 100 мкл в каждую из лунок, содержащих образцы и стандарты (необходимых реагентов (мл) = 0,1 х количество образцов и стандартов) и добавить к блюду для быстрого пипетирования с помощью многоканального пипетку. Не лейте детектирующий реагент непосредственно в чашку, а загрязнение Пи, вероятно, произойдет.
- Используя многоканальную пипетку, добавьте 100 мкл реагента для детекции Pi в каждую лунку и перемешать тщательно пипетированием вверх и вниз последовательное число раз без введения пузырьков, предпочтительно, чтобы из последних моментов времени на первые моменты времени.
- Инкубируйте планшет в течение 25 мин при комнатной температуре, или в соответствии с манаправления nufacturer в.
3. Результаты количественного анализа с использованием микропланшетов Reader,
- Измерить оптическую плотность образцов при 650 нм с использованием микропланшет-ридера абсорбцию.
- Сделать стандартную кривую Pi. Используя программное обеспечение для построения графиков, график значения абсорбции для стандартных образцов Pi по сравнению с концентрацией, чтобы найти уравнение используется для решения для количества фосфата в каждом образце.
- Вычислить АТФазы для каждого образца путем калибровки со стандартом фосфата. Фосфаты выпущен = (OD 650 - Y перехватывать) / наклон.
- Нормальное общее Pi из дублей каждого образца. Вычтите буферную только элемента управления чтение оптической плотности от этого числа. Умножьте это на коэффициент разбавления (50 в нашем примере).
- Определить нмоль Pi выпущен на мкмоль белка. Графическое изображение этих значений для каждой временной точки в кинетическом анализе должны давать линейные припадки , по меньшей мере , R = 0,99 (рисунок 1); Если пВЗ, анализ может быть отрегулирована с более или менее белка или более или менее продолжительного времени инкубации.
- Результаты представлены как нмоль Pi / мкмоль белка / мин (фиг.2, 3), или в качестве нмоль Pi / мкг белка / мин , при желании.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Активность в пробирке из t2s АТФазы белка EpsE может стимулироваться copurification из белка EpsE с цитоплазматическим доменом ПЛЭН (ESPE-cytoEpsL) и добавлением кислого фосфолипида кардиолипина 12. Кроме того, можно определить роль отдельных остатков в EpsE гидролиза АТФ путем сравнения активности дикого типа (WT), чтобы вариантные формы белка с использованием этого анализа. При этом эффект замещения два остатка лизина в EpsE цинка-связывающего домена измеряется путем сравнения АТФазы активность очищенного WT ESPE-cytoEpsL варианту EpsE K417AK419A-cytoEpsL. На рисунке 1, высвобождение фосфата происходит линейно в течение кинетического анализа 1 час, требование для точного количественного определения кинетической АТФазы активности. Рисунок 2 показывает данные из одних и тех же очищенных образцов белка как показано на рисунке 1 , которые были исследованы три раза в двух экземплярах и количественному с точки зрениясредняя скорость высвобождения фосфата. Эти данные показывают, что K417 и K419, как представляется, важное значение для деятельности EpsE АТФазы. Тем не менее, сравнение не стимулированных (без кардиолипину) ставок -АТФазы (рисунок 3) показывает , что K417 и K419 не способствуют базальной активности EpsE, а скорее к способности белка стимулироваться кардиолипину. Положительно заряженные лизинов в EpsE цинка-связывающего домена может непосредственно взаимодействовать с отрицательно заряженными фосфолипидами, тем самым способствуя фосфолипидов опосредованной стимуляции активности EpsE АТФазы.
Рисунок 1: Фосфат выхода Линейно в кинетическом АТФазы Assay один час кинетический кардиолипину-стимулированной АТФазы анализ сравнения высвобождения фосфата 0,5 мкМ WT ESPE-cytoEpsL к EpsE K417AK419A-cytoEpsL с бычьим сывороточным альбумином (БСА) , анализировали , как.отрицательный контроль. Данные [количество выделенного фосфата (Y-ось) в зависимости от времени (ось х)], были нанесены и подвергали анализа линейной регрессии. Наклон представляет собой скорость гидролиза АТФ. Представитель граф с линейной регрессии уравнений для трех белков показан. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2:.. Двойной Лизин Мутации в EpsE Цинк-связывающий домен Сокращение стимулировал АТФазы Результаты 1 ч кинетического кардиолипиновым-стимулированной АТФазы анализа с теми же белками и условий , как на рисунке 1 Эксперименты были проведены три отдельных раза в технической двукратной последовательности, и скорость гидролиза АТФ была рассчитана как нмоль фосфата, генерируемого в минуту на мкМ пр otein с помощью линейных уравнений регрессии. Отображаются средние результаты со стандартной ошибкой. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Двойной Лизин Мутации в EpsE Zinc-связывающим доменом Не мешайте нестимулируемых АТФазы Ночь (16 ч) конечная точка нестимулируемый (без кардиолипином) АТФазы анализа сравнения активности 5 мкМ WT ESPE-cytoEpsL к EpsE K417AK419A-cytoEpsL с БСА. в качестве отрицательного контроля. Эксперименты были проведены три отдельных раза в технической двух экземплярах и средние результаты со стандартной ошибкой показана. Базальный уровень активности нестимулированных EpsE АТФазы анализируемой в течение 16 ч составляет ~ 1000 раз меньше, чем 1 час кинетическую Кардиолипин-стимулированной активности.e.com/files/ftp_upload/54305/54305fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Это общий протокол для измерения экстракорпоральное АТФазы активность очищенных белков для биохимических характеристик. Этот метод легко оптимизированы; например, регулируя количество белка, буфера и солевых композиций, температуры и изменения длины анализа и интервалы времени (в том числе и увеличение общего количества интервалов) может улучшить активность количественно оценивать. Коммерчески доступные малахитовый зеленый на основе реагенты обладают высокой чувствительностью, и могут обнаруживать небольшие количества свободного фосфата (~ 50 пмоль в 100 мкл). Из-за чувствительности данном анализе, это очень важно использовать одноразовые пластиковые изделия, сверхчистой воды, буферы и реагенты, не содержащие загрязняющие фосфата. После очистки белков, исключение размер или ионообменная хроматография, рекомендуется для улучшения чистоты белка и удаления загрязняющих веществ.
Для белков , отображающих слабым экстракорпоральное АТФазы активность, стимуляторы могут быть добавлены в реакционную смесь для усиления еnzymatic активность. Многие факторы, которые стимулируют активность АТФазы были охарактеризованы. Так , например, кардиолипина и других мембранных липидов, клиентские белки шаперонов , таких как Hsp90 и других белков , участвующих в поддержании определенных конформации или сред , в которых функционируют АТФазы 13-15. Наша лаборатория первой характеризуется EpsE очисткой мономеров со слабой АТФазы активностью по сравнению с гомологичными АТФаз 6. Позже мы обнаружили , что , когда EpsE был copurified с цитоплазматическим доменом EPSL, трансмембранный белок и партнером связывания белка EpsE в системе T2S, добавление кислотных фосфолипидов , таких как кардиолипину к реакционной смеси значительно увеличило АТФазы активность белка EpsE 12. Это, вероятно, имитирует условия переживания EpsE на цитоплазматической мембране, которые могут способствовать олигомеризации.
Многие методы были использованы для количественного определения активности в пробирке АТФазы очищенных белков. Радиоактивный γ-
Анализ, описанный здесь, состоит только из одного фосфата на этапе измерения высвобождения, обладает высокой чувствительностью, и как правило, может быть выполнена в течение нескольких часов. Также можно Подготовительномповторно в малахитовый зеленый , содержащий подложку , чтобы избежать покупки комплекта от коммерческого поставщика 6,9. Одно из соображений, прежде чем приступать этого анализа является то, что шаг между добавлением реагента обнаружения фосфата и снятия показаний оптической плотности является относительно чувствительным ко времени и должна быть в пределах 20-30 мин. Этот базовый протокол может быть использован для определения роли стимуляторов (как описано), антагонисты, субъединиц, домены и специфические остатки в активности АТФазы 15,16,18,19. Этот анализ также может быть расширен для измерения активности фосфатазы или других ферментов, высвобождение фосфата в процессе катализа. Кроме того, этот метод может быть применен для высокопроизводительного скрининга на ингибиторы АТФазы 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES buffer | Fisher | BP310-500 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Fisher | BP41325 | |
| 96-well plates (clear, flat-bottom) | VWR | 82050-760 | |
| BIOMOL Green | Enzo Life Sciences | BML-AK111 | Preferred phosphate detection reagent. Caution: irritant. |
| Microplate reader | BioTek Synergy or comparable | ||
| Prism 5 | GraphPad Software |
References
- Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (7), 519-529 (2005).
- Baker, T. A., Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochimica et Biophysica Acta. 1823 (1), 15-28 (2012).
- Maxson, M. E., Grinstein, S. The vacuolar-type H+-ATPase at a glance - more than a proton pump. J Cell Sci. 127 (23), 4987-4993 (2014).
- Planet, P. J., Kachlany, S. C., DeSalle, R., Figurski, D. H. Phylogeny of genes for secretion NTPases: Identification of the widespread tadA subfamily and development of a diagnostic key for gene classification. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2503-2508 (2001).
- Robien, M. A., Krumm, B. E., Sandkvist, M., Hol, W. G. J. Crystal Structure of the Extracellular Protein Secretion NTPase EpsE of Vibrio cholerae. J Mol Biol. 333 (3), 657-674 (2003).
- Camberg, J. L., Sandkvist, M. Molecular analysis of the Vibrio cholerae type II secretion ATPase EpsE. J Bacteriol. 187 (1), 249-256 (2005).
- Sandkvist, M. Type II secretion and pathogenesis. Infect Immun. 69 (6), 3523-3535 (2001).
- Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Webb, M. R. Direct, Real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).
- Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: An improvement and evaluation. J Biochem Biophys Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
- Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. A microassay for ATPase. Anal Biochem. 169 (2), 312-318 (1988).
- Harder, K. W., Owen, P., Wong, L. K. H., Aebersold, R., Clark-Lewis, I., Jirik, F. R. Characterization and kinetic analysis of the intracellular domain of human protein tyrosine phosphatase β (HPTP β) using synthetic phosphopeptides. Biochem J. 298 (2), 395-401 (1994).
- Camberg, J. L., Johnson, T. L., Patrick, M., Abendroth, J., Hol, W. G., Sandkvist, M. Synergistic stimulation of EpsE ATP hydrolysis by EpsL and acidic phospholipids. EMBO J. 26 (1), 19-27 (2006).
- McLaughlin, S. H., Smith, H. W., Jackson, S. E. Stimulation of the weak ATPase activity of human Hsp90 by a client protein. J Mol Biol. 315 (4), 787-798 (2002).
- Shiue, S., Kao, K., Leu, W., Chen, L., Chan, N., Hu, N. XpsE oligomerization triggered by ATP binding, not hydrolysis, leads to its association with XpsL. EMBO J. 25 (7), 1426-1435 (2006).
- Ghosh, A., Hartung, S., van der Does, C., Tainer, J. A., Albers, S. V. Archaeal flagellar ATPase motor shows ATP-dependent hexameric assembly and activity stimulation by specific lipid binding. Biochem J. 437 (1), 43-52 (2011).
- Savvides, S. N., et al. VirB11 ATPases are dynamic hexameric assemblies: new insights into bacterial type IV secretion. EMBO J. 22 (9), 1969-1980 (2003).
- Sanghera, J., Li, R., Yan, J. Comparison of the luminescent ADP-Glo assay to a standard radiometric assay for measurement of protein kinase activity. Assay Drug Dev Techn. 7 (6), 615-622 (2009).
- Sherman, D. J., et al. Decoupling catalytic activity from biological function of the ATPase that powers lipopolysaccharide transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), 4982-4987 (2014).
- Zhang, X., et al. Altered cofactor regulation with disease-associated p97/VCP mutations. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (14), E1705-E1714 (2015).
- Rowlands, M. G., Newbatt, Y. M., Prodromou, C., Pearl, L. H., Workman, P., Aherne, W. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Anal Biochem. 327 (2), 176-183 (2004).
