Abstract
enzimas trifosfato-hidrólisis de la adenosina, o ATPasas, juegan un papel crítico en una diversa gama de funciones celulares. Estas proteínas dinámicas pueden generar energía para el trabajo mecánico, como el tráfico de proteínas y la degradación, transporte de solutos, y los movimientos celulares. El protocolo descrito aquí es un ensayo básico para la medición de la actividad in vitro de ATPasas purificadas para la caracterización funcional. Las proteínas se hidrolizan ATP en una reacción que resulta en la liberación de fosfato inorgánico, y la cantidad de fosfato liberado a continuación, se cuantifica mediante un ensayo colorimétrico. Este protocolo altamente adaptable se puede ajustar para medir la actividad de ATPasa en ensayos cinéticos o de punto final. Se proporciona aquí un protocolo representativo basado en la actividad y requisitos de EPSE, la AAA + ATPasa implicada en la secreción de Tipo II en la bacteria Vibrio cholerae. La cantidad de proteína purificada necesaria para medir la actividad, la duración del ensayo y la sincronización y la cantidad de saintervalos mpling, tampón y composición de sal, temperatura, cofactores, estimulantes (si lo hay), etc., pueden variar de los descritos aquí, y por lo tanto una optimización pueden ser necesarios. Este protocolo proporciona un marco básico para ATPasas que caracterizan y se puede realizar rápida y fácilmente ajustarse según sea necesario.
Protocol
1. Realizar la reacción de hidrólisis de ATP con la proteína purificada
- Las existencias de preparar todos los reactivos necesarios para la incubación con proteína purificada.
- Preparar tampón 5x HEPES / NaCl / glicerol (HNG) que contiene 100 mM de HEPES pH 8,5, NaCl 65 mM, y 5% de glicerol (u otro tampón de ensayo según el caso).
- Preparar 100 mM de MgCl 2 (u otro metal, si es de metal ATPasa dependiente) en agua.
- Preparar fresca mM ATP 100 en 200 mM Tris Base (no ajuste de pH más) utilizando ATP alta pureza. Alícuota y almacenar el archivo de ATP a -20 ° C durante no más de unas pocas semanas, en forma de ATP se descompone con el tiempo, y se abstengan de congelación y descongelación de la población de ATP.
- Premix MgCl 2 y ATP en una relación 1: 1 justo antes de la creación de la reacción de hidrólisis de ATP.
- Preparar y etiquetar tubos de 1,5 ml para la recogida de muestras a intervalos regulares a lo largo de la reacción. Preparar tubos para recoger muestras en el tiempo 0 y en el tiempo de 15, 30,45, y 60 min.
NOTA: Como alternativa, recoger muestras solamente en el tiempo 0 y el punto final.- Añadir 245 l de tampón 1x HNG a cada tubo con el fin de diluir las muestras recogidas de las reacciones de hidrólisis de ATP 1:50.
- Preparar un baño de hielo seco y etanol para congelar rápidamente muestras para detener la reacción. En un cubo de hielo de caucho o recipiente de otro seguro (no plástico), añade varios trozos de hielo seco y se vierte con cuidado suficiente etanol 70-100% para cubrir el hielo seco.
- Diluir la proteína purificada en tampón HNG 1x, según sea apropiado (normalmente, un 5-10 mM), y mantener en hielo.
- Configurar las reacciones de hidrólisis de ATP.
- En distintos tubos de 0,5 ml para cada muestra, añadir los siguientes reactivos (en orden): H 2 O (hasta un volumen final de 30 l), 6 l 5x HNG u otro tampón, 3 l mM MgCl 100 mezcla 2 -ATP, y 0,25-5 proteína M.
- Incluir un único amortiguador-condición de control negativo en el que no se añade ninguna proteína.
- Retire 5 l de la reacción en el tiempo 0, se diluye 1:50 en el tubo de 1,5 ml preparado que contiene 245 l de tampón HNG, y congelar inmediatamente la muestra en el baño de hielo seco / etanol.
- Incubar las reacciones a 37 ° C para permitir la hidrólisis de ATP que se produzca durante 1 hora. En cada intervalo (15, 30, 45, y 60 min), retirar 5 ml de alícuotas de la reacción y añadir a los tubos de muestra etiquetados que contienen tampón HNG como en el paso 1.6.
- Al final de la reacción de hidrólisis de ATP, mover muestras diluidas a un congelador -80 ° C para el almacenamiento. Para asegurarse de que todas las muestras se congelaron por completo, espere al menos 10 minutos antes de continuar.
2. Las muestras que contienen Incubar libre pi con el reactivo de detección
- Descongelar las muestras diluidas que contienen partes alícuotas de la reacción de hidrólisis de ATP en cada punto de tiempo (obtenidos a partir de los pasos 1.6 y 1.7) a temperatura ambiente.
- Configurar una placa de 96 pocillos que contienen las muestras y patrones de fosfato.
- En una ma 0,5 mlser, diluir el estándar de fosfato (proporcionado con el reactivo de detección de Pi) de 800 mM a 40 mM mediante la adición de 5,5 l de tampón de la HNG 800 M estándar a 104,5 l. Mezclar bien y añadir 100 l de esta norma Pi 40 M a pocillo A1 de una placa de 96 pocillos.
- Añadir tampón HNG 50 l a los pocillos B1-H1 para 1: 1 diluciones en serie de la norma Pi.
- Retire 50 l de 40 mM Pi desde el pocillo A1 y añadir al tampón de ensayo en 50 l B1 así, mezclar y remover 50 l de bien B1 y C1 añadir a bien, diluciones continuas a través de G1 también. Desechar 50 l de G1 bien después de la mezcla para asegurar cada pocillo tiene el mismo volumen. Así H1 debe contener solamente tampón para crear un estándar a PI 40 a 0 M.
NOTA: Si un factor adicional (tal como un inhibidor) se ha añadido a las muestras, crear una curva estándar que contiene ese factor en el control de cambios en la liberación de fosfato o absorbancia bajo esas condiciones. - Añadir 50 l de cada sampLe por duplicado a la placa. Añadir muestras del mismo punto de tiempo en las columnas verticalmente (muestra 1 hora 0 = A2, A3; muestra 2 tiempo 0 = B2, B3) y diferentes puntos de tiempo horizontalmente. Esto permite hasta 8 muestras y 5 puntos de tiempo por placa.
- Usar una pipeta estéril para eliminar suficiente reactivo de detección de verde malaquita / molibdato de Pi añadir 100 l a cada uno de los pocillos que contienen las muestras y los estándares (reactivo necesario (ml) = 0,1 x número de muestras y los estándares) y añadir a un plato para facilitar el pipeteado utilizando una pipeta multicanal. No vierta el reactivo de detección directamente en la cápsula, ya que es probable que se produzca contaminación Pi.
- Con una pipeta multicanal, se añaden 100 l de reactivo de detección Pi a cada pocillo y mezclar cuidadosamente con la pipeta hacia arriba y abajo un número considerable de veces sin la introducción de burbujas, preferentemente en el orden de los últimos puntos de tiempo a los primeros momentos de la hora.
- Incubar la placa durante 25 min a temperatura ambiente, o de acuerdo con la madirecciones de nufacturer.
3. cuantificar Resultados El uso de un lector de microplacas
- Leer la absorbancia de las muestras a 650 nm utilizando un lector de microplaca de absorbancia.
- Hacer una curva estándar Pi. El uso de un software de gráficos, representar gráficamente los valores de absorbancia de las muestras estándar Pi frente a la concentración con el fin de encontrar una ecuación usada para resolver la cantidad de fosfato en cada muestra.
- Calcular la actividad ATPasa para cada muestra mediante la calibración con el estándar de fosfato. Fosfato liberado = (OD 650 - Intersección) / pendiente.
- Promediar el Pi total a partir de duplicados de cada muestra. Restar lectura de la absorbancia del control de tampón de sólo de este número. Multiplique esto por el factor de dilución (50 en nuestro ejemplo).
- Determinar el Pi liberado por nmol de proteína mol. Representación gráfica de estos valores para cada punto de tiempo en un ensayo de cinética debe producir ajustes lineales de al menos R = 0,99 (Figura 1); Si nOT, el ensayo puede ajustarse con más o menos proteína o un tiempo de incubación más largo o más corto.
- Representan los resultados como nmol Pi / mol de proteína / min (Figuras 2, 3), o como proteína nmol Pi / mg / min si se desea.
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Representative Results
La actividad in vitro de la ATPasa T2S EPSE puede ser estimulada por copurification de EPSE con el dominio citoplásmico de EPSL (EPSE-cytoEpsL) y la adición de la cardiolipina fosfolípido ácido 12. También es posible determinar el papel de los residuos particulares EPSE en la hidrólisis de ATP mediante la comparación de la actividad de tipo salvaje (WT) a formas variantes de la proteína utilizando este ensayo. Aquí, el efecto de sustituir dos residuos de lisina en el dominio de unión a zinc-EPSE se mide comparando la actividad de ATPasa de purificado WT EPSE-cytoEpsL a la variante EPSE K417AK419A-cytoEpsL. En la Figura 1, la liberación de fosfato procede linealmente en el transcurso de un ensayo cinético 1 hr, un requisito para la cuantificación precisa de la actividad ATPasa cinética. Figura 2 muestra los datos de las mismas muestras de proteínas purificadas como la Figura 1 que se ensayaron tres veces por duplicado y se cuantificaron en términos deLa tasa media de liberación de fosfato. Estos datos muestran que K417 y K419 parecen ser importantes para la actividad ATPasa EPSE. Sin embargo, la comparación de (no cardiolipina) las tasas de actividad ATPasa no estimuladas (Figura 3) muestra que K417 y K419 no contribuyen a la actividad basal de EPSE sino más bien a la capacidad de la proteína a ser estimulada por la cardiolipina. Las lisinas cargados positivamente en el dominio de unión a zinc-EPSE pueden interactuar directamente con los fosfolípidos cargados negativamente, lo que contribuye a la estimulación de fosfolípidos mediada por la actividad de ATPasa EPSE.
Figura 1: fosfato es liberado linealmente en un ensayo cinético ATPasa Una hora cinética cardiolipina estimulada ensayo ATPasa comparación de la liberación de fosfato de 0,5 M WT EPSE-cytoEpsL a EPSE K417AK419A-cytoEpsL con albúmina de suero bovino (BSA) ensayó como.un control negativo. Datos [cantidad de fosfato liberado (eje y) frente al tiempo (eje x)] se representaron gráficamente y se sometieron a análisis de regresión lineal. La pendiente representa la velocidad de hidrólisis de ATP. Se muestra un gráfico representativo de las ecuaciones de regresión lineal para las tres proteínas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:.. Doble lisina mutaciones en EPSE Zinc-dominio de unión Reducir estimulada ATPasa Actividad Los resultados del ensayo cardiolipina estimulada cinética 1 hr ATPasa con las mismas proteínas y condiciones que en la figura 1 los ensayos se realizaron tres veces separadas por duplicado técnica y la tasa de hidrólisis de ATP se calculó como fosfato nmol generado por minuto por M pr Otein usando ecuaciones de regresión lineal. Los resultados de medias con el error estándar se muestran. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Doble Lisina Las mutaciones en EPSE zinc-dominio de unión no interfieran con Unstimulated actividad ATPasa de una noche (16 h) punto final sin estimular (sin cardiolipina) Ensayo de ATPasa que compara la actividad de 5 M WT EPSE-cytoEpsL a EPSE K417AK419A-cytoEpsL con BSA. como control negativo. Los ensayos se realizaron en tres ocasiones separadas por duplicado técnica y resultados de medias con el error estándar se muestra. El nivel basal de actividad no estimulada EPSE ATPasa se ensayó durante un período de 16 horas es de ~ 1000 veces menor que 1 hr actividad cardiolipina estimulada cinética.e.com/files/ftp_upload/54305/54305fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este es un protocolo general para la medición de la actividad ATPasa in vitro de proteínas purificadas para la caracterización bioquímica. Este método se optimiza fácilmente; por ejemplo, el ajuste de la cantidad de proteína, tampón y composiciones de sal, temperatura, y la variación de la longitud de ensayo y los intervalos (incluyendo el aumento del número total de intervalos) puede mejorar la actividad de la cuantificación. Comercialmente disponibles malaquita reactivos basados en verde son muy sensibles y pueden detectar pequeñas cantidades de fosfato libre (~ 50 pmol de cada 100 l). Debido a la sensibilidad de este ensayo, es crucial usar artículos de plástico desechable, agua ultrapura, tampones y reactivos que carecen de contaminación de fosfato. Después de purificación de proteínas, se recomienda la exclusión de tamaño o cromatografía de intercambio iónico para mejorar la pureza de proteínas y eliminar los contaminantes.
Para las proteínas que muestran débil de la actividad ATPasa in vitro, los estimulantes pueden ser añadidos a la reacción para mejorar enzymatic actividad. Muchos factores que estimulan la actividad de ATPasa se han caracterizado. Por ejemplo, cardiolipina y otros lípidos de membrana, proteínas cliente de chaperones tales como Hsp90, y otras proteínas que intervienen en el apoyo conformaciones o entornos particulares en las que funcionan ATPasas 13-15. Nuestro laboratorio caracteriza en primer lugar EPSE mediante la purificación de monómeros con la actividad ATPasa débil en comparación con las ATPasas homólogas 6. Más tarde descubrimos que cuando EPSE se copurified con el dominio citoplásmico de EPSL, una proteína transmembrana y pareja de unión de EPSE en el sistema T2S, la adición de fosfolípidos ácidos tales como cardiolipina a la mezcla de reacción aumentó en gran medida la actividad de la ATPasa de EPSE 12. Es probable que imita las condiciones experiencias EPSE en la membrana citoplasmática que puede promover la oligomerización.
Muchas técnicas se han utilizado para cuantificar la actividad ATPasa in vitro de proteínas purificadas. γ- radiactivo
El ensayo descrito aquí consiste en un solo paso de medición liberación de fosfato, es muy sensible, y por lo general se puede realizar dentro de unos hr. También es posible prepare un sustrato que contiene verde de malaquita para evitar la compra de un kit de un proveedor comercial 6,9. Una consideración antes de emprender este ensayo es que la etapa entre añadir el reactivo de detección de fosfato y tomando lecturas de absorción es relativamente sensible al tiempo y debe estar entre 20-30 min. Este protocolo básico se puede utilizar para determinar el papel de los estimulantes (como se describe), antagonistas, subunidades, dominios y residuos específicos en la actividad de ATPasa 15,16,18,19. Este ensayo también se puede extender para medir la actividad de las fosfatasas u otras enzimas que liberan fosfato durante la catálisis. Además, este método se puede aplicar a cribado de alto rendimiento para los inhibidores de la ATPasa 20.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES buffer | Fisher | BP310-500 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Fisher | BP41325 | |
| 96-well plates (clear, flat-bottom) | VWR | 82050-760 | |
| BIOMOL Green | Enzo Life Sciences | BML-AK111 | Preferred phosphate detection reagent. Caution: irritant. |
| Microplate reader | BioTek Synergy or comparable | ||
| Prism 5 | GraphPad Software |
References
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