Abstract
Adenosintrifosfat-hydrolyserande enzymer, eller ATPaser, spelar en avgörande roll i en mångfald av cellulära funktioner. Dessa dynamiska proteiner kan generera energi för mekaniskt arbete, såsom protein trafficking och nedbrytning, transport av lösta ämnen, och cellulära rörelser. Protokollet som beskrivs här är en grundläggande analys för mätning av aktiviteten av renade ATPaser in vitro för funktionell karakterisering. Proteiner hydrolyserar ATP i en reaktion som resulterar i oorganiskt fosfat release, och mängden fosfat som frigöres därefter kvantifierades med användning av en kolorimetrisk analys. Denna mycket anpassningsprotokoll kan justeras för att mäta ATPas-aktivitet i kinetiska eller slutpunktsanalyser. Ett representativt protokoll tillhandahålls här baserat på aktiviteten och krav Epse, AAA + ATPas inblandade i typ II Sekre i bakterien Vibrio cholerae. Mängden renat protein som behövs för att mäta aktivitet, längd analysen och tidpunkten och antalet sampling intervaller, buffert och saltkomposition, temperatur, co-faktorer, stimulantia (om någon), etc. kan variera från de som beskrivs här, och därmed viss optimering kan vara nödvändig. Detta protokoll ger en grundläggande ram för kännetecknande ATPaser och kan utföras snabbt och enkelt justeras vid behov.
Protocol
1. Utför ATP hydrolysreaktion med renat protein
- Förbered Lagren av alla nödvändiga reagenser för inkubation med renat protein.
- Förbereda 5x HEPES / NaCl / glycerol (HNG) buffert innehållande 100 mM HEPES pH 8,5, 65 mM NaCl, och 5% glycerol (eller annat analysbuffert så är lämpligt).
- Förbereda 100 mM MgCl2 (eller annan metall, om ATPas är metall-beroende) i vatten.
- Bered en färsk 100 mM ATP i 200 mM Tris Base (inte justera pH vidare) med hjälp av hög renhet ATP. Alikvotera och lagra ATP lager vid -20 ° C under en längre tid än några veckor, eftersom ATP kommer att bryta ner med tiden, och avstå från att frysa och tina ATP lager.
- Foder MgCl2 och ATP på en 1: 1-förhållande strax före inrättandet av ATP hydrolysreaktionen.
- Förbered och märka 1,5 ml rör för insamling av prover med jämna mellanrum under reaktionen. Förbered rör för att samla prover vid tiden 0 och vid tiden 15, 30,45, och 60 min.
OBS: Som ett alternativ, samla prover endast vid tiden 0 och slutpunkten.- Lägg 245 l 1x HNG buffert till varje rör för att späda prover som tagits från ATP hydrolysreaktioner 1:50.
- Förbereda ett bad av torris och etanol för att snabbt frysa prover för att stoppa reaktionen. I en gummi ishink eller annan säker (icke-plast) behållare, lägga till flera stycken av torris och häll försiktigt nog 70-100% etanol för att täcka torris.
- Späd renat protein i 1x HNG buffert, när så är lämpligt (vanligen 5-10 M), och hålla på is.
- Ställ upp ATP hydrolysreaktioner.
- I separata 0,5 ml rör för varje prov, tillsätt följande reagenser (i ordning): H2O (upp till en slutlig volym av 30 pl), 6 | il 5x HNG eller annan buffert, 3 pl 100 mM MgCl2 ATP blandning, och 0,25-5 ^ iM protein.
- Innefatta en buffert enbart negativ kontroll tillstånd där inget protein tillsättes.
- Avlägsna 5 pl från reaktionen vid tiden 0, späd 1:50 i den framställda 1,5 ml rör innehållande 245 | j, l HNG-buffert, och omedelbart frysa provet i torris / etanol-bad.
- Inkubera reaktioner vid 37 ° C för att tillåta ATP-hydrolys att ske under 1 timme. Vid varje intervall (15, 30, 45, och 60 min), avlägsna 5 pl alikvoter från reaktionsblandningen och lägga till märkta provrör innehållande HNG-buffert som i steg 1,6.
- Vid slutet av ATP-hydrolysreaktionen, flytta utspädda prover till ett -80 ° C frys för förvaring. Att säkerställa att alla prover är helt frusen, vänta minst 10 minuter innan du fortsätter.
2. Inkubera Prover innehållande fritt Pi med Detection Reagent
- Tina utspädd prov innehållande ATP hydrolysreaktion alikvoter vid varje tidpunkt (erhållen från steg 1,6 och 1,7) vid rumstemperatur.
- Ställa in en 96-brunnars platta innehållande prover och fosfatstandarder.
- I en 0,5 ml tuvara, späd fosfatstandard (försedd med Pi detektionsreagens) från 800 ^ M till 40 ^ M genom att tillsätta 5,5 pl av 800 pM standarden 104,5 pl HNG buffert. Blanda väl och tillsätt 100 pl av denna 40 iM Pi standard väl A1 av en 96-brunnar.
- Tillsätt 50 l HNG buffert till brunnarna B1-H1 för 1: 1 serieutspädningar av Pi-standarden.
- Avlägsna 50 pl av 40 pM Pi från väl A1 och lägga till 50 l analysbuffert väl B1, blanda och ta bort 50 pl från väl B1 och lägg till väl C1, kvarvarande späd genom väl G1. Kasta 50 pl från väl G1 efter blandning för att säkerställa varje brunn har samma volym. Väl H1 bör innehålla endast buffert för att skapa en Pi standard 40-0 M.
OBS: Om en ytterligare faktor (såsom en hämmare) har lagts till proverna, skapa en standardkurva innehållande denna omständighet för att kontrollera förändringar i fosfat frisättning eller absorption under dessa förhållanden. - Tillsätt 50 pl av varje sample i två exemplar till plattan. Lägg prover från samma tidpunkt i kolumnerna vertikalt (prov 1 gång 0 = A2, A3, prov 2 tid 0 = B2, B3) och olika tidpunkter horisontellt. Detta gör det möjligt för upp till 8 prover och 5 tidpunkter per platta.
- Använd en steril pipett för att avlägsna tillräckligt malakitgrönt / molybdat Pi detektionsreagens för att lägga till 100 l till var och en av brunnarna innehåller prover och standarder (reagens som behövs (ml) = 0,1 x antal prover och standarder) och lägg till en maträtt för enkel pipettering med hjälp av en flerkanalig pipett. Häll inte detektionsreagenset direkt i skålen, som Pi förorening sannolikt kommer att ske.
- Med hjälp av en flerkanalig pipett, tillsätt 100 pl av Pi detektionsreagens till varje brunn och blanda genom att försiktigt pipettera upp och ner ett konsekvent antal gånger utan att införa bubblor, företrädesvis i ordning från de sista tidpunkter till de första tidpunkter.
- Inkubera plattan i 25 minuter vid rumstemperatur, eller i enlighet med den manufacturer anvisningar.
3. kvantifiera resultat med en mikroplattläsare
- Läs absorbansen av proverna vid 650 nm med användning av en absorbans mikroplattläsare.
- Gör en Pi standardkurva. Med hjälp av en grafiska program, rita absorbansvärdena för Pi standardprover versus koncentration för att hitta en ekvation som används för att lösa för mängden fosfat i varje prov.
- Beräkna ATPas-aktiviteten för varje prov genom att kalibrera med fosfatstandard. Fosfat frisatt = (OD 650 - Y avlyssna) / lutning.
- Genomsnitt totalt Pi från kopior av varje prov. Subtrahera buffert enbart kontrollens absorbans läsning från detta nummer. Multiplicera detta med utspädningsfaktorn (50 i vårt exempel).
- Bestäm nmol Pi frisatt per imol protein. Grafer för dessa värden för varje tidpunkt i en kinetisk analys bör ge linjära anfall av åtminstone R = 0,99 (fig 1); Om not kan analysen justeras med mer eller mindre protein eller en längre eller kortare inkubationstid.
- Representerar resultaten som nmol Pi / imol protein / min (figurerna 2, 3), eller som nmol Pi / ig protein / min om så önskas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aktiviteten in vitro av T2S ATPas Epse kan stimuleras genom copurification av Epse med cytoplasmadomänen av EpsL (Epse-cytoEpsL) och tillsats av den sura fosfolipider kardiolipin 12. Det är också möjligt att bestämma rollen av särskilda EPSE rester i ATP-hydrolys genom att jämföra aktiviteten för vildtyp (WT) för att variantformer av proteinet med användning av denna analys. Här, är effekten av att substituera två lysinrester i EPSE zinkbindande domänen mäts genom att jämföra ATPas-aktiviteten av renad WT EPSE-cytoEpsL till EPSE K417AK419A-cytoEpsL varianten. I figur 1, fortsätter fosfatfrigör linjärt under loppet av en 1 timme kinetisk analys, ett krav för noggrann kvantifiering av kinetisk ATPas-aktivitet. Figur 2 visar data från samma renade proteinprover som figur 1 som analyserades tre gånger i duplikat och kvantifierades i form avmedelvärdet hastigheten av fosfat release. Dessa data visar att K417 och K419 verkar vara viktigt för Epse ATPas-aktivitet. Emellertid visar jämförelse av ostimulerade (inga kardiolipin) ATPas aktivitetspriser (Figur 3) att K417 och K419 inte bidrar till Epse basala aktivitet utan snarare förmågan hos det protein som skall stimuleras av kardiolipin. De positivt laddade lysiner i Epse zinkbindande domänen kan direkt interagera med negativt laddade fosfolipider, vilket bidrar till den fosfolipid-medierad stimulering av Epse ATPas-aktivitet.
Figur 1: Fosfat är släppt linjärt i en Kinetic ATPas analys En timme kinetisk kardiolipin-stimulerad ATPas-analys jämföra fosfatfrigörande av 0,5 iM WT Epse-cytoEpsL till Epse K417AK419A-cytoEpsL med bovinserumalbumin (BSA) analyserades som.en negativ kontroll. Uppgifter [mängden frisatt fosfat (y-axel) mot tiden (x-axeln)] avsattes och utsattes för linjär regressionsanalys. Lutningen representerar hastigheten av ATP-hydrolys. En representativ kurva med linjär regressionsekvationer för de tre proteinerna visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:.. Dubbel Lysin Mutationer i EPSE Zink-Binding Domain Minska stimulerad ATPas-aktivitet Resultat av 1 hr kinetiska kardiolipin-stimulerad ATPas-analys med samma proteiner och betingelser som i figur 1 Analyser utfördes tre separata gånger i teknisk duplikat och den graden av ATP hydrolys beräknades som nmol fosfat som genereras per minut per iM pr otein användning av linjära regressionsekvationer. Den genomsnittliga resultat med standardfel visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Dubbel Lysin Mutationer i EPSE Zink-Binding Domain inte stör ostimulerade ATPas-aktivitet över natten (16 h) endpoint ostimulerad (ingen kardiolipin) ATPas-analys som jämför aktiviteten av 5 pM WT EPSE-cytoEpsL till EPSE K417AK419A-cytoEpsL med BSA. som en negativ kontroll. Analyser genomfördes tre separata gånger i teknisk duplikat och medelvärden resultat med standardfel visas. Den basala nivån av ostimulerad EPSE ATPas-aktivitet analyserades under en 16 h period är ~ 1000-faldigt lägre än 1 hr kinetisk kardiolipin-stimulerad aktivitet.e.com/files/ftp_upload/54305/54305fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta är ett allmänt protokoll för att mäta in vitro ATPas-aktiviteten hos renade proteiner för biokemisk karakterisering. Denna metod kan enkelt optimeras; till exempel, kan justera mängden protein, buffert och saltkompositioner, temperatur och varierande analys längd och intervall (däribland ökade det totala antalet intervall) förbättra aktivitet kvantifiering. Kommersiellt tillgängliga malakitgrönt baserade reagens är mycket känsliga och kan detektera små mängder av fri fosfat (~ 50 pmol i 100 | j, l). På grund av denna analys känslighet, är det avgörande att använda engångsplastartiklar, ultrarent vatten, buffertar och reagens som saknar kontaminerande fosfat. Efter rening av proteiner, är storleksuteslutningskromatografi eller jonbyteskromatografi rekommenderas för att förbättra proteinrenhet och avlägsna föroreningar.
För proteiner som uppvisar svag in vitro ATPas-aktivitet, kan stimulantia tillsättas till reaktionen för att förbättra enzymatic aktivitet. Många faktorer som stimulerar ATPas-aktivitet har karakteriserats. Till exempel, kardiolipin och andra membranlipider, klient proteiner av chaperoner såsom Hsp90 och andra proteiner involverade i att stödja särskilda konforma eller miljöer där ATPaser fungera 13-15. Vårt laboratorium först präglas Epse genom att rena monomerer med svag ATPas aktivitet jämfört med homologa ATPaser 6. Senare upptäckte vi att när EPSE ades copurified med den cytoplasmiska domänen av EpsL, ett transmembranprotein och bindningspartner till EPSE i T2S-systemet, tillsättning av sura fosfolipider såsom kardiolipin till reaktionsblandningen kraftigt ökade ATPas-aktiviteten hos EPSE 12. Denna sannolika efterliknar villkoren Epse erfarenheter cytoplasmamembranet som kan främja oligomerisering.
Många tekniker har använts för att kvantifiera in vitro ATPas-aktiviteten av renade proteiner. radioaktivt γ-
Den analys som beskrivs här består av endast ett släpp mätsteg fosfat, är mycket känslig, och kan typiskt utföras inom några få timmar. Det är också möjligt att prepare en malakitgrönt innehållande substrat för att undvika att köpa ett kit från en kommersiell leverantör 6,9. Ett övervägande innan man vidtar denna analys är att steget mellan att lägga fosfatdetektionsreagens och med absorbansmätningar är relativt tidskänsliga och måste vara mellan 20-30 minuter. Denna grundläggande protokoll kan användas för att bestämma rollen av stimulantia (såsom beskrivits), antagonister subenheter, domäner och specifika rester i ATPas-aktivitet 15,16,18,19. Denna analys kan också utvidgas till att mäta aktiviteten av fosfataser eller andra enzymer som frigör fosfat under katalys. Dessutom kan denna metod tillämpas på high-throughput screening för ATPas-inhibitorer 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES buffer | Fisher | BP310-500 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Fisher | BP41325 | |
| 96-well plates (clear, flat-bottom) | VWR | 82050-760 | |
| BIOMOL Green | Enzo Life Sciences | BML-AK111 | Preferred phosphate detection reagent. Caution: irritant. |
| Microplate reader | BioTek Synergy or comparable | ||
| Prism 5 | GraphPad Software |
References
- Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (7), 519-529 (2005).
- Baker, T. A., Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochimica et Biophysica Acta. 1823 (1), 15-28 (2012).
- Maxson, M. E., Grinstein, S. The vacuolar-type H+-ATPase at a glance - more than a proton pump. J Cell Sci. 127 (23), 4987-4993 (2014).
- Planet, P. J., Kachlany, S. C., DeSalle, R., Figurski, D. H. Phylogeny of genes for secretion NTPases: Identification of the widespread tadA subfamily and development of a diagnostic key for gene classification. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2503-2508 (2001).
- Robien, M. A., Krumm, B. E., Sandkvist, M., Hol, W. G. J. Crystal Structure of the Extracellular Protein Secretion NTPase EpsE of Vibrio cholerae. J Mol Biol. 333 (3), 657-674 (2003).
- Camberg, J. L., Sandkvist, M. Molecular analysis of the Vibrio cholerae type II secretion ATPase EpsE. J Bacteriol. 187 (1), 249-256 (2005).
- Sandkvist, M. Type II secretion and pathogenesis. Infect Immun. 69 (6), 3523-3535 (2001).
- Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Webb, M. R. Direct, Real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).
- Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: An improvement and evaluation. J Biochem Biophys Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
- Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. A microassay for ATPase. Anal Biochem. 169 (2), 312-318 (1988).
- Harder, K. W., Owen, P., Wong, L. K. H., Aebersold, R., Clark-Lewis, I., Jirik, F. R. Characterization and kinetic analysis of the intracellular domain of human protein tyrosine phosphatase β (HPTP β) using synthetic phosphopeptides. Biochem J. 298 (2), 395-401 (1994).
- Camberg, J. L., Johnson, T. L., Patrick, M., Abendroth, J., Hol, W. G., Sandkvist, M. Synergistic stimulation of EpsE ATP hydrolysis by EpsL and acidic phospholipids. EMBO J. 26 (1), 19-27 (2006).
- McLaughlin, S. H., Smith, H. W., Jackson, S. E. Stimulation of the weak ATPase activity of human Hsp90 by a client protein. J Mol Biol. 315 (4), 787-798 (2002).
- Shiue, S., Kao, K., Leu, W., Chen, L., Chan, N., Hu, N. XpsE oligomerization triggered by ATP binding, not hydrolysis, leads to its association with XpsL. EMBO J. 25 (7), 1426-1435 (2006).
- Ghosh, A., Hartung, S., van der Does, C., Tainer, J. A., Albers, S. V. Archaeal flagellar ATPase motor shows ATP-dependent hexameric assembly and activity stimulation by specific lipid binding. Biochem J. 437 (1), 43-52 (2011).
- Savvides, S. N., et al. VirB11 ATPases are dynamic hexameric assemblies: new insights into bacterial type IV secretion. EMBO J. 22 (9), 1969-1980 (2003).
- Sanghera, J., Li, R., Yan, J. Comparison of the luminescent ADP-Glo assay to a standard radiometric assay for measurement of protein kinase activity. Assay Drug Dev Techn. 7 (6), 615-622 (2009).
- Sherman, D. J., et al. Decoupling catalytic activity from biological function of the ATPase that powers lipopolysaccharide transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), 4982-4987 (2014).
- Zhang, X., et al. Altered cofactor regulation with disease-associated p97/VCP mutations. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (14), E1705-E1714 (2015).
- Rowlands, M. G., Newbatt, Y. M., Prodromou, C., Pearl, L. H., Workman, P., Aherne, W. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Anal Biochem. 327 (2), 176-183 (2004).
