Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ölçme Published: August 23, 2016 doi: 10.3791/54305
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan

Abstract

ATP-hidrolize edici enzimler ya da ATPaz, hücresel fonksiyonların çeşitli bir dizi çok önemli bir rol oynar. Bu dinamik proteinler, protein kaçakçılığı ve yıkımı, madde geçişinde ve hücresel hareketler gibi mekanik çalışmaları için enerji üretebilir. Burada açıklanan protokol fonksiyonel karakterizasyon için saflaştınldı ATPazların in vitro aktivitesini ölçmek için basit bir testtir. Proteinler, inorganik fosfat serbest sonuçlanan bir reaksiyon ATP hidroliz ve serbest fosfat miktarının bir kolorimetrik tahlil kullanılarak hesaplanır. Bu son derece uyumlu bir protokol kinetik ve bitiş noktası deneylerinde ATPaz aktivitesini ölçmek için ayarlanabilir. Temsili bir protokol aktivitesi ve Epse gereklerine göre burada sağlanan, AAA + ATPaz bakterisinin Vibrio cholerae Tip II salgılanması yer. aktivitesini ölçmek için ihtiyaç duyulan pürifiye protein miktarı, tayinin uzunluğu ve SA zamanlaması ve sayısımpling aralıkları, tampon ve tuzlu bileşim olup, sıcaklık, ko-faktörler, uyarıcı (eğer varsa) gibi burada açıklanan farklı olabilir, ve bu nedenle bazı optimizasyon gerekli olabilir. Bu protokol karakterize ATPaz'ları için temel bir çerçeve sağlar ve hızlı bir şekilde gerçekleştirilir ve kolay gerektiğinde ayarlanabilir.

Protocol

1. Saflaştırılmış proteinin ATP hidroliz reaksiyonu gerçekleştirme

  1. Saf Protein Kuluçka İçin Gerekli Tüm Reaktifler stokları hazırlayın.
    1. 100 mM HEPES pH 8.5, 65 mM NaCl ve% 5 gliserol (veya başka bir deney tamponu gibi uygun olduğunda) içeren 5x HEPES / NaCl / gliserol (KŞÇ) tamponu hazırlayın.
    2. Su (ATPaz metal bağımlı olup olmadığını, ya da başka metal), 100 mM MgCl2 hazırlayın.
    3. yüksek saflıkta ATP kullanılarak (daha fazla pH ayarı yoktur) 200 mM Tris Base taze 100 mM ATP hazırlayın. Kısım ATP zamanla yıkmak gibi, birkaç hafta daha uzun süre -20 ° C'de ATP stok depolamak ve dondurma ve ATP stok çözdürme kaçınmalı ve.
    4. 1 at Premix MgCl2 ve ATP: 1 oranında sadece ATP hidroliz reaksiyonu kurmadan önce.
  2. Hazırlayın ve reaksiyonun boyunca düzenli aralıklarla numuneler toplanması için 1.5 ml tüpler etiket. 0 zamanında ve zaman 15, 30 numune toplamak için tüpler hazırlamak,45 ve 60 dakika.
    Not: Alternatif olarak, sadece 0 ve uç noktada numune toplayın.
    1. ATP hidroliz reaksiyonları 01:50 alınan numuneler seyreltmek için her bir tüpe 245 ul 1x KŞÇ tampon ekleyin.
  3. hızlı reaksiyonu durdurmak için numunelerin dondurma için kuru buz etanol banyo hazırlayın. Bir lastik buz kovası veya diğer kasa (plastik olmayan) bir kapta, kuru buz birkaç adet ekleyebilir ve dikkatle kuru buz karşılamak için yeterli% 70-100 etanol dökün.
  4. Uygun (genellikle 5-10 uM) olarak, 1x KŞÇ tamponunda saflaştırılmış protein sulandırmak ve buz üzerinde tutmak.
  5. ATP hidroliz reaksiyonları ayarlayın.
    1. Her bir örnek için ayrı 0.5 ml tüpler içinde (sırayla) aşağıdaki reaktifler ekleyin: 6 ul 5x hng veya başka bir tampon, 3 ul 100 mM MgCl2 -ATP karışımı (nihai 30 ul hacme kadar), H2O, ve 0.25-5 uM proteini.
    2. Resim proteini ilave edildiği bir tampon yalnızca negatif kontrol koşulu içerir.
  6. 0 zamanında reaksiyon 5 ul çıkarın 245 ul KŞÇ tampon içeren hazır 1.5 ml tüp içinde 1:50 seyreltilmiş ve hemen kuru buz / etanol banyosu içinde örnek dondurma.
  7. 37 ° C 'de reaksiyonlar ATP hidrolizi, 1 saat boyunca oluşmasına izin vermek için inkübe edin. Her bir aralık (15, 30, 45 ve 60 dakika), tepkime 5 ul alikotları çıkarın ve adım 1.6 olarak KŞÇ tampon içeren etiketli numune tüpleri ekle.
  8. ATP hidroliz reaksiyonunun sonunda, depolama için bir -80 ° C dondurucu seyreltilmiş numune hareket eder. tüm örnekler tamamen donmuş sağlamak için, devam etmeden önce en az 10 dakika bekleyin.

Algılama Reaktif Ücretsiz Pi İçeren 2. inkübe Örnekleri

  1. Her bir zaman noktasında ATP hidroliz reaksiyonu kısımlarını ihtiva eden çözülme seyreltilmiş numuneler, oda sıcaklığında (adım 1.6 ve 1.7 de elde edilmiş).
  2. örnekler ve fosfat standartları ihtiva eden 96 oyuklu bir plaka kurulumu.
    1. 0.5 ml tu800 uM standart ul 104.5 ile KŞÇ tampon 5.5 ul ekleyerek 800 uM uM 40 ila (Pi algılama reaktifi ile sağlanır) fosfat standardını sulandırmak olmak. İyice karıştırın ve 96 oyuklu bir plaka de A1, bu 40 uM Pi standart 100 ul ilave edin.
    2. 1 için kuyuların B1-H1 50 ul KŞÇ tamponu ekleyin: Pi standardının 1 seri dilüsyonları.
    3. A1 kuyusunda 40 uM Pi 50 ul çıkarın ve iyi B1 50 ul deney tamponu eklemek karıştırın ve iyi B1 50 ul kaldırmak ve iyi G1 ile, iyi C1 devam dilüsyonları ekleyin. Her kuyu aynı hacme sahip olmak için karıştırmadan sonra kuyu G1 50 ul atın. Peki H1 40 0 ​​uM bir Pi standardı oluşturmak için tek tampon içermelidir.
      Not: bir diğer faktör (örneğin, bir önleyici olarak) numunelere ilave edilmişse, bu koşullar altında fosfat serbest ya absorbans değişiklikleri kontrol etmek için bu faktör içeren bir standart eğri oluşturmak.
    4. Her samp 50 ul ekleplaka yinelenen le. ve farklı zaman noktalarında yatay sütunlar aynı zaman noktasında dikey (Numune 2 kez 0 = B2, B3 örnek 1 kez 0 = A2, A3) numune ekleyin. Bu kadar 8 örnekleri ve plaka başına 5 kez puan için izin verir.
  3. Numuneler ve standartlar içeren oyuklara (reaktif gerekli (mi) = numune ve standartlar 0,1 x sayısı) her birine, 100 ul kadar malakit yeşili / molibdat Pi tespit reajanı kaldırmak için steril bir pipet kullanın ve kolay pipetleme için bir çanak ekle Çok kanallı bir pipet kullanılarak. Pi kirlenme olasılığı yüksektir olarak, çanak içine doğrudan algılama reaktifi dökmeyin.
  4. Bir çok kanallı pipet kullanarak, ilk kez noktalarına son kez noktalarından tercihen sırayla, tanıtan kabarcıkları olmadan dikkatlice yukarı pipetleme ve zaman tutarlı bir sayıya indirdi de her Pi algılama reaktif 100 ul ekleyin ve karıştırın.
  5. Oda sıcaklığında 25 dakika boyunca inkübasyona bırakılır, veya MA görenufacturer en tarifi.

Bir Mikroplaka Okuyucusu Kullanma 3. ölçmek Sonuçları

  1. absorbans mikro levha okuyucusu kullanarak 650 nm'de numunelerin emme okuyun.
  2. Bir Pi standart eğri olun. Bir grafik yazılımı kullanılarak, her bir örnek fosfat miktarı için çözmek için kullanılan denklem bulmak için konsantrasyonuna karşı Pi, standart numune için absorbans değerleri grafik.
  3. fosfat standart kalibrasyon her numune için ATPaz aktivitesinin hesaplanması. Fosfat yayınlandı = (OD 650 - Y kesişimi) / eğim.
    1. Her numunenin çiftleri toplam Pi ortalama. Bu numaradan tampon sadece denetimin absorbans okuma çıkartın. seyreltme faktörü ile (bizim örneğimizde 50) bu çarpın.
    2. ľmol protein başına salınan nmol Pi belirleyin. Kinetik deneyde, her bir zaman noktası için, bu değerleri grafik en az R = 0.99 (şekil 1) doğrusal uyan vermelidir; n iseOT, deney veya daha az protein ya da daha uzun veya daha kısa kuluçka süresi ile ayarlanabilir.
  4. Nmol Pi / umol protein / dak gibi sonuçları istenirse, ya da nmol Pi / mg protein / dak olarak (3 Şekil 2,) temsil eder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

T2S ATPaz EPSE in vitro aktivitesi sitoplazmik EpsL (EPSE-cytoEpsL) alanında ve asidik fosfolipid kardiyolipin 12 ilavesi ile EPSE bölgesinin copurification ile stimüle edilebilir. Deney kullanılarak protein varyant formlarının vahşi tip (WT) etkinliğinin kıyaslanmasıyla ATP hidroliz özellikle EPSE kalıntılarının rolü belirlemek için de mümkündür. Burada, EPSE, çinko bağlayıcı alan olarak iki lisin artığına ikame etkisi EPSE K417AK419A-cytoEpsL varyantına saflaştırılarak WT EPSE-cytoEpsL ATPaz aktivitesi karşılaştırarak ölçülmüştür. Şekil 1 'de, fosfat salma 1 saat kinetik deneyde, kinetik ATPaz aktivitesinin tayini için daha kesin bir gereklilik boyunca doğrusal olarak ilerler. Iki kez, üç kez tahlil edilir ve nicelleştirilmiştir şekil 1 ile aynı saflaştırılmış protein örneklerinden Şekil 2 veriler, Şekil açısındanfosfat salınımı ortalama oran. Bu veriler, K417 ve K419 EPSE ATPaz aktivitesi için önemli gibi görünmektedir göstermektedir. Bununla birlikte, uyarılmamış (Resim kardiyolipin) ATPaz aktivitesi oranlarının karşılaştırılması (Şekil 3) K417 ve K419 EPSE bazal aktivite değil, kardiyolipin tarafından uyarılabilir proteinin yeteneğine katkıda bulunmadığını göstermektedir. EPSE çinko bağlayıcı alan pozitif yüklü lizinlerinin doğrudan ve böylece EPSE ATPaz aktivitesi fosfolipid aracılı uyarılmasına katkıda negatif yüklü fosfolipidler ile etkileşime girebilir.

Şekil 1
Şekil 1:. Fosfat bir saat kinetik kardiyolipin uyarılmış sığır serum albümini ile EPSE K417AK419A-cytoEpsL 0.5 uM WT EPSE-cytoEpsL fosfat serbest karşılaştırırken ATPase Deneyi (BSA), bir kinetik ATPase Deneyi lineer Çıkış şekilde deneye tabi tutulurBir negatif kontrol. Veriler [zamana karşı serbest fosfat (y-ekseni) (x-ekseni) miktarı] çizilmiştir ve doğrusal regresyon analizine tabi tutulmuştur. eğimi ATP hidroliz hızını temsil eder. Üç proteinlerin doğrusal regresyon denklemleri ile temsil grafiği gösterilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2.:., Çift lisinin Mutasyonlar EPSE Alan Uyarılmış ATPaz aktivitesini azaltmak Çinko bağlayıcı Şekil 1 'deki ile aynı protein ve koşullara 1 saat kinetik kardiyolipin uyarılmış ATPase deneyinde sonuçları Tahliller, teknik yinelenen ve üç ayrı kez yapıldı ATP hidroliz hızı iM pr başına dakikada üretilen nmol fosfat olarak hesaplanmıştır lineer regresyon denklemleri kullanılarak otein. Standart hata ile ortalama sonuçları görüntülenir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3: çift lizin Mutasyonlar EPSE çinko bağlayıcı alan olarak Stimüle edilmemiş ATPaz aktivitesine müdahale Not gece boyunca (16 saat) uyarılmamış uç BSA ile EPSE K417AK419A-cytoEpsL 5 uM WT EPSE-cytoEpsL etkinliği ile karşılaştırılması (Resim kardiyolipin) ATPaz testi. bir negatif kontrol olarak. Tahliller teknik nüsha halinde üç ayrı kez yapıldı ve standart hata ile ortalama sonuçlar gösterilmektedir. 16 saatlik bir süre içinde analiz edildi uyarılmamış EPSE ATPaz faaliyetinin bazal seviyesi ~ daha düşük 1 saat kinetik kardiyolipin uyarılmış aktivitesi 1000 kat.e.com/files/ftp_upload/54305/54305fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu biyokimyasal karakterizasyonu için saflaştırılmış proteinlerin in vitro ATPaz aktivitesi ölçüm için genel bir protokoldür. Bu yöntem kolayca optimize edilmiştir; Örneğin protein, tampon ve tuzlu bileşimlerinde, sıcaklık ve deney uzunluğu ve değişken (aralıklarının toplam sayısını da dahil olmak üzere), aralıklarla miktarının ayarlanması aktivitesi kantitatif artırabilir. Ticari olarak temin edilebilen malakit yeşili bazlı reaktifler oldukça duyarlıdır, ve fosfat az miktarda tespit edilebilir (~ 100 ul 50 mmol). Çünkü bu tahlilde hassasiyeti nedeniyle, tek kullanımlık plastik eşya, ultra saf su, tamponlar ve fosfat kirletici yoksun reaktifler kullanmak için çok önemlidir. saflaştırılması proteinlerin sonra boyut dışlama ya da iyon değiştirme kromatografisi proteinin saflığını arttırmak ve kirleri çıkarmak için tavsiye edilir.

Nitro ATPaz aktivitesi zayıf gösteren proteinleri için, uyarıcı e arttırmak için reaksiyona ilave edilebilirnzymatic aktivitesi. ATPaz aktivitesi stimüle birçok faktör ile karakterize edilmiştir. Örneğin, kardiyolipin ve diğer membran lipitleri için, örneğin Hsp90 olarak şaperonlar ve özellikle şekillerini veya ortamları destek alan diğer proteinler client proteinlerin içinde ATPazlar 13-15 işlev görmektedir. Laboratuvarımız ilk homolog ATPazların 6 ile karşılaştırıldığında zayıf ATPaz aktivitesi ile monomerlerin arındırarak Epse karakterize edilir. Daha sonra EPSE T2S sisteminde EpsL sitoplazmik alanına, bir transmembran proteini ve EPSE bağlanma ortağı ile copurified zaman, bu reaksiyon karışımına kardiyolipin gibi asidik fosfolipidler eklenmesi önemli ölçüde EPSE 12 ATPaz aktivitesi arttığını keşfettik. Bu büyük olasılıkla taklit oligomerizasyon teşvik edebilir sitoplazmik membran koşullar Epse deneyimleri.

Bir çok teknik saflaştırılmış proteinler in vitro ATPase aktivitesini ölçmek için kullanılmıştır. Radyoaktif γ- 14,16 ölçmek için uygulamaya konmuştur Ancak, güvenlik bir endişe ve radyoaktivite laboratuvar kullanımı için onay gerektirir. Çok hassas iken, γ- 32 P kısa yarılanma ömrü, aynı zamanda, bir dezavantajdır. Diğer ticari fosfat saptama yöntemleri, bir flüoresan ürünün oluşumu kullanan olanlar gibi, mevcuttur. Bu yöntemlerin bazıları da çok duyarlıdır, ancak sık sık daha az zaman içinde stabil olan reaktifler ile sonuçlanan reaksiyon diğer enzimlerin ilave edilmesini gerektirir. Buna ek olarak, kitler, stabil bir lüminesans bazlı bir tepkime ATP hidroliz sırasında serbest ADP tespit mevcuttur, ancak bu faaliyet 17 düşük seviyelerde ATPazların için daha az ideal olabilir.

Burada tarif edilen deney, tek bir fosfat salma ölçümü adım oluşur çok hassastır ve tipik olarak bir kaç saat içerisinde gerçekleştirilebilir. Bu hazırlık aşamasında da mümkündürBir malakit yeşil içeren substrat yeniden ticari bir satıcıdan 6,9 bir kit satın önlemek için. Bu testte girişmeden önce biri dikkate fosfat algılama reaktifi eklenerek ve absorbans okumaları alarak arasındaki adım nispeten zaman duyarlıdır ve 20-30 dakika arasında olmalıdır olmasıdır. Bu basit protokol (tarif edildiği gibi) ATPaz aktivitesi 15,16,18,19 antagonistleri, alt birimleri, etki ve spesifik artıkları uyarıcı rolünü tespit etmek için kullanılabilir. Bu deney aynı zamanda kataliz sırasında, fosfat fosfataz ya da başka enzimlerin aktivitesini ölçmek için uzatılabilir. Buna ek olarak, bu yöntem, ATPaz inhibitörleri için 20 yüksek verimli tarama uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES buffer Fisher BP310-500
Sodium chloride Fisher BP358-212
Magnesium chloride Fisher BP214-500
Adenosine triphosphate (ATP) Fisher BP41325
96-well plates (clear, flat-bottom) VWR 82050-760
BIOMOL Green Enzo Life Sciences BML-AK111 Preferred phosphate detection reagent. Caution: irritant.
Microplate reader BioTek Synergy or comparable
Prism 5 GraphPad Software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (7), 519-529 (2005).
  2. Baker, T. A., Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochimica et Biophysica Acta. 1823 (1), 15-28 (2012).
  3. Maxson, M. E., Grinstein, S. The vacuolar-type H+-ATPase at a glance - more than a proton pump. J Cell Sci. 127 (23), 4987-4993 (2014).
  4. Planet, P. J., Kachlany, S. C., DeSalle, R., Figurski, D. H. Phylogeny of genes for secretion NTPases: Identification of the widespread tadA subfamily and development of a diagnostic key for gene classification. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2503-2508 (2001).
  5. Robien, M. A., Krumm, B. E., Sandkvist, M., Hol, W. G. J. Crystal Structure of the Extracellular Protein Secretion NTPase EpsE of Vibrio cholerae. J Mol Biol. 333 (3), 657-674 (2003).
  6. Camberg, J. L., Sandkvist, M. Molecular analysis of the Vibrio cholerae type II secretion ATPase EpsE. J Bacteriol. 187 (1), 249-256 (2005).
  7. Sandkvist, M. Type II secretion and pathogenesis. Infect Immun. 69 (6), 3523-3535 (2001).
  8. Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Webb, M. R. Direct, Real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).
  9. Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: An improvement and evaluation. J Biochem Biophys Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
  10. Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. A microassay for ATPase. Anal Biochem. 169 (2), 312-318 (1988).
  11. Harder, K. W., Owen, P., Wong, L. K. H., Aebersold, R., Clark-Lewis, I., Jirik, F. R. Characterization and kinetic analysis of the intracellular domain of human protein tyrosine phosphatase β (HPTP β) using synthetic phosphopeptides. Biochem J. 298 (2), 395-401 (1994).
  12. Camberg, J. L., Johnson, T. L., Patrick, M., Abendroth, J., Hol, W. G., Sandkvist, M. Synergistic stimulation of EpsE ATP hydrolysis by EpsL and acidic phospholipids. EMBO J. 26 (1), 19-27 (2006).
  13. McLaughlin, S. H., Smith, H. W., Jackson, S. E. Stimulation of the weak ATPase activity of human Hsp90 by a client protein. J Mol Biol. 315 (4), 787-798 (2002).
  14. Shiue, S., Kao, K., Leu, W., Chen, L., Chan, N., Hu, N. XpsE oligomerization triggered by ATP binding, not hydrolysis, leads to its association with XpsL. EMBO J. 25 (7), 1426-1435 (2006).
  15. Ghosh, A., Hartung, S., van der Does, C., Tainer, J. A., Albers, S. V. Archaeal flagellar ATPase motor shows ATP-dependent hexameric assembly and activity stimulation by specific lipid binding. Biochem J. 437 (1), 43-52 (2011).
  16. Savvides, S. N., et al. VirB11 ATPases are dynamic hexameric assemblies: new insights into bacterial type IV secretion. EMBO J. 22 (9), 1969-1980 (2003).
  17. Sanghera, J., Li, R., Yan, J. Comparison of the luminescent ADP-Glo assay to a standard radiometric assay for measurement of protein kinase activity. Assay Drug Dev Techn. 7 (6), 615-622 (2009).
  18. Sherman, D. J., et al. Decoupling catalytic activity from biological function of the ATPase that powers lipopolysaccharide transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), 4982-4987 (2014).
  19. Zhang, X., et al. Altered cofactor regulation with disease-associated p97/VCP mutations. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (14), E1705-E1714 (2015).
  20. Rowlands, M. G., Newbatt, Y. M., Prodromou, C., Pearl, L. H., Workman, P., Aherne, W. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Anal Biochem. 327 (2), 176-183 (2004).

Tags

Biyokimya Sayı 114 ATP ATPaz fosfat aktivite enzim protein
ölçme<em&gt; İn Vitro</emEnzimatik Karakterizasyonu için&gt; ATPaz Aktivitesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rule, C. S., Patrick, M., Sandkvist, … More

Rule, C. S., Patrick, M., Sandkvist, M. Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization. J. Vis. Exp. (114), e54305, doi:10.3791/54305 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter