Protocol
Todos los estudios con animales han sido aprobados por Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión de Texas Tech University Health Sciences Center y siguió las directrices que se describen en la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio", publicado por los Institutos Nacionales de Salud. Utilice ocho a doce semanas de edad ratones BALB / c hembra que están disponibles comercialmente. Inyectar 1 x 10 5 4T1 o 1 x 10 5 4T1 células que expresan GFP, que se puede adquirir de varios fabricantes, en la almohadilla de grasa mamaria.
1. Cultura de 4T1 y 4T1-GFP Células y Preparación de tumor de células de suspensión para inyección 14
- 4T1 y 4T1-GFP de Cultivos Celulares
NOTA: Realizar todos los pasos que utilizan soluciones estériles en un flujo de aire laminar (LAF) del gabinete de bioseguridad a menos que se especifique lo contrario.- Mantener las células 4T1 y 4T1-GFP en medio RPMI suplementado con calor suero fetal inactivado bovino al 10% y 100 U / ml de penicilinaG y 100 mg de sulfato de estreptomicina / ml.
NOTA: Determinar un número de pases por contar cada tripsinización y chapado de las células. Es importante el uso de células con el mismo número de pases para todos los experimentos de ratón, como el número de pasajes afecta a la tumorigenicidad de células y el potencial metastásico. - Antes de inyecciones de células retire el T75 cm 2 frasco, que contiene las células tumorales en el 80% de confluencia, a partir de un medio de incubadora y aspirado. Añadir 10 ml de PBS y girar el matraz suavemente para lavar medio restante, y luego aspirar PBS.
- Añadir 2 ml de 0,25% de tripsina con EDTA al matraz y la inclinación para distribuir la solución uniformemente sobre la superficie y se incuban en un incubador humidificado durante 3 min a 37 ° C con 5% de CO 2.
- Toque en el matraz para facilitar el desprendimiento de las células y añadir 8 ml de medio fresco. Pipetear arriba y abajo varias veces para interrumpir grumos y obtener una suspensión de células individuales.
- Centrifugar las células durante 5 min. a 500 xg a TA.Aspirar el sobrenadante y lavar las células en 10 ml de PBS.
- Pipetear arriba y abajo varias veces para interrumpir grumos y obtener una suspensión de células individuales. Tomar 100 l de una suspensión de células y contar las células utilizando el analizador de la viabilidad celular según las instrucciones del fabricante.
- Calcular el número de células necesarias para todas las inyecciones utilizando la fórmula: 10 5 células por ratón x # de ratones utilizados en un experimento (siempre preparar células adicionales para estar en un lado seguro).
- Centrifugar las células como en 1.1.5. Eliminar el sobrenadante a través de células de aspiración y resuspender en la cantidad de PBS fresco necesario para obtener una concentración final de células de 1 x 10 6 células / ml. Mantener la suspensión de células en hielo hasta que esté lista para la inyección.
- Mantener las células 4T1 y 4T1-GFP en medio RPMI suplementado con calor suero fetal inactivado bovino al 10% y 100 U / ml de penicilinaG y 100 mg de sulfato de estreptomicina / ml.
- 4T1 4T1-GFP o celulares procedimientos de inyección-ratón
- El día antes de la inyección de células tumorales, anestesiar los ratones en una cámara de inducción con 3% de isoflurano. Una vez que los ratones duermen y respiran regularmente, lugar tque el ratón sobre una almohadilla quirúrgica con la nariz en el interior del cono de la nariz, y conectarlo con el vaporizador de isoflurano. Mantener la anestesia con isoflurano al 2,5%. Apriete la punta del ratón para asegurarse de que el ratón se anestesia.
- Aplicar crema de depilación utilizando un hisopo de algodón para el sitio de inyección (pectoral almohadilla de grasa mamaria derecha) y espere durante 2 minutos. Limpiar el sitio usando una toalla de papel húmeda, colocar el ratón en la jaula y controlar a un animal hasta que recupere la conciencia suficiente para mantener el decúbito esternal.
- En el día de la inyección, anestesiar a los ratones como en 1.2.2 y colocar en la plataforma quirúrgica.
- Vortex el tubo que contiene las células tumorales para obtener la suspensión celular uniforme. Aspirar 100 l de una suspensión de células, que contienen 1 x 10 5 células tumorales, en una jeringa de 0,5 ml de insulina (29 g, 12,7 mm de longitud con aguja).
- Levantar la piel usando el índice y el dedo pulgar cerca del 2 y 3 de pezón, insertar la aguja de la jeringa en el Mammarla capa de grasa y justo debajo de la tercera boquilla de debajo de la piel entre los dedos e inyectar las células lentamente para formar una burbuja (inyección subcutánea).
- Coloque el ratón en la jaula después de la inyección y el monitor como en el punto 1.2.2.
- Crecimiento Tumoral monitoreo
- Las mediciones de la pinza 14
NOTA: Inyectados o 4T1 4T1-GFP células forman tumores de mama agresivo. Por lo general, los tumores palpables parecen ~ en el día 4 - 5 después de la inoculación de células. Las células 4T1-GFP forman tumores que crecen más lento y dan metástasis posterior. Mida el tumor de dos a tres veces a la semana. Si el estado clínico de los animales se deteriora, los animales pierden peso corporal superior al 10%, tumores superan el 10% del peso corporal o ulcerarse, la eutanasia a los ratones inmediatamente.- Anestesiar a un ratón como en 1.2.1., Pesar, su lugar en la plataforma quirúrgica y humedecer la zona con 70% de etanol.
- Se palpa tumor en el sitio de inyección (4 - 5 días después de la inoculación de células). <li> Medir el diámetro más grande (D) y de menor diámetro (d1) con un calibrador.
- Calcular el volumen del tumor utilizando la fórmula: Volumen = (DX X d1 d1) / 2 mm 3. Seguimiento de la recuperación de la anestesia del ratón como en 1.2.2.
- Las mediciones de la pinza 14
- Imaging (Sólo para 4T1 células GFP)
- Anestesiar el ratón como en 1.2.1. Coloca el ratón sobre una plataforma móvil en el interior del instrumento de imagen. Mantener la anestesia a través del cono de la nariz.
- Encienda el instrumento de imagen y la fuente de luz según las instrucciones del fabricante.
- En virtud de la "Adquisición" ir a la pestaña "Iluminación" y cambiar a la posición vacía (sin filtro) para la luz blanca. Asegúrese de que el motor de la luz está en ON y seleccione 'trans' en la mesa de luz.
- En la pestaña "Microscopio", seleccione "Borrar" filtro de emisión y la ampliación 0.5X. En la pestaña "Cámara", asegúrese de que se va a agrupar para la captura es '1 x 1' y la vista previa '4 x 4'. Haga clic en la vista previa para localizar el tumor con luz blanca, se centran para obtener una imagen clara, y haga clic en la captura.
- Ir a la pestaña de iluminación y el cambio "Adquisición" para filtrar 1 (filtro de GFP de acuerdo con las instrucciones del fabricante). En la pestaña "microscopio", cambiar filtro de emisión a "GF 530/20". captura de la imagen de vista previa y en un canal verde. Ajustar el tiempo de exposición para obtener el brillo adecuado.
- Aplicar pseudocolor a la imagen y guardar en la carpeta correspondiente (Figura 1).
2. Administración intranasal de liposomas 10
NOTA: Realizar todos los pasos que utilizan soluciones estériles en un flujo de aire laminar (LAF) Gabinete de Bioseguridad menos que se especifique lo contrario.
- En el día 6 después de la inyección de células tumorales anestesiar a los ratones como en 1.2.1.
- Vórtex con la suspensión clodronato o el control de liposomas (PBS) obtenido del fabricante. Tomar 60 l de liposomas sUSPENSIÓN utilizando puntas de pipeta estéril.
- liberar lentamente solución de liposomas (5 l cada vez), cerca de las fosas nasales que permiten el ratón para respirar en la solución, repetir hasta que se administre la dosis completa de 60 l.
- Deje el ratón recobre el conocimiento antes de colocarlo de nuevo en la jaula.
- Repetir la administración de liposomas son sacrificados cada 3 días hasta que los ratones. No administrar liposomas en un día de sacrificio.
3. Sacrificio Mouse y Recogida de tejido
NOTA: El uso en autoclave e instrumentos estériles para la disección del ratón. La eutanasia a los ratones, mientras que bajo anestesia a través de la exanguinación y la eliminación de los órganos vitales.
- En el día 22 (Para células 4T1) o el día 26 (para células 4T1-GFP) después de la inyección de células tumorales anestesiar el ratón como en 1.2.1. y colocar en la plataforma quirúrgica con un cono de la nariz conectada al vaporizador, mantener la anestesia como en 1.2.1. Pellizcar uno de los dedos de los pies para garantizar que el mouse está inconsciente.
- Pin de los dedos de los pies con agujas a la mesa de disección. Pulverizar etanol en la piel del ratón.
- Levantar la piel con unas pinzas y hacer una incisión con las tijeras quirúrgicas. exponer lentamente el peritoneo y continuar el corte de la piel a través del tórax hasta el cuello.
- El uso de las tijeras quirúrgicas hacer una incisión en el peritoneo y exponer cuidadosamente los órganos con puntas de algodón, evitando el daño a los vasos sanguíneos.
- Mover los órganos a un lado y exponer la vena cava inferior. La punción de la vena y recoge la sangre con la jeringa de insulina 29 g. Coloque la sangre recogida en el tubo y dejar en hielo para su posterior procesamiento.
- Cortar el diafragma para destapar los de la caja torácica, los pulmones y el corazón. Lentamente cortar las costillas en ambos lados utilizando el cortador de hueso y levantar la parte superior de la caja torácica. Coge el corazón con unas pinzas y cortar el tejido conectivo que conecta el corazón y los pulmones a la cavidad torácica.
- Coloque los pulmones en pequeña cantidad de PBS en los 60 mmplaca de Petri en hielo hasta que esté listo para la formación de imágenes y procesamiento adicional para las secciones congeladas para microscopía de inmunofluorescencia o la histología de rutina [incluyendo hematoxilina y eosina (H & E) tinción].
4. Evaluación de pulmón metástasis
- Contando y anotando metástasis superficiales
- Coloque la placa de Petri con los pulmones bajo el microscopio de disección. Enfoque para obtener una visión clara de la superficie del pulmón.
- El uso de un microscopio de disección observar la superficie del pulmón. Contar las metástasis en los lados anterior y posterior de ambos pulmones.
NOTA: El pulmón normal es blanquecino o rosado y porosa y tiene una estructura tipo esponja. Metástasis 4T1 son sólidos y no poroso, a veces parece ser similar a una gota de líquido (Figura 2A).
- de imágenes de pulmón
- Coloque la placa de Petri con los pulmones en el escenario móvil dentro del instrumento de imagen.
- Encienda el instrumento y elBioLite fuente multiespectral. Abra el software. En la pestaña "Adquisición", vaya a "Iluminación", y el interruptor a la posición vacía (sin filtro) para la luz blanca. La luz del motor -> ON, la luz de mesa -> Epi. En el marco del "Microscopio" Seleccionar la pestaña "claro" al filtro de emisión y magnificación 1.66X. En la pestaña "Cámara", asegúrese de que se va a agrupar para la captura es '1 x 1' y la vista previa '4 x 4'.
- Haga clic en la vista previa y el enfoque para obtener una imagen clara de los pulmones a la luz blanca y haga clic en la captura.
- Ir a la pestaña "Adquisición" y el cambio del filtro 1 (filtro de GFP de acuerdo con las instrucciones del fabricante). En la pestaña "microscopio", cambiar filtro de emisión a "GF 530/20". captura de la imagen de vista previa y en un canal verde. Ajustar el tiempo de exposición para obtener el brillo adecuado.
- Aplicar pseudocolor a la imagen y guardar en la carpeta correspondiente.
- Voltear los pulmones para obtener la imagen de la otra parte de una manera similar. este procedure genera imágenes de metástasis GFP-positivas que se pueden cuantificar aún más usando el software apropiado (Figura 2B) 14.
- Microscopía de inmunofluorescencia
- Fijar los pulmones en paraformaldehído al 4%, a 4 ° C durante 4 horas en la oscuridad.
- Lavar el tejido dos veces con 10 ml de PBS durante 5 min para eliminar completamente el fijador. Traslado al 18% de sacarosa en PBS y se incuba O / N a 4 ° C.
- Retire el tejido de la sacarosa y aplique el exceso.
- Tome un criomolde, cubrir la capa inferior con medio-OCT-. Coloque el tejido en un medio-OCT-. Llenar el molde con medio OCT para cubrir completamente el tejido y el lugar en hielo seco.
- bloque de almacenar a -80 ° C hasta el corte.
- Preparar 5 micras de grosor con un criostato y el lugar en portaobjetos cargados.
- Almacenar las diapositivas utilizadas en -80 ° C hasta su posterior uso.
- Secar las preparaciones durante 7 minutos. y lavar con PBS para eliminar octubre Wipe la corredera con una toalla de tejido o de papel para eliminar el exceso de agua, de montaje en cubreobjetos con medio que contiene DAPI de montaje y visualizar con filtro de GFP bajo el microscopio.
- Cuantificar metástasis GFP (figura 3A) con el uso de software apropiado 14.
- Histología y Patología Digital
- Haga clic en el botón de carga manual bajo la pestaña de inicio y esperar a la celebración de la diapositiva estante para expulsar desde el escáner.
- Tome la sección de tejido teñida con H & E, limpiarlo con el tejido para eliminar la suciedad, y colocarlo de forma segura en la parrilla corrediza sostiene.
- Introduzca la descripción de diapositivas en la ventana lanzada hacia arriba.
- Seleccione la pestaña del área de escaneado en la ventana de la consola de imágenes SS y ajustar el cuadrado verde para definir la región de interés (ROI) que deben analizarse.
- Arrastre el diamante azul de calibración a una parte clara de la corredera, donde el tejido está ausente, sin embargo, dentro de la ROI.
- A continuación, seleccione el enfoque PUNTOS ficha y haga clic en el botón de selección automática para obtener varios puntos de enfoque (amarillo signos más) sobre el tejido en el retorno de la inversión.
- Si es necesario, colocar puntos de enfoque adicionales de forma manual haciendo doble clic en el retorno de la inversión.
- Proceder a la pestaña de calibración y seleccione el botón de calibración para comenzar la calibración de diapositivas en el punto de calibración azul diamante. Una vez completada la calibración se mostrará la imagen desde el punto de calibración.
- Inspeccionar esta imagen para asegurarse de que es clara y libre de suciedad o artefactos.
- Proceder a la ficha Escanear y seleccione Iniciar análisis para iniciar la digitalización de la ROI. Sección histológica escaneada se convierte en un portaobjetos digital (Figura 3B y 4A)
- Cuantificar carga metastásico como se describe anteriormente (Figura 4B) 14.
5. citometría de flujo (FACS) Análisis de los macrófagos alveolares en los Pulmones
- Preparación de Suspensiòn de los organismos unicelularesen
- Después de formación de imágenes y el recuento de metástasis, se lavan los pulmones con PBS estéril y colocar a la placa de Petri. Hacer 1 - 2 mm piezas de los pulmones utilizando tijeras quirúrgicas y fórceps.
- La transferencia de las piezas de pulmón al tubo cónico de 15 ml con 3 ml del tampón de digestión que contiene 1 mg / ml de colagenasa P, 0,04 mg / ml de DNasa I, y 10 g / medio RPMI inhibidor de tripsina disuelto ml (estéril).
- Incubar el tubo cónico en un agitador que gira en la incubadora a 37 ° C durante 40 min.
- Retire el tubo cónico de la incubadora y la pipeta la solución de arriba a abajo para disociar el tejido.
- Hacerlo pasar a través del filtro de 40 micras para evitar grumos y obtener una suspensión de células individuales. Si es necesario, para desintegrar mejor el tejido digerido prensa tejido contra el filtro de células con la ayuda de un émbolo de jeringa.
- Cuando se ha conseguido una suspensión de células, recoger las células por centrifugación y lisis de las células rojas de la sangre con2 ml de tampón ACK para 10 min a TA. A continuación, lavar un pellet dos veces en 8 ml de RPMI.
- Resuspender las células en 3 ml del medio RPMI completo y proceder al recuento de células usando el analizador de la viabilidad celular según las instrucciones del fabricante.
- La tinción de las células pulmonares de los marcadores de superficie
NOTA: lleve a cabo todas las incubaciones a 4 ° C. placa de centrifugar a 500 x g y 4 ° C.- Pipeta de 1 x 10 6 células en 100 l de tampón FACS (1% de FBS en PBS) a los pocillos individuales de una placa de 96 pocillos de fondo en V. El uso de una placa de fondo en V de 96 facilita la entrega de múltiples muestras.
- Pre-incubar la suspensión de células con 1 g de Fc de ratón Bloquear purificado anti-ratón CD16 / CD32 en 100 l de tampón FACS para 15 min. Centrifugar la placa de 96 pocillos de fondo en V para sedimentar las células y eliminar el sobrenadante por voltear la placa y dejar que el drenaje de la solución.
- Para la tinción de superficie, por adelantado, diluir los anticuerpos a Murinantígenos correos en un tubo (mezcla maestra): BV605 CD45 (30-F11), PE CD11b (M1 / 70), PE / Cy7 F4 / 80 (BM8), APC / Cy7 CD11c (N418), PerCPCy5.5 I A / I E (MHCII) (M5 / 114.152), PE CD80 (16-10A1), AF 647 CD86 (GL-1) a una concentración final de 2,5 mg / ml en tampón FACS que contiene 10 g / ml de Fc bloque de CD16 / CD32 anticuerpo.
NOTA: Este conjunto de anticuerpos es útil para la identificación y la evaluación de un estado funcional de macrófagos alveolares y células dendríticas. - Añadir 100 l de anticuerpos diluidas (mezcla principal) a los pocillos de la placa de pocillos de fondo en V 96 y se incuba a 4 ° C durante 30 min.
- Se centrifuga la placa para sedimentar las células y eliminar el sobrenadante como en 5.2.2. Lavar las células con 200 l de tampón de FACS, se centrifuga a 500 g durante 5 min. Eliminar el sobrenadante como en 5.2.2. y resuspender las células en 200 l de PBS.
- Se centrifuga la placa para sedimentar las células y añadir colorante de viabilidad diluido en PBS (1: 1.000). Incubar durante 20 minutos a 4 ° C. </ Li>
- Se centrifuga la placa para sedimentar las células y eliminar el sobrenadante como en 5.2.2. Se lava con 200 l de PBS y centrifugar la placa de nuevo.
- Resuspender las células en 100 l de paraformaldehído al 1% y se almacena a 4 ° C hasta el momento de la adquisición por parte de instrumento FACS. Antes de suspensiones de células de transferencia de adquisición a los tubos de polipropileno de FACS.
6. Análisis de los datos de FACS: Estrategias de apertura de puerta y la determinación de las subpoblaciones de células
- Realizar análisis FACS como se informó anteriormente 10. Puerta adquirió células / eventos basados en el Reenvío (FSC) y dispersión lateral (SSC); y luego puerta en vivo y CD45 + células. Para la identificación de los macrófagos alveolares, puerta CD11b-negativos y luego las células CD11c + F4 / 80 +. (Figura 5A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La inyección de las células tumorales 4T1-GFP en la almohadilla de grasa mamaria conduce a la formación de tumores de ratón (figura 1A) que recapitular la propagación metastásica del cáncer de mama humano, como metástasis se forman rápidamente en los pulmones (Figura 2), hígado, huesos y el cerebro de los ratones 11. La transfección estable de células 4T1 con GFP facilita el seguimiento del crecimiento del tumor (Figura 1B), el seguimiento de las células tumorales de metástasis y la cuantificación de la carga metastásica (Figura 2B, 3B). Además, las imágenes de los tumores proporciona la información adicional con respecto a varias características patológicas tales como la muerte celular del tumor y la vasculatura del tumor. La fluorescencia verde brillante (Figura 1B: los paneles centrales) indican la expresión de alto GFP, que por lo general se asocia con el parénquima tumoral viable. Considerando la falta de GFP en algunas áreas tumorales puede indicar la muerte de células tumorales (
Dado que la mayoría de las metástasis pulmonares se encuentran en la superficie del pulmón, pueden ser observados bajo el microscopio de disección regular. Las lesiones metastásicas son por lo general claramente distinto del parénquima circundante (Figura 2A). Para verificar las observaciones brutas y evaluar las metástasis que son más profundas dentro del parénquima pulmonar, imágenes fluorescentes de los pulmones se puede realizar (figura 2B), si se utilizan células que expresan GFP para inyección. Aunque la autofluorescencia de pulmón es claramente visible en las imágenes, brillante fluorescencia de GFP derivados facilita la metástasis distintivas de parénquima pulmonar circundante. Alternativamente, la histología de rutina (Figura 3A y la Figura 4A), en relación con los algoritmos de patología digital ( Multicolor FACS ofrece la oportunidad de caracterizar las poblaciones de células raras incluso mediante el uso de la superficie celular multipolar y / o marcadores citoplásmicos simultáneamente. Los macrófagos alveolares se caracterizan por la falta de expresión de CD11b y la expresión de F4 / 80 y CD11c (Figura 5). El enfoque típico para identificar estas células por flujo implica citometría de: (i) la selección de la población de células basado en la morfología descrita por delante y propiedades de dispersión lateral, (ii) la selección de CD45 + viables células seguido de (iii) gating de células negativas CD11b, y (iv) gating de las células que coexpresan F4 / 80 y CD11c (Figura 5A, B). 
Figura 1. Seguimiento crecimiento tumoral Through Imaging Animal. (A) imágenes de luz blanca del ratón inyectado con células que expresan GFP en la almohadilla de grasa mamaria en diferentes puntos temporales después de la inyección de células tumorales. (B) correspondientes imágenes fluorescentes obtenidas mediante el uso de filtro de GFP. Las líneas discontinuas marcan área del tumor. Tenga en cuenta la falta de fluorescencia verde brillante en algunas áreas del tumor en el día 26 que pueden resultar de la necrosis tisular o neovasculatura en desarrollo. Barra de escala, 10 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 
Figura 2. Evaluación de pulmón metastásico Burden. Imágenes (A) de los pulmones de los ratones inyectados con células 4T1 en la almohadilla de grasa mamaria con las metástasis de superficie (flechas).(B) Las imágenes de las metástasis pulmonares GFP + (fluorescencia verde brillante) obtenidos a través del uso del microscopio de imagen. Barra de escala, 10 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 
Figura 3. La histopatología digital y microscopía confocal en Obtención de imágenes de metástasis pulmonares. (A) La exploración de la sección de pulmón hematoxilina y eosina (H & E) manchadas de los ratones inyectados con células 4T1 en la almohadilla de grasa mamaria (azul oscuro tejido metástasis). Barra de escala, de 4 mm. (B) La microscopía confocal de las metástasis pulmonares GFP + (fluorescencia verde brillante). Barra de escala, 200 micras. Haga clic aquí para ver una versio más granden de esta figura. 
Figura 4. Cuantificación de pulmón metastásico carga por Digital Histopatología. (A) La exploración de la sección de pulmón teñido (de color azul oscuro tejido metástasis) hematoxilina y eosina (H & E). (B) La imagen de los pulmones que se muestran en (A) generada por una herramienta de análisis de imágenes histomorfología entrenable (por software "Genie"). El color rojo indica las zonas pulmonares identificados por "Genie", como metástasis. Barra de escala, 5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 
Figura 5. Aplicación de Citometría de Flujocucarachas para la Identificación de los macrófagos alveolares en los pulmones. (A) El representativeflow cytometrydot plotsillustrating el gating estrategia para identificar CD45 + CD11b negativo F4 / 80 + CD11c + macrófagos alveolares. (B) citometría de flujo Representante dot efecto plotsillustrating de control o liposomas clodronato en los macrófagos alveolares de pulmón. Los números en parcelas representan porcentajes de células cerradas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Esta investigación ha sido financiada por el Departamento de Defensa conceder TSA 140010 a 111038 y BC MK de MMM Puntos de vista y opiniones de los endosos, y por el autor (s) no reflejan las del Ejército de Estados Unidos o el Departamento de Defensa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4T1 cell line | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | CRL 2539 | Tumor cells |
| 4T1-GFP cell line | Caliper life sciences/ Perkin Elmer, Waltham, MA, USA | BW128090 | Tumor cells |
| RPMI | Corning, Corning, NY, USA | 10-040-CM | Media |
| Heat inactivated FBS | Gibco (Thermo Scientific), USA | 10082147 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | MT-300-02-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | BP399-20 | Dilute with distilled water |
| Trypsin 0.25% with EDTA | Hyclone, Logan, Utah, USA | SH30042.02 | Tissue culture supplies |
| T75 cm2 flask | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 12-565-32 | Tissue culture supplies |
| 15 ml conical tube | BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA | 352096 | Tissue culture supplies |
| 50 ml conical tube | BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA | 352098 | Tissue culture supplies |
| 60 mm2 Petri dish | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AS4052 | For lung imaging |
| Isoflurane (Isothesia) | Butler Schein Animal health, Dublin, OH, USA | NDC 11695-6776-2 | Mouse anesthesia |
| Clodronate liposomes | Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA | F70101C-N | Macrophages depletion |
| Control liposomes | Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA | F70101-N | Control PBS-liposomes |
| 29 gauge insulin syringes (12.7 mm and 0.5 ml capacity)- Reli-On | Walmart, Bentonville, AR, USA | For tumor cell injection | |
| Hair removal cream (Nair) | Walmart, Bentonville, AR, USA | ||
| Paraformaldehyde solution (4%) | Affymetrix, Santa Clara, CA, USA | 19943-I Lt | Dilute to 4% or 1% using 1x PBS |
| OCT compound | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 230-730-571 | For freezing tissue in cryomolds |
| Fluoro-Gel-II with DAPI | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 17985-51 | Mounting medium |
| Sucrose | Sigma, St. Louis, MO, USA | S-9378 | Cryopreservation |
| Collagenase P | Roche, Basel, Switzerland | 11249002001 | Components of tissue digestion buffer |
| Dnase I | Roche, Basel, Switzerland | 10104159001 | Components of tissue digestion buffer |
| Trypsin inhibitor | Sigma, St. Louis, MO, USA | T9253 | Components of tissue digestion buffer |
| 40 micron cell strainers | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 22-363-547 | Used in tissue digestion to remove clumps |
| Trustain FcX-Fc Block (CD16/CD32) | Biolegend, San Diego, CA, USA | 101320 | Antibodies for flow cytometry |
| BV605 CD45 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 103139 | Antibodies for flow cytometry |
| PE CD11b | Biolegend, San Diego, CA, USA | 101207 | Antibodies for flow cytometry |
| PE Cy7 F4/80 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 123113 | Antibodies for flow cytometry |
| APC/Cy7 CD11c | Biolegend, San Diego, CA, USA | 117323 | Antibodies for flow cytometry |
| PerCPcy5.5 IA/IE (MHCII) | Biolegend, San Diego, CA, USA | 107625 | Antibodies for flow cytometry |
| PE CD80 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 104707 | Antibodies for flow cytometry |
| AF647 CD86 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 105019 | Antibodies for flow cytometry |
| Fixable viability Dye eflour 506 | eBioscience, San Diego, CA,USA | 65-0866 | Antibodies for flow cytometry |
| Cryostat | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | CM1850 | Cryosectioning |
| UVP iBox Explorer | UVP Inc, Upland, CA, USA | Mouse and lung fluorescent imaging | |
| Aperio Scanscope CS | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | Digital pathology | |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | Flow cytometry/data acquisition | |
| Nikon A1 confocal TE2000 microscope | Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A. | Imaging and quantifying GFP fluorescence in lung cryosections | |
| UVP visionworks software (Version 7.1RC3.38) | UVP Inc, Upland, CA, USA | Imaging software for iBOX | |
| Aperio Imagescope software (v12.1.0.5029) | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | Imaging software for analysis of digital slides | |
| Flow JO software (version 9.8.1) | Flow JO LLC, Ashland, OR, USA | Analysis of flow cytometric data | |
| NIS Elements AR (version 4.20.01) 64 Bit | Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A. | Acquisition and analysis of lung cryosections for GFP |
References
- Sceneay, J., Smyth, M. J., Moller, A. The pre-metastatic niche: finding common ground. Cancer Metastasis Rev. , (2013).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nat Rev Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438, 820-827 (2005).
- Hiratsuka, S., et al. MMP9 induction by vascular endothelial growth factor receptor-1 is involved in lung-specific metastasis. Cancer Cell. 2, 289-300 (2002).
- Hiratsuka, S., et al. The S100A8-serum amyloid A3-TLR4 paracrine cascade establishes a pre-metastatic phase. Nat Cell Biol. 10, 1349-1355 (2008).
- Yan, H. H., et al. Gr-1+CD11b+ myeloid cells tip the balance of immune protection to tumor promotion in the premetastatic lung. Cancer Res. 70, 6139-6149 (2010).
- Gao, D., et al. Myeloid progenitor cells in the premetastatic lung promote metastases by inducing mesenchymal to epithelial transition. Cancer Res. 72, 1384-1394 (2012).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R.
- Holt, P. G., Strickland, D. H., Wikstrom, M. E., Jahnsen, F. L. Regulation of immunological homeostasis in the respiratory tract. Nat Rev Immunol. 8, 142-152 (2008).
- Sharma, S. K., et al. Pulmonary alveolar macrophages contribute to the premetastatic niche by suppressing antitumor T cell responses in the lungs. J. Immunol. 194, 5529-5538 (2015).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S., et al. Mouse 4T1 breast tumor model. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , Chapter 20, Unit 20 22 (2001).
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127, 679-695 (2006).
- Buiting, A. M., Van Rooijen, N. Liposome mediated depletion of macrophages: an approach for fundamental studies. J. Drug Target. 2, 357-362 (1994).
- Vadrevu, S. K., et al. Complement c5a receptor facilitates cancer metastasis by altering T-cell responses in the metastatic niche. Cancer Res. 74, 3454-3465 (2014).
- Walrath, J. C., Hawes, J. J., Van Dyke, T., Reilly, K. M. Genetically engineered mouse models in cancer research. Adv. Cancer Res. 106, 113-164 (2010).
- Bosiljcic, M., et al. Myeloid suppressor cells regulate the lung environment--letter. Cancer Res. 71, author reply 5052-5053 5050-5051 (2011).
- Yan, H. H., et al. Myeloid Suppressor Cells Regulate the Lung Environment-Response. Cancer Res. 71, 5052-5053 (2011).
- Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).
