Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

स्तन कैंसर मेटास्टेसिस में वायुकोशीय मैक्रोफेज की भूमिका का अध्ययन

Published: June 26, 2016 doi: 10.3791/54306
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1, 1, 1
1Department of Immunotherapeutics and Biotechnology, School of Pharmacy, Texas Tech University Health Science Center, 2Merck Research Labs, 3Department of Surgery, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Protocol

सभी जानवरों के अध्ययन संस्थागत पशु की देखभाल और टेक्सास टेक विश्वविद्यालय के स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र के प्रयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है और बाद के दिशा-निर्देशों के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान द्वारा प्रकाशित "देखभाल और प्रयोगशाला पशु के उपयोग के लिए गाइड" में उल्लिखित। आठ से बारह सप्ताह के लिए पुराने महिला BALB / ग चूहों कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं का प्रयोग करें। इंजेक्षन 1 एक्स 10 5 4T1 या 1 एक्स 10 5 4T1 कोशिकाओं GFP, विभिन्न विक्रेताओं से खरीदा जा सकता है, जो स्तन वसा पैड में व्यक्त।

1. 4T1 की संस्कृति और 4T1-GFP कोशिकाओं और इंजेक्शन 14 के लिए ट्यूमर सेल निलंबन की तैयारी

  1. 4T1 और 4T1-GFP सेल संस्कृति
    ध्यान दें: जब तक अन्यथा निर्दिष्ट एक लामिना airflow (एलएएफ) के जैव सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ समाधान का उपयोग कर सभी चरणों का प्रदर्शन।
    1. बनाए रखने के RPMI माध्यम में 4T1 और 4T1-GFP कोशिकाओं 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम और 100 यू / एमएल पेनिसिलिन के साथ पूरकजी और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट।
      नोट: हर trypsinization और कोशिकाओं के चढ़ाना की गणना के द्वारा एक मार्ग संख्या निर्धारित है। यह सभी माउस प्रयोगों के लिए एक ही मार्ग संख्या के साथ कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि मार्ग की संख्या सेल tumorigenicity और metastatic क्षमता को प्रभावित करता है।
    2. सेल इंजेक्शन से पहले T75 सेमी 2 फ्लास्क को हटाने, 80% confluency पर ट्यूमर कोशिकाओं से युक्त, एक मशीन और महाप्राण मध्यम से। पीबीएस के 10 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे कुप्पी बारी बारी से शेष मध्यम बाहर धोने के लिए, और फिर पीबीएस aspirate।
    3. फ्लास्क EDTA के साथ 0.25% trypsin के 2 मिलीलीटर जोड़ें और यह झुकाव समाधान समान रूप से सतह पर एक humidified इनक्यूबेटर में 3 मिनट के लिए 37 सेल्सियस पर 5% सीओ 2 के साथ वितरित करने और सेते हैं।
    4. कुप्पी कोशिकाओं की टुकड़ी को सुविधाजनक बनाने और ताजा माध्यम के 8 मिलीलीटर जोड़ने के लिए टैप करें। विंदुक ऊपर और नीचे कई बार गुच्छों को बाधित और एक एकल कक्ष निलंबन पाने के लिए।
    5. 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। आरटी पर 500 XG पर।सतह पर तैरनेवाला Aspirate और पीबीएस के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं को धो लें।
    6. विंदुक ऊपर और नीचे कई बार गुच्छों को बाधित और एक एकल कक्ष निलंबन पाने के लिए। एक सेल निलंबन के 100 μl ले लो और निर्माता के निर्देशों के अनुसार सेल व्यवहार्यता विश्लेषक का उपयोग कोशिकाओं की गिनती।
    7. प्रति एक प्रयोग में इस्तेमाल चूहों के माउस एक्स # 10 5 कोशिकाओं (हमेशा एक सुरक्षित पक्ष पर होना करने के लिए अतिरिक्त कोशिकाओं को तैयार): सभी इंजेक्शन सूत्र का उपयोग करने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या की गणना।
    8. 1.1.5 के रूप में अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। ताजा पीबीएस की राशि में आकांक्षा और resuspend कोशिकाओं के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला निकालें 1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम सेल एकाग्रता प्राप्त करने की आवश्यकता है। इंजेक्शन के लिए तैयार है जब तक बर्फ पर सेल निलंबन रखें।
  2. 4T1 या 4T1-GFP सेल इंजेक्शन माउस प्रक्रिया
    1. दिन ट्यूमर सेल इंजेक्शन से पहले, 3% isoflurane के साथ एक प्रेरण कक्ष में चूहों anesthetize। एक बार जब चूहों सो रहे हैं और नियमित रूप से सांस लेते हैं, जगह टीवह नाक शंकु के अंदर नाक के साथ एक शल्य पैड पर माउस, और यह isoflurane vaporizer से कनेक्ट। 2.5% isoflurane के साथ संज्ञाहरण बनाए रखें। माउस पैर की अंगुली चुटकी कि यह सुनिश्चित करने के लिए माउस anesthetized है।
    2. इंजेक्शन साइट के लिए एक कपास झाड़ू (सही कवच ​​स्तन वसा पैड) का उपयोग कर बालों को हटाने क्रीम लगाओ और 2 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें। साइट पर एक गीला तौलिया का उपयोग कागज साफ, पिंजरे में वापस माउस जगह और एक जानवर की निगरानी जब तक यह स्टर्नल लेटना बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना आएगा।
    3. इंजेक्शन के दिन, 1.2.2 के रूप में चूहों anesthetize और शल्य चिकित्सा पैड पर जगह है।
    4. ट्यूमर कोशिकाओं से युक्त वर्दी सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए ट्यूब भंवर। महाप्राण एक सेल निलंबन के 100 μl एक 0.5 मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज में 1 एक्स 10 5 ट्यूमर कोशिकाओं से युक्त, (29 जी, 12.7 मिमी सुई लंबाई)।
    5. त्वचा 2 एन डी और 3 निप्पल के पास अंगूठे और उंगली सूचकांक का उपयोग कर लिफ्ट, mammar में सिरिंज की सुई डालनेसिर्फ उंगलियों के बीच त्वचा के नीचे तीसरे निप्पल नीचे Y वसा पैड और इंजेक्षन कोशिकाओं को धीरे धीरे एक बुलबुला (चमड़े के नीचे इंजेक्शन) के रूप में।
    6. माउस इंजेक्शन के बाद पिंजरे में वापस प्लेस और 1.2.2 के रूप में की निगरानी।
  3. निगरानी ट्यूमर के विकास
    1. कैलिपर माप 14
      नोट: इंजेक्शन 4T1 या 4T1-GFP कोशिकाओं आक्रामक स्तन ट्यूमर के रूप में। सेल टीका के बाद 5 - आमतौर पर साफ झलक रहा ट्यूमर 4 दिन में दिखाई देते हैं ~। 4T1-GFP कोशिकाओं ट्यूमर है कि धीमी गति से आगे बढ़ने और मेटास्टेसिस बाद में दे के रूप में। ट्यूमर एक सप्ताह दो से तीन बार उपाय। जानवरों की चिकित्सीय स्थिति कमजोर होती हैं, जानवरों के ट्यूमर शरीर के वजन के 10% से अधिक या ulcerated हो, तुरंत चूहों euthanize, 10% से अधिक शरीर के वजन खो देते हैं।
      1. 1.2.1 के रूप में एक माउस anesthetize।, शल्य चिकित्सा पैड पर तौलना, जगह और 70% इथेनॉल के साथ क्षेत्र गीला।
      2. (- 5 दिन सेल टीका के बाद 4) इंजेक्शन के स्थल में ट्यूमर टटोलना।
        3. <li> एक नली का व्यास के साथ सबसे बड़ा व्यास (डी) और छोटे व्यास (डी 1) को मापने।
      3. सूत्र आयतन = (DX डी 1 एक्स डी 1) / 2 मिमी 3 का उपयोग ट्यूमर मात्रा की गणना। 1.2.2 के रूप में संज्ञाहरण से माउस वसूली की निगरानी।
    2. इमेजिंग (केवल 4T1 GFP कोशिकाओं)
      1. 1.2.1 में के रूप में माउस anesthetize। इमेजिंग साधन के अंदर एक जंगम मंच पर माउस रखें। नाक शंकु के माध्यम से संज्ञाहरण बनाए रखें।
      2. इमेजिंग उपकरण और निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रकाश स्रोत पर कर दें।
      3. टैब "अधिग्रहण" के तहत "प्रकाश" के लिए जाना और सफेद रोशनी के लिए खाली स्थिति (कोई फिल्टर) के लिए स्विच। सुनिश्चित करें कि प्रकाश इंजन पर है और प्रकाश तालिका में 'ट्रांस' का चयन करें।
      4. टैब "माइक्रोस्कोप" के अंतर्गत, "साफ़" उत्सर्जन फिल्टर और 0.5X बढ़ाई चयन करें। "कैमरा" टैब में, उस पर कब्जा के लिए binning है '1 एक्स 1' और पूर्वावलोकन '4 x 4' सुनिश्चित करें। सफेद रोशनी में ट्यूमर का पता लगाने के लिए पूर्वावलोकन पर क्लिक करें, साफ छवि पाने के लिए ध्यान देते हैं, और कब्जा क्लिक करें।
      5. फिल्टर करने के लिए 1 (निर्माता के निर्देशों के अनुसार के रूप में GFP के लिए फिल्टर) "अधिग्रहण" टैब और परिवर्तन प्रकाश व्यवस्था के लिए जाओ। "माइक्रोस्कोप" टैब में, "530/20 GF" करने के लिए उत्सर्जन फिल्टर बदल जाते हैं। पूर्वावलोकन और एक ग्रीन चैनल में कब्जा छवि। उचित चमक पाने के लिए जोखिम समय समायोजित करें।
      6. छवि के लिए pseudocolor लागू करें और उचित फ़ोल्डर (चित्रा 1) में बचाने के लिए।

2. Liposomes 10 की Intranasal प्रशासन

ध्यान दें: जब तक अन्यथा निर्दिष्ट एक लामिना airflow (एलएएफ) के जैव सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ समाधान का उपयोग कर सभी चरणों का प्रदर्शन।

  1. ट्यूमर सेल इंजेक्शन के बाद 6 दिन 1.2.1 के रूप में चूहों anesthetize।
  2. clodronate या नियंत्रण (पीबीएस) liposome निलंबन निर्माता से प्राप्त भंवर। μl liposome 60 लोuspension बाँझ विंदुक टिप का उपयोग।
  3. धीरे-धीरे नाक माउस समाधान में साँस लेने के लिए अनुमति देता है, के पास (5 μl हर बार), liposome समाधान रिहाई तक 60 μl की पूरी खुराक प्रशासित किया जाता है दोहराएँ।
  4. माउस यह पिंजरे में रखने से पहले वापस होश में आने दीजिए।
  5. दोहराएँ liposome प्रशासन चूहों जब तक हर 3 दिन बलिदान कर रहे हैं। बलिदान का एक दिन पर liposomes प्रशासन नहीं है।

3. माउस बलिदान और ऊतक संग्रह

नोट: उपयोग autoclaved और माउस विच्छेदन के लिए बाँझ उपकरणों। exsanguination और महत्वपूर्ण अंगों को हटाने के माध्यम से संज्ञाहरण के तहत जबकि चूहों euthanize।

  1. 22 दिन या दिन (4T1 कोशिकाओं के लिए), 26 ट्यूमर सेल इंजेक्शन के बाद (4T1-GFP कोशिकाओं के लिए) 1.2.1 में के रूप में माउस anesthetize। और एक नाक vaporizer से जुड़ा शंकु के साथ सर्जिकल पैड पर जगह है, 1.2.1 के रूप में संज्ञाहरण बनाए रखें। पैर की उंगलियों में से एक चुटकी सुनिश्चित करने के लिए कि मीटरouse बेहोश है।
  2. विच्छेदन बोर्ड के लिए सुइयों का उपयोग पैर की उंगलियों पिन। माउस त्वचा पर इथेनॉल स्प्रे।
  3. संदंश का उपयोग त्वचा लिफ्ट और शल्य कैंची के साथ एक चीरा बनाते हैं। धीरे-धीरे पेरिटोनियम बेनकाब और गर्दन तक छाती के माध्यम से त्वचा को काटने के लिए जारी है।
  4. शल्य कैंची का उपयोग पेरिटोनियम में एक चीरा बनाने के लिए और ध्यान से रक्त वाहिकाओं को नुकसान से बचने कपास सुझावों के साथ अंगों को बेनकाब।
  5. एक तरफ करने के अंगों को ले जाएँ और अवर रग Cava बेनकाब। नस पंचर और 29 जी इंसुलिन सिरिंज के साथ रक्त इकट्ठा। एकत्र रक्त ट्यूब में डाल दिया है और आगे की प्रक्रिया के लिए बर्फ पर छोड़ दें।
  6. रिब पिंजरे, फेफड़े और दिल को बेनकाब करने के लिए डायाफ्राम कट। धीरे-धीरे हड्डी कटर का उपयोग कर दोनों पक्षों पर रिब पिंजरे में कटौती और ribcage के शीर्ष उठा। संदंश के साथ दिल ले लो और छाती गुहा को हृदय और फेफड़ों को जोड़ने संयोजी ऊतक काटा।
  7. पीबीएस की छोटी राशि में फेफड़ों 60 मिमी में रखेंimmunofluorescent माइक्रोस्कोपी या दिनचर्या ऊतक विज्ञान [hematoxylin और eosin (एच एंड ई) धुंधला हो जाना भी शामिल है] के लिए इमेजिंग और जमे हुए वर्गों के लिए आगे की प्रक्रिया के लिए तैयार है जब तक बर्फ पर पेट्री डिश।

4. फेफड़ों metastases मूल्यांकन

  1. गिनती और भूतल मेटास्टेसिस स्कोरिंग
    1. विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे फेफड़ों के साथ पेट्री डिश रखें। फेफड़ों की सतह की एक स्पष्ट दृष्टिकोण पाने के लिए ध्यान दें।
    2. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग फेफड़ों सतह निरीक्षण करते हैं। दोनों फेफड़ों के पूर्वकाल और पीछे पक्षों पर मेटास्टेसिस गणना।
      नोट: सामान्य फेफड़ों सफेद या गुलाबी और झरझरा है और संरचना की तरह एक स्पंज है। 4T1 मेटास्टेसिस ठोस और nonporous कर रहे हैं, कभी कभी तरल (2A चित्रा) की एक बूंद के समान दिखाई देते हैं।
  2. फेफड़े इमेजिंग
    1. इमेजिंग साधन के अंदर चल मंच पर फेफड़ों के साथ पेट्री डिश रखें।
    2. साधन और चालू करेंmultispectral स्रोत biolite। सॉफ्टवेयर खोलें। टैब के अंतर्गत, "अधिग्रहण", "प्रकाश" के लिए जाना है, और सफेद रोशनी के लिए खाली स्थिति (कोई फिल्टर) के लिए स्विच। लाइट इंजन -> पर, प्रकाश तालिका -> महामारी। टैब "माइक्रोस्कोप" के अंतर्गत चयन 'साफ़' उत्सर्जन फिल्टर और 1.66X बढ़ाई। "कैमरा" टैब में, उस पर कब्जा के लिए binning है '1 एक्स 1' और पूर्वावलोकन '4 x 4' सुनिश्चित करें।
    3. पूर्वावलोकन पर क्लिक करें और सफेद रोशनी में फेफड़ों की एक स्पष्ट तस्वीर सामने आती है और कब्जा क्लिक करने के लिए ध्यान केंद्रित।
    4. "अधिग्रहण" (निर्माता के निर्देशों के अनुसार के रूप में GFP के लिए फिल्टर) टैब और फिल्टर करने के लिए 1 बदलने के लिए जाना। "माइक्रोस्कोप" टैब में, "530/20 GF" करने के लिए उत्सर्जन फिल्टर बदल जाते हैं। पूर्वावलोकन और एक ग्रीन चैनल में कब्जा छवि। उचित चमक पाने के लिए जोखिम समय समायोजित करें।
    5. छवि के लिए pseudocolor लागू करें और उचित फ़ोल्डर में बचाने के लिए।
    6. फेफड़ों फ्लिप एक समान तरीके से दूसरे पक्ष की छवि को पाने के लिए। इस procedure GFP पॉजिटिव मेटास्टेसिस है कि आगे उपयुक्त सॉफ्टवेयर (चित्रा 2 बी) 14 का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है की छवियों को उत्पन्न करता है।
  3. immunofluorescent माइक्रोस्कोपी
    1. अंधेरे में 4 घंटे के लिए 4% paraformaldehyde में फेफड़ों फिक्स, 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    2. 5 मिनट के लिए 10 मिलीलीटर पीबीएस के साथ दो बार ऊतक धो पूरी तरह से लगानेवाला हटा दें। पीबीएस में 18% sucrose के लिए स्थानांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हे / एन।
    3. सुक्रोज से ऊतक निकालें और किसी भी अतिरिक्त बंद थपका।
    4. एक cryomold लो, अक्टूबर माध्यम के साथ नीचे की परत को कवर किया। अक्टूबर माध्यम पर ऊतक रखें। अक्टूबर माध्यम के साथ पूरी तरह से ढालना ऊतक और सूखी बर्फ पर जगह को कवर करने के लिए भरें।
    5. -80 डिग्री सेल्सियस तक सेक्शनिंग पर स्टोर ब्लॉक।
    6. एक cryostat और आरोप लगाया स्लाइड पर जगह के साथ 5 माइक्रोन मोटी वर्गों तैयार करें।
    7. -80 डिग्री सेल्सियस आगे उपयोग के लिए जब तक में अप्रयुक्त स्लाइड्स स्टोर।
    8. एयर 7 मिनट के लिए स्लाइड सूखी। और पीबीएस के साथ धोने अक्टूबर हटा दें। विपई पानी से अधिक दूर ऊतक या कागज तौलिया के साथ स्लाइड करने के लिए, DAPI युक्त मध्यम बढ़ते के साथ कवर फिसल जाता है माउंट और माइक्रोस्कोप के तहत GFP फिल्टर के साथ कल्पना।
    9. उपयुक्त सॉफ्टवेयर के उपयोग के साथ 14 GFP मेटास्टेसिस (चित्रा 3 ए) यों।
  4. प्रोटोकॉल और डिजिटल पैथोलॉजी
    1. प्रारंभ टैब के अंतर्गत मैनुअल लोड बटन पर क्लिक करें और स्लाइड रैक पकड़े स्कैनर से बेदखल करने के लिए प्रतीक्षा करें।
    2. एच एंड ई दाग ऊतक अनुभाग ले लो, ऊतक के साथ यह साफ किसी भी गंदगी को दूर करने के लिए, और स्लाइड पकड़े रैक में सुरक्षित जगह है।
    3. popped-अप विंडो में स्लाइड विवरण दर्ज करें।
    4. एसएस इमेजिंग कंसोल विंडो पर स्कैन क्षेत्र टैब का चयन करें और ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र स्कैन करने के लिए परिभाषित करने के लिए हरी वर्ग को समायोजित।
    5. स्लाइड, जहां ऊतक अनुपस्थित है, हालांकि, रॉय के भीतर का एक स्पष्ट हिस्से को नीले रंग के हीरे अंशांकन खींचें।
    6. अगले, फोकस पी चयनoints टैब और लागत पर लाभ में ऊतक पर कई ध्यान केंद्रित अंक प्राप्त करने के लिए ऑटो का चयन करें बटन (पीला प्लस संकेत) पर क्लिक करें।
    7. यदि आवश्यक हो, रॉय के भीतर डबल क्लिक करके मैन्युअल अतिरिक्त ध्यान केंद्रित अंक जगह है।
    8. जांचना टैब लिए आगे बढ़ें और जांचना बटन का चयन नीले हीरे अंशांकन बिंदु पर स्लाइड अंशांकन शुरू करने के लिए। अंशांकन के बाद पूरा हो अंशांकन बिंदु से छवि प्रदर्शित किया जाएगा।
    9. इस छवि का निरीक्षण सुनिश्चित करने के लिए कि यह स्पष्ट है और गंदगी या कलाकृतियों के लिए स्वतंत्र है।
    10. स्कैन टैब के लिए आगे बढ़ना है और शुरू स्कैन का चयन रॉय की स्कैनिंग शुरू करने के लिए। स्कैन किए गए ऊतकीय खंड एक डिजिटल स्लाइड में बदल जाती है (चित्रा 3 बी और 4 ए)
    11. मेटास्टेटिक बोझ यों के रूप में पहले से वर्णित (चित्रा 4 बी) 14।

5. से फ्लो (FACS) वायुकोशीय मैक्रोफेज के फेफड़ों में विश्लेषण

  1. सिंगल सेल Suspensi की तैयारीपर
    1. इमेजिंग और मेटास्टेसिस की गिनती के बाद, बाँझ पीबीएस के साथ फेफड़ों धोने और पेट्री डिश के लिए जगह है। 2 शल्य कैंची और संदंश का उपयोग फेफड़ों के टुकड़े मिमी - 1 बनाओ।
    2. पाचन 1 मिलीग्राम / एमएल collagenase पी, 0.04mg / एमएल DNase मैं युक्त बफर के 3 मिलीलीटर, और 10 माइक्रोग्राम / एमएल trypsin अवरोध करनेवाला भंग RPMI मध्यम (बाँझ) के साथ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब फेफड़ों के टुकड़े स्थानांतरण।
    3. 40 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एक घूर्णन प्रकार के बरतन पर शंक्वाकार ट्यूब सेते हैं।
    4. ऊतक अलग कर देना इनक्यूबेटर से ट्यूब शंक्वाकार निकालें और समाधान विंदुक ऊपर और नीचे।
    5. 40 माइक्रोन झरनी के माध्यम से समाधान झुरमुटों से बचने और एक एकल कक्ष निलंबन पाने के लिए गुजरती हैं। यदि आवश्यक हो, एक सिरिंज सवार की मदद से सेल झरनी के खिलाफ बेहतर पचा ऊतक प्रेस ऊतक बिखर।
    6. जब एक एकल कोशिका निलंबन हासिल किया गया है, centrifugation द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करने और साथ लाल रक्त कोशिकाओं lyseआरटी पर 10 मिनट के लिए एसीके बफर के 2 मिलीलीटर। फिर, RPMI के 8 मिलीलीटर में एक गोली दो बार धो लो।
    7. पूरा RPMI मध्यम के 3 मिलीलीटर और Resuspend कोशिकाओं निर्माता के निर्देशों के अनुसार सेल व्यवहार्यता विश्लेषक का उपयोग गिनती सेल के लिए आगे बढ़ना।
  2. सतह मार्कर के लिए फेफड़ों की कोशिकाओं का धुंधला
    नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी incubations प्रदर्शन करना। 500 XG और 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र थाली।
    1. पिपेट 1 एक्स 10 6 एक वी के नीचे 96 अच्छी तरह से थाली की अलग-अलग कुओं के लिए FACS बफर (पीबीएस में 1% FBS) के 100 μl में कोशिकाओं। एक वी के नीचे 96 अच्छी तरह से थाली का उपयोग कर कई नमूने के सौंपने की सुविधा।
    2. 1 माइक्रोग्राम माउस एफसी ब्लॉक के साथ सेल निलंबन पूर्व सेते 15 मिनट के लिए FACS बफर के 100 μl में CD32 शुद्ध विरोधी माउस CD16 /। वी के नीचे 96 अच्छी तरह से थाली गोली कोशिकाओं और प्लेट flipping और समाधान नाली देने से सतह पर तैरनेवाला को हटाने के लिए अपकेंद्रित्र।
    3. सतह धुंधला के लिए, अग्रिम में, Murin के लिए एंटीबॉडी पतलाएक ट्यूब (मास्टर मिश्रण) में ई एंटीजन: BV605 CD45 (30-F11), पीई CD11b (एम 1/70), पीई / Cy7 F4 / 80 (BM8), एपीसी / Cy7 CD11c (N418), PerCPCy5.5 मैं ए / मैं एफसी ब्लॉक CD16 के 10 माइक्रोग्राम / एमएल युक्त FACS बफर में 2.5 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए ई (MHCII) (M5 / 114.152), पीई CD80 (16-10A1), वायुसेना 647 CD86 (जीएल 1) / CD32 एंटीबॉडी।
      नोट: एंटीबॉडी का यह सेट पहचान और वायुकोशीय मैक्रोफेज और वृक्ष के समान कोशिकाओं का एक कार्यात्मक स्थिति के मूल्यांकन के लिए उपयोगी है।
    4. वी के नीचे 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं को पतला एंटीबॉडी (मास्टर मिश्रण) के 100 μl जोड़ें और 30 मिनट के लिए 4 सी सेते हैं।
    5. थाली अपकेंद्रित्र गोली कोशिकाओं और 5.2.2 के रूप में सतह पर तैरनेवाला हटा दें। 5 मिनट के लिए 500 ग्राम पर FACS बफर के 200 μl, सेंट्रीफ्यूज के साथ कोशिकाओं को धो लें। 5.2.2 के रूप में सतह पर तैरनेवाला निकालें। और पीबीएस के 200 μl में कोशिकाओं resuspend।
    6. प्लेट गोली कोशिकाओं और व्यवहार्यता डाई पीबीएस (: 1,000 1) में पतला जोड़ने के लिए अपकेंद्रित्र। 4 सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेते हैं। </ Li>
    7. प्लेट गोली कोशिकाओं और 5.2.2 के रूप में सतह पर तैरनेवाला को हटाने के लिए अपकेंद्रित्र। पीबीएस के 200 μl से धो लें और प्लेट फिर से अपकेंद्रित्र।
    8. FACS साधन द्वारा अधिग्रहण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 1% paraformaldehyde और दुकान के 100 μl में Resuspend कोशिकाओं। polypropylene FACS ट्यूबों के लिए अधिग्रहण के हस्तांतरण सेल निलंबन से पहले।

6. FACS डेटा का विश्लेषण: गेटिंग रणनीतियाँ और सेल उप-जनसंख्या की पहचान

  1. के रूप में पहले 10 सूचना FACS विश्लेषण करते हैं। गेट का अधिग्रहण आगे (एफएससी) के आधार पर कोशिकाओं / घटनाओं और पक्ष तितर बितर (एसएससी); और फिर गेट रहते हैं और CD45 + कोशिकाओं। वायुकोशीय बृहतभक्षककोशिका पहचान के लिए, गेट CD11b नकारात्मक और फिर CD11c + F4 / 80 + कोशिकाओं। (चित्रा 5 ए)।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

स्तन वसा पैड में 4T1-GFP ट्यूमर कोशिकाओं के इंजेक्शन, माउस ट्यूमर (चित्रा 1 ए) कि मानव स्तन कैंसर की पुनरावृत्ति metastatic प्रसार के गठन की ओर जाता है के रूप में तेजी से मेटास्टेसिस फेफड़ों (चित्रा 2), जिगर, हड्डियों में बनते हैं और चूहों 11 के दिमाग। GFP के साथ 4T1 कोशिकाओं के स्थिर अभिकर्मक ट्यूमर के विकास की निगरानी की सुविधा (चित्रा 1 बी), metastasizing ट्यूमर कोशिकाओं पर नज़र रखने और मेटास्टेटिक बोझ (चित्रा 2 बी, 3 बी) बढ़ाता। इसके अलावा, ट्यूमर की इमेजिंग इस तरह के ट्यूमर कोशिका मृत्यु और ट्यूमर वाहिका रोग के रूप में कई सुविधाओं के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करता है। चमकीले हरे प्रतिदीप्ति (चित्रा 1 बी-मध्यम पैनल) उच्च GFP अभिव्यक्ति है, जो आम तौर पर व्यवहार्य ट्यूमर पैरेन्काइमा साथ जुड़ा हुआ है संकेत मिलता है। जबकि कुछ ट्यूमर क्षेत्रों में GFP की कमी ट्यूमर कोशिका मृत्यु का संकेत हो सकता है ( (चित्रा 1 बी-सही पैनल) से अनुपस्थित है।

चूंकि फेफड़ों मेटास्टेसिस के बहुमत के फेफड़ों की सतह पर स्थित हैं, वे नियमित रूप से विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जा सकता है। मेटास्टेटिक घावों आमतौर पर स्पष्ट रूप से आसपास के पैरेन्काइमा (2A चित्रा) से अलग कर रहे हैं। सकल टिप्पणियों को सत्यापित करने और मेटास्टेसिस कि फेफड़ों parenchyma के भीतर गहरे हैं का मूल्यांकन करने के लिए, फेफड़ों के फ्लोरोसेंट इमेजिंग प्रदर्शन किया जा सकता है (चित्रा 2 बी), GFP व्यक्त कोशिकाओं इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि फेफड़ों autofluorescence छवियों में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है, उज्ज्वल GFP प्रतिदीप्ति व्युत्पन्न फेफड़ों parenchyma आसपास से विशिष्ठ मेटास्टेसिस की सुविधा। वैकल्पिक रूप से, दिनचर्या ऊतक विज्ञान (चित्रा 3 ए और चित्रा -4 ए) डिजिटल पैथोलॉजी एल्गोरिदम के साथ संयोजन के रूप में (

बहुरंगा FACS multipole कोशिका की सतह और / या एक साथ cytoplasmic मार्कर के उपयोग के माध्यम से भी दुर्लभ सेल आबादी को चिह्नित करने का अवसर प्रदान करता है। वायुकोशीय मैक्रोफेज CD11b अभिव्यक्ति और F4 / 80 की अभिव्यक्ति और CD11c (चित्रा 5) की कमी की विशेषता है। विशिष्ट दृष्टिकोण इन कोशिकाओं की पहचान करने से फ्लो शामिल द्वारा: (i) आगे और पक्ष बिखराव गुण द्वारा दर्शाया आकृति विज्ञान के आधार पर सेल की आबादी का चयन, (ii) व्यवहार्य CD45 + द्वारा (iii) CD11b नकारात्मक कोशिकाओं के gating का पालन कक्षों के चयन, और (iv) F4 / 80 और CD11c coexpressing कोशिकाओं के gating (चित्रा 5 ए, बी)।

आकृति 1
चित्रा 1. निगरानी ट्यूमर के विकास को टीhrough पशु इमेजिंग। (ए) माउस GFP ट्यूमर सेल इंजेक्शन के बाद अलग अलग समय बिंदुओं पर स्तन वसा पैड में कोशिकाओं को व्यक्त करने के साथ इंजेक्शन के व्हाइट प्रकाश छवियों। (बी) फ्लोरोसेंट छवियों GFP फिल्टर के उपयोग के माध्यम से प्राप्त की इसी। धराशायी लाइनों ट्यूमर क्षेत्र निशान। 26 दिन पर कुछ ट्यूमर क्षेत्रों है कि ऊतक परिगलन या विकासशील neovasculature से हो सकता है में चमकीले हरे रंग की रोशनी की कमी पर ध्यान दें। स्केल बार, 10 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. फेफड़े का मूल्यांकन Metastatic बोझ। (ए) सतह मेटास्टेसिस (तीर) के साथ स्तन वसा पैड में 4T1 कोशिकाओं के इंजेक्शन के साथ चूहों के फेफड़ों की छवियाँ।(बी) + GFP फेफड़ों मेटास्टेसिस (चमकीले हरे रंग की रोशनी) की छवियाँ इमेजिंग माइक्रोस्कोप के उपयोग के माध्यम से प्राप्त की। स्केल बार, 10 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. डिजिटल हिस्तोपैथोलोजी और confocal माइक्रोस्कोपी फेफड़ों metastases की इमेजिंग में। (ए) स्तन वसा पैड में 4T1 कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन चूहों से hematoxylin और eosin (एच एंड ई) दाग फेफड़ों खंड के स्कैन (गहरे नीले रंग की ऊतक मेटास्टेसिस)। स्केल बार, 4 मिमी। (बी) + GFP फेफड़ों मेटास्टेसिस के Confocal माइक्रोस्कोपी (चमकीले हरे रंग की रोशनी)। स्केल पट्टी, 200 माइक्रोन। एक बड़ा versio देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा के एन।

चित्रा 4
चित्रा 4. डिजिटल हिस्तोपैथोलोजी द्वारा फेफड़ों Metastatic बोझ की मात्रा। (ए) hematoxylin और eosin (एच एंड ई) दाग फेफड़ों के खंड (गहरे नीले रंग की ऊतक मेटास्टेसिस) का स्कैन। (बी) (ए) में दिखाए गए फेफड़ों की छवि द्वारा उत्पन्न एक trainable histomorphology छवि विश्लेषण उपकरण (सॉफ्टवेयर "जिन्न")। लाल रंग मेटास्टेसिस के रूप में "जिन्न" द्वारा की पहचान फेफड़ों क्षेत्रों इंगित करता है। स्केल पट्टी, 5 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. फ्लो का अनुप्रयोगफेफड़ों में वायुकोशीय मैक्रोफेज की पहचान के लिए roaches। (ए) representativeflow gating रणनीति plotsillustrating CD45 + CD11b नकारात्मक F4 / 80 + CD11c + वायुकोशीय मैक्रोफेज की पहचान करने के cytometrydot। (बी) के प्रतिनिधि से फ्लो नियंत्रण या फेफड़ों वायुकोशीय मैक्रोफेज पर clodronate liposomes की plotsillustrating प्रभाव डॉट। भूखंडों में नंबर gated कोशिकाओं के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Acknowledgments

इस शोध के रक्षा विभाग द्वारा समर्थित किया गया है दृश्य और की राय, और लेखक (ओं) द्वारा विज्ञापन एम एम एम के लिए अमेरिकी सेना या रक्षा विभाग के उन लोगों को प्रतिबिंबित नहीं करते एम.के. और ईसा पूर्व 111,038 को टीएसए 140,010 अनुदान।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4T1 cell line  American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA CRL 2539 Tumor cells
4T1-GFP cell line Caliper life sciences/ Perkin Elmer, Waltham, MA, USA BW128090 Tumor cells
RPMI Corning, Corning, NY, USA 10-040-CM Media
Heat inactivated FBS Gibco (Thermo Scientific), USA 10082147 Media
Penicillin Streptomycin Fisher Scientific, Waltham, MA, USA MT-300-02-CI Media
PBS Fisher Scientific, Waltham, MA, USA BP399-20 Dilute with distilled water
Trypsin 0.25% with EDTA Hyclone, Logan, Utah, USA SH30042.02 Tissue culture supplies
T75 cm2 flask Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 12-565-32 Tissue culture supplies
15 ml conical tube BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA 352096 Tissue culture supplies
50 ml conical tube BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA 352098 Tissue culture supplies
60 mm2 Petri dish Fisher Scientific, Waltham, MA, USA AS4052 For lung imaging 
Isoflurane (Isothesia) Butler Schein Animal health, Dublin, OH, USA NDC 11695-6776-2 Mouse anesthesia
Clodronate liposomes Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA F70101C-N Macrophages depletion
Control liposomes Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA F70101-N Control PBS-liposomes
29 gauge insulin syringes (12.7 mm and 0.5 ml capacity)- Reli-On Walmart, Bentonville, AR, USA For tumor cell injection
Hair removal cream (Nair) Walmart, Bentonville, AR, USA
Paraformaldehyde solution (4%) Affymetrix, Santa Clara, CA, USA 19943-I Lt Dilute to 4% or 1% using 1x PBS
OCT compound Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 230-730-571 For freezing tissue in cryomolds
Fluoro-Gel-II with DAPI Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 17985-51 Mounting medium
Sucrose Sigma, St. Louis, MO, USA S-9378 Cryopreservation
Collagenase P Roche, Basel, Switzerland 11249002001 Components of tissue digestion buffer
Dnase I Roche, Basel, Switzerland 10104159001 Components of tissue digestion buffer
Trypsin inhibitor Sigma, St. Louis, MO, USA T9253 Components of tissue digestion buffer
40 micron cell strainers Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 22-363-547 Used in tissue digestion to remove clumps
Trustain FcX-Fc Block (CD16/CD32) Biolegend, San Diego, CA, USA 101320 Antibodies for flow cytometry
BV605 CD45 Biolegend, San Diego, CA, USA 103139 Antibodies for flow cytometry
PE CD11b Biolegend, San Diego, CA, USA 101207 Antibodies for flow cytometry
PE Cy7 F4/80  Biolegend, San Diego, CA, USA 123113 Antibodies for flow cytometry
APC/Cy7 CD11c Biolegend, San Diego, CA, USA 117323 Antibodies for flow cytometry
PerCPcy5.5 IA/IE (MHCII)  Biolegend, San Diego, CA, USA 107625 Antibodies for flow cytometry
PE CD80 Biolegend, San Diego, CA, USA 104707 Antibodies for flow cytometry
AF647 CD86 Biolegend, San Diego, CA, USA 105019 Antibodies for flow cytometry
Fixable viability Dye eflour 506 eBioscience, San Diego, CA,USA 65-0866 Antibodies for flow cytometry
Cryostat Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA CM1850 Cryosectioning
UVP iBox Explorer UVP Inc, Upland, CA, USA Mouse and lung fluorescent imaging
Aperio Scanscope CS Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA Digital pathology
BD LSRFortessa  BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA Flow cytometry/data acquisition
Nikon A1 confocal TE2000 microscope Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A. Imaging and quantifying GFP fluorescence in lung cryosections
UVP visionworks software (Version 7.1RC3.38) UVP Inc, Upland, CA, USA Imaging software for iBOX
Aperio Imagescope software (v12.1.0.5029)  Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA Imaging software for analysis of digital slides
Flow JO software (version 9.8.1) Flow JO LLC, Ashland, OR, USA Analysis of flow cytometric data
NIS Elements AR (version 4.20.01) 64 Bit Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A. Acquisition and analysis of lung cryosections for GFP 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sceneay, J., Smyth, M. J., Moller, A. The pre-metastatic niche: finding common ground. Cancer Metastasis Rev. , (2013).
  2. Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nat Rev Cancer. 3, 453-458 (2003).
  3. Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438, 820-827 (2005).
  4. Hiratsuka, S., et al. MMP9 induction by vascular endothelial growth factor receptor-1 is involved in lung-specific metastasis. Cancer Cell. 2, 289-300 (2002).
  5. Hiratsuka, S., et al. The S100A8-serum amyloid A3-TLR4 paracrine cascade establishes a pre-metastatic phase. Nat Cell Biol. 10, 1349-1355 (2008).
  6. Yan, H. H., et al. Gr-1+CD11b+ myeloid cells tip the balance of immune protection to tumor promotion in the premetastatic lung. Cancer Res. 70, 6139-6149 (2010).
  7. Gao, D., et al. Myeloid progenitor cells in the premetastatic lung promote metastases by inducing mesenchymal to epithelial transition. Cancer Res. 72, 1384-1394 (2012).
  8. Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nat Immunol. 14, 986-995 (2013).
  9. Holt, P. G., Strickland, D. H., Wikstrom, M. E., Jahnsen, F. L. Regulation of immunological homeostasis in the respiratory tract. Nat Rev Immunol. 8, 142-152 (2008).
  10. Sharma, S. K., et al. Pulmonary alveolar macrophages contribute to the premetastatic niche by suppressing antitumor T cell responses in the lungs. J. Immunol. 194, 5529-5538 (2015).
  11. Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S., et al. Mouse 4T1 breast tumor model. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , Chapter 20, Unit 20 22 (2001).
  12. Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127, 679-695 (2006).
  13. Buiting, A. M., Van Rooijen, N. Liposome mediated depletion of macrophages: an approach for fundamental studies. J. Drug Target. 2, 357-362 (1994).
  14. Vadrevu, S. K., et al. Complement c5a receptor facilitates cancer metastasis by altering T-cell responses in the metastatic niche. Cancer Res. 74, 3454-3465 (2014).
  15. Walrath, J. C., Hawes, J. J., Van Dyke, T., Reilly, K. M. Genetically engineered mouse models in cancer research. Adv. Cancer Res. 106, 113-164 (2010).
  16. Bosiljcic, M., et al. Myeloid suppressor cells regulate the lung environment--letter. Cancer Res. 71, author reply 5052-5053 5050-5051 (2011).
  17. Yan, H. H., et al. Myeloid Suppressor Cells Regulate the Lung Environment-Response. Cancer Res. 71, 5052-5053 (2011).
  18. Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).

Tags

चिकित्सा अंक 112 Premetastatic आला वायुकोशीय मैक्रोफेज फेफड़ों मेटास्टेसिस clodronate liposomes स्तन कैंसर के मॉडल कैंसर जीव विज्ञान
स्तन कैंसर मेटास्टेसिस में वायुकोशीय मैक्रोफेज की भूमिका का अध्ययन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vadrevu, S. K., Sharma, S.,… More

Vadrevu, S. K., Sharma, S., Chintala, N., Patel, J., Karbowniczek, M., Markiewski, M. Studying the Role of Alveolar Macrophages in Breast Cancer Metastasis. J. Vis. Exp. (112), e54306, doi:10.3791/54306 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter